DNA序列分析

序列测定的技术
经典方法:
Sanger双脱氧链终止法(Sanger,1977) Maxam-Gilbert DNA化学降解法(Maxam &Gilbert,1977)
新技术方法:
➢ 杂交测序法 ➢ 质谱法 ➢ 单分子测序法 ➢ 原子探针显微镜测序法 ➢DNA 芯片法
第一节 Maxam-Gilbert化学降解法
第三代基因组测序技术实现单分子速读
据《自然》杂志网站2月8日报道，在美国佛 罗里达州马可岛召开的“基因组生物学与技 术进展大会”上，来自加利福尼亚门洛帕克 市的太平洋生物科技公司(Pacific Biosciences)介绍了其研制的第三代基因组测 序仪，该测序仪实现了一次标记一个分子式 的单分子速读。
G反应：DMS使G在中性和高温条件下脱 落。
G+A反应：酸性条件（如甲酸）可使A和 G嘌呤环上的N原子质子化，利用哌啶使 A、G脱落。
T+C反应：肼（低盐） C反应：肼（高盐）
测定DNA长度~250bp。
化学裂解法测定DNA的核苷酸序列
第二节 Sanger链终止法
1977年Sanger设计了一种通过DNA复制来识别4种碱基的方 法，进行DNA序列测定，即双脱氧链终止法。
第二代自动测序技术 尽管第一代测序技术已经帮助人们完成了从噬菌体
基因组到人类基因组草图等大量的测序工作，但由 于其存在成本高、速度慢等方面的不足，并不是最 理想的测序方法。经过不断的开发和测试，进入21 世纪后，以Roche公司的454技术、Illumina公司的 Solexa技术和ABI公司的SOLiD技术为标志的第二 代测序技术诞生了。 与第一代技术相比，第二代测序技术不仅保持了高 准确度，而且大大降低了测序成本并极大地提高了 测序速度。使用第一代Sanger的测序技术完成的人 类基因组计划，花费了30亿美元巨资，用了三年的 时间；然而，使用第二代SOLiD的测序技术，完成 一个人的基因组测序现在只需要一周左右的时间。 由于第二代测序技术产生的测序结果长度较短，因 此比较适合于对已知序列的基因组进行重新测序， 而在对全新的基因组进行测序时还需要结合第一代 测序技术。
DNA序列的正确测定，是进行基因结构和功能分析， 绘制基因图谱、转基因检测等方面工作的重要前提。 同时DNA测序技术为快速、简捷分析蛋白序列及结 构提供了工具。
DNA测序的发展： 1953年，Watson和Crick推导出DNA双螺旋
结构；
1954年，Whitfeld发明化学降解测序法； 1972年，Berg开发DNA重组技术； 1975年，Sanger发明加减测序法； 1977年，Sanger发明双脱氧测序法； 1986年，第一台半自动测序仪出现； 2000年，Drosophila全基因组测序完成。
DNA序列测定分手工测序和自动测序，手工 测序包括sanger双脱氧链终止法和maxamgilbert化学降解法。20实际80年代中期，测
序仪出现。发展至今，自动化测序已成为当 今DNA序列分析的主流。美国pe abi公司已 生产出373型、377型、310型、3700和3100 型等DNA测序仪，其中310型是临床检测实 验室中使用最多的一种型号。
此后， 在S a n g e r 法的基础上，80年代中期出现了以荧光 标记代替放射性同位素标记、以荧光信号接收器和计算机信 号分析系统代替放射性自显影的自动测序仪。另外，90年代 中期出现的毛细管电泳技术使得测序的通量大为提高。除此 之外，这一时期还出现了一些其他的测序方法，如焦磷酸测 序法（pyrosequencing）、连接酶测序法（sequencing byligation, SBL）、杂交测序法（sequencing by hybridization, SBH）等。
碱基特异性化学切割反应： 硫酸二甲酯（DMS ）：使DNA分子中鸟
嘌呤（G）上的N7原子甲基化。 肼：使DNA分子中胸腺嘧啶百度文库T）和胞嘧
啶（C）的嘧啶环断裂；但高盐条件下， 只C断裂，而不与T反应。 哌啶：从修饰甲基处断裂核苷酸链。
在不同的酸、碱、高盐和低盐条件下， 三种化学试剂按不同组合可以特异地切 割核苷酸序列中特定的碱基。
第九章 DNA序列分析
第一节 Maxam-Gilbert化学降解法 第二节 Sanger链终止法 第三节 DNA片段序列测定的策略 第四节 核苷酸序列的生物信息分析
DNA测序（DNA sequencing，或译DNA定序）是 指分析特定DNA片段的碱基序列，也就是腺嘌呤 （A）、胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）与鸟嘌呤的 （G）排列方式。确定DNA双股链上每一个独立结 构单元或碱基的确切顺序。
最早的测序技术
测序技术最早可以追溯到20世纪50年代，早在1954年就已 经出现了关于早期测序技术的报导，即Whitfeld等用化学降 解的方法测定多聚核糖核苷酸序列。
第一代测序技术诞生
1 9 7 7年S a n g e r等发明的双脱氧核苷酸末端终止法和 Gilbert等发明的化学降解法，标志着第一代测序技术的诞生。
Sanger法获得诺贝尔化学奖。
一、Sanger双脱氧链终止法原理
在模板指导下，DNA聚合酶不断将dNTP加到引物的3’-OH末端， 使引物延长，合成出新的互补的DNA链，如果加入双脱氧三 磷酸核苷(ddNTP)，由于双脱氧核糖的3’位置上缺少一个羟 基，故不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键，即形成一种全部 具有相同5’-引物端和以ddNMP残基为3’端结尾的一系列长 短不一片段的混合物。由于双脱氧核苷酸在每个DNA分子中 掺入的位置不同，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳区分长度差一个
化学降解法：人们用专一 性作用于A、T、G、C碱基的化 学药剂分别处理经内切酶切割 而成的一定长度DNA片段，通 过控制反应时间，既可获得分 别以A、T、G、C为结尾的四组 由所有可能长度核苷酸片段组 成的DNA片段群。
除了要研究与DNA的高级 结构、DNA-蛋白质结构相关性 采用化学降解法外，对于单纯 以测序为目的的实验，普遍采 用后面所讲的酶促合成法。