基因组学问答题

第一代测序
利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。

直到掺入一种链终止核苷酸为止。

每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。

由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。

终止点由反应中相应的双脱氧而定。

每一种dNTPs
和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。

它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。

第二代测序
焦磷酸测序技术（第二代测序技术）是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应。

是一种边合成边测序的方法。

原理是：引物与模板DNA退火后，在dna聚合酶、ATP硫酸化酶.荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶4种酶的协同作用下，将引物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号的释放偶联起来，通过检测荧光的释放和强度，达到实时测定DNA序列的目的。

焦磷酸测序技术的反应体系由反应底物、待测单链、测序引物和4种酶构成。

反应底物为5’-磷酰硫酸、荧光素.
CRISPR/CAS的原理
CRISPR/CAS9是最新出现的一种由RNA指导CAS核酸酶对靶向基因进行特定DNA 修饰的技术。

CRISPR是细菌和古细菌为应对病毒和质粒不断攻击而演化来的获得性免疫防御机制。

在这一系统中，crRNA（CRISPR-drived RNA）通过碱基配对与tracrRNA/crRNA二元复合体指导核酸酶CAS9蛋白在与crRNA配对的序列靶定位点剪切双链DNA达到对基因组DNA进行修饰的目的。

第三代测序：
单分子测序仪基于边合成边测序的思想，将待测序列随机打断成小片段并在3'末端加上Poly(A)，用末端转移酶在接头末端加上Cy3荧光标记。

用小片段与表面带有寡聚Poly(T)的平板杂交。

然后，加入DNA聚合酶和Cy5荧光标记的dNTP 进行DNA合成反应，每一轮反应加一种dNTP。

将未参与合成的dNTP和DNA聚合酶洗脱，检测上一步记录的杂交位置上是否有荧光信号，如果有则说明该位置上结合了所加入的这种dNTP。

用化学试剂去掉荧光标记，以便进行下一轮反应。

经过不断地重复合成、洗脱、成像、淬灭过程完成测序。

流感嗜血杆菌基因组测序与序列组装：
流感嗜血杆菌基因组的测序是在没有任何遗传图和物理图的情况下进行的，采用的是鸟枪法测序。

步骤：1、采用超声波将纯化的基因组DNA随即打断成长度为2.0kb左右的片段，然后经琼脂糖凝胶电泳分离，将手机的1.6-2.0kb的DNA区段纯化后连接到质粒克隆载体中。

2、从构建的质粒文库中随机选取克隆片段进
行两端测序，给出的可读序列相当于流感嗜血杆菌基因组总长的6倍。

3、组装这些序列共获得140个覆盖全基因组范围的独立的序列重叠群，各重叠群之间有带甜的序列间隙和物理间隙。

4、根据间隙两侧序列作为探针筛选已有的基因组文库，挑选阳性克隆解决留下的间隙。

5、再利用其他的载体或宿主菌重新构件基因组文库，再以间隙两侧的序列为探针或设计相应的PCR引物两两配组从新的文库中筛选阳性克隆。

新基因的产生方式：
1、基因加倍之后的趋异，这类基因基本保持原有的基因功能，但往往获得了新
的表达模式，这是新基因产生的主要方式。

2、外显子或结构域洗牌，即不同的结构域加倍或重组，产生具有创新功能的基因。

3、逆转录及其随后的趋异或重排。

4、外源基因水平转移。

5、基因裂变和融合，由一个基因分裂成两个不同的基因，或两个或多个基因融合组成一个新的基因。

6、非编码序列转变为编码序列。

甲基化与表观遗传：DNA分子的化学修饰主要是甲基化。

DNA的甲基化有两种类型：都涉及将S-腺苷甲硫氨酸的甲基基团转移到DNA的碱基结构中，被修饰的碱基是A/C。

真核生物的胞嘧啶甲基转移酶必须到细胞核的指定位置，而且还必须在复制场与其他蛋白结合，以便在DNA合成后立即将新链甲基化。

DNA甲基化与基因表达在两种水平控制基因的活性，即局部范围影响单个启动子与增强子的功能及在大范围如中条染色体及基因组水平影响许多基因的表达。

DNA甲基化主要通过影响染色质的结构阻止转录因子与启动子或增强子的结合控制基因表达。

染色质重建与表观遗传：核小体是染色质的基本结构单位，其核心八聚体与DNA结合可组织转录因子的接触。

体外实验表明：核小体的重建对DNA序列并无特别要求，或者说核小体形成独立于DNA序列，但这并不表明细胞内特定的DNA序列与核小体的结合是完全随机的。

有两种模型来描述核小体的定位方式：平移定位、旋转定位。

平移定位使缠绕核小体的序列改变位置，从而使核小体间链接的序列发生位移，但不改变DNA序列原有的朝向。

旋转定位会使原有的序列朝向发生变化。

平移定位和旋转定位两者均影响蛋白质与DNA的接触，在基因的表达调控中有重要作用。

最突出的例子是启动子区核小体的特别安置，平移定位使核小体排除在某些序列之外，启动因子为了启动基因表达，必须附着到DNA双螺旋的表面，核小体的定位方式在基因表达的微调控方面也扮演了重要角色，通过不断调控聚合酶的接触来控制转录速率。