发光二极管诱导荧光用于毛细管电泳检测
毛细管电泳-激光诱导荧光检测法分离检测谷胱甘肽及其构成氨基酸
毛 细 管 电泳 。 激 光 诱 导 荧 光 检 测 法分 离检 测 谷 胱 甘 肽 及 其 构 成 氨 基 酸
王 宇飞 ， 蔡元丽 ， 林 夏 ， 晏 瑾 ， 李 晖 。
（ 四川大学化学工程学院， 四川 成都 ６ １ ０ ０ ６ ５ ）
摘要 ： 以４ － 氯－ ７ 一 硝基苯并＿ ２ － 氧杂． １ ， ３ － 二唑 （ Ｎ Ｂ Ｄ ・ Ｃ １ ） 为柱前衍 生试剂 ， 建立 了一种毛细 管 电泳． 激光 诱导荧光 直接检测氧化型 和还 原型谷胱 甘肽及其构 成氨基酸 （ 谷 氨酸 、 半胱 氨酸和甘 氨酸 ） 的新方 法。经过 实验条件 的优化 ， 采用 ２ ５ ｍ ｍｏ ｌ ／ Ｌ硼砂－ ２ ０ ｍ ｍ ｏ ｌ ／ Ｌ聚氧 乙烯 月桂醚 （ Ｂ 川－ ３ ５ ） － ５ ％乙腈 （ ｐ Ｈ ９ ． ５ ） 的缓 冲体系 ， 在柱温 为 ２ ５。 ｃ 、 分 离 电压为 ２ ０ ｋ Ｖ的条件下 ， 压力进样 ３ ４ ４ ７ ． ５ Ｐ ａ （ ０ ． ５ ｐ ｓ ｉ ） ×３ Ｓ ， 五种 物质在 １ １ ｍ ｉ ｎ内实 现高效基线分 离 。在该方法下 ， 还原型谷胱甘肽 、 氧化 型谷 胱甘肽 、 谷氨 酸、 半胱 氨 酸和甘 氨酸 的线 性范 围分 别 为 ： １—５ Ｏ
ｏ ｆ ｏ ｘ ｉ ｄ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ａ ｎ ｄ ｒ ｅ ｄ ｕ ｃ ｅ ｄ ｇ ｌ ｕ ｔ ａ ｔ ｈ ｉ ｏ ｎ ｅ， ｇ ｌ ｕ ｔ ａ ｍｉ ｃ ａ ｃ ｉ ｄ， ｃ ｙ ｓ ｔ ｅ ｉ ｎ ｅ ｎｄ ａ ｇ ｌ ｙ ｃ ｉ ｎ ｅ ａ ｆ ｔ ｅ ｒ ｄ ｅ ｒ ｉ ｖ ａ ｔ ｉ ｚ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｗｉ ｔ ｈ ４ － ｃ ｈ ｌ ｏ ｅ－ ｒ ７ － ｎ ｉ ｔ ｅｂ ｒ ｅ ｎ ｚ ｏ ｆ ｕ ｒ ａ ｚ ａ ｎ
毛细管电泳法
在毛细管中施加电场，带电粒子在电场的作用下产生迁移，由于迁移速度与粒 子所带电荷、半径、质量等因素有关，因此不同粒子在电场中产生不同的迁移 速度，从而实现分离。
发展历程
01
02
03
1980年代初期
毛细管电泳法由 Jorgenson和Lukacs首次 提出并实验验证。
1980年代中期
该技术逐渐成熟，被广泛 应用于生物、医药、环境 等领域。
饮用水安全
毛细管电泳法能够检测饮用水中 的消毒副产物、有机污染物等， 保障饮用水安全。
在食品检测领域的应用
食品添加剂分析
毛细管电泳法能够分离和检测食品中 的添加剂，如色素、防腐剂等，有助 于食品安全监管。
营养成分分析
毛细管电泳法能够快速分析食品中的 营养成分，如氨基酸、维生素等，有 助于食品质量控制和营养评价。
核酸分析
毛细管电泳法能够分离和检测核酸片段，用于基 因诊断、基因表达研究和法医学鉴定。
3
临床检验
毛细管电泳法可用于检测体液中的小分子代谢物， 如氨基酸、糖类等，辅助临床诊断。
在环境监测领域的应用
污染物分析
毛细管电泳法能够分离和检测水 体、土壤中的有害物质，如重金 属、农药残留等，有助于环境监 测和污染治理。
在化学分析领域的应用
有机物分析
毛细管电泳法能够分离和检测有机化合物，如药物、染料等 ，在药物研发、化工生产等领域有广泛应用。
金属离子分析
毛细管电泳法能够高灵敏度地检测金属离子，如铅、汞、镉 等，可用于地质、冶金和环境等领域的研究。
谢谢
THANKS
加样
将处理好的样品加入毛 细管中，注意控制加样
量。
施加电压
启动电源，施加适当的 电压，使带电粒子在电
激光诱导荧光检测器系统的构建1
第一章
生命科学的迅速发展对分析仪器的检测灵敏度提出了更高的要求，对生命现象的研究必须深入到单细胞或单分子水平。通过对单分子光谱性质的测量，可以实现对化学反应的途径进行实时监测，特别是对生物大分子进行探测，以提供分子结构与功能之间的信息。单分子检测（single molecules detection，SMD）是分析化学家长期以来一直梦寐以求的一项富有挑战性的前沿领域，达到了分子检测灵敏度的极限，是超低含量物质检测技术的最后一个里程碑。
第三章在剖析激光诱导荧光检测器各组成光学元件功能的基础上，确定了所研制LIFD的光学元件，包括MBL-Ⅱ蓝光激光器、DM490二色镜、GCO-2112聚光及荧光采集物镜、LP 510长通滤光片及BP 525带通滤光片、GCL-0106622双胶合消色差透镜、CR131光电倍增管。
第四章针对普通检测池只能采集所发射单侧球面荧光信号，而另半球面荧光信号未被采集的缺点，设计了反射式Z-型检测池，使与采集光路反方向的荧光信号经反射镜反射而进入到荧光采集系统，从而提高了荧光信号的采集效率，进而使LIFD的检测灵敏度大幅提高。
关键词：激光诱导荧光检测器，高效液相色谱，共聚焦光学，二极管激光器，Z-型反射式检测池
Laser-induced fluorescencedetector (LIFD)is one of the most sensitive detection modes in chemical andbiologicalseparations. In addition, it is well-suitedfordetection in small volumes, and is widely usedinhigh performance liquid chromatography (HPLC), micro-column liquid chromatography (Micro-LC), capillary electrophoresis (CE)and other separations. The key to achieve the best sensitivity is the ability to maximize signal while minimizebackground sources.In this study, solid-state diode laser was used as the excitation source, and confocal optical configuration was applied. Furthermore, a reflective mirror was installed in the flow cell, which could reflect the deviated fluorescent signal to the optical collection system, so as to improve the collection efficiency of fluorescent signal. Meanwhile, a long pass filter coupled with a band pass filter was applied to minimizebackground sources. Finally, a LIFD detection system suitable for HPLC was established. The main researches and conclusions are as follows.
荧光检测毛细管电泳法
通过荧光检测毛细管电泳法快速灵敏地检测人体血浆中的亚硝酸盐的方法本文选自塔兰塔(Talanta)，爱思唯尔(Elsevier)出版，纯分析化学期刊。
作者：安范舒普代尔，来自比利时鲁汶大学。
摘要:分析亚硝酸盐,NO指示剂在体内的产生,为研究NO在体内的合成提供了一个有用的工具。
通过其衍生反应和2、3二氨基萘(DAN)中一个快速、灵敏荧光-毛细管电泳法被发展来测定了人体血浆中的亚硝酸盐。
亚硝酸盐在人体血浆中很容易与DAN在酸性条件下反应得到收益率很高的荧光2,3-萘酚三唑(NAT)。
荧光检测是完成施达赛检测的最佳化方式，它允许一种等离子体样品的直接分析而不像大多数堆积样品的CE-UV方法。
乙腈可去除蛋白质。
短程注射和高压电(30千伏)可缩短分析时间。
用20mm,pH值为9.23的缓冲溶液可更好的分离。
NAT的分离在1.4分钟内完成，除蛋白等离子体样品以5s每50 mbar水动力地的速度被注射到60厘米×75微米的内部直径无涂层的玻璃毛细管里。
激发波长被选中为一个宽带滤波器(240-400nm),发射光在418nm被测量通过采用一个截止过滤器。
在2到500nm的范围内获得一个好的线性关系(R2=0.9975)。
在原始血浆样本中亚硝酸盐的检测极限是0.6nm, 比我们此前的CE-UV法低了750倍。
先进的荧光-毛细管电泳法相对于目前的荧光高效液相色谱法，具有更简单的系统和更低的成本优势，同时也很灵敏。
这个研究表明该方法测定人体血浆中亚硝酸盐在的浓度与频繁报道的一致。
1介绍研究表明，亚硝酸盐在生理和病理条件下有可能成为NO合成的一个标志，因此在实验和临床研究中可能作为一个生化参数。
但是到目前为止，还没有真正关于人体血浆中亚硝酸盐的浓度的共识。
具报告，一般水平的亚硝酸盐在人体血浆中“不能检测”的范围达到26微米。
人体血浆中亚硝酸盐的浓度最合理的范围是从100纳米到1微米，通过大多数研究者团体的测量最常报道的结果是从100纳米到200纳米。
毛细管电泳法
此外，还有一类基于芯片的二维分离系统主要应用于蛋白质酶解物的分离分析。
除上述分离模式外，芯片自由流电泳也是芯片电泳分离蛋白质的重要方法。芯片自由流电泳是指在芯片中通 过外加电场使样品随缓冲液连续流动的同时沿电场方向进行电迁移，从而按照电泳淌度不同实现分离的电泳分离 模式。Raymond等采用芯片自由流电泳模式分离了人血清蛋白、缓激肽和核糖核酸酶A，其分离长度为3.1 cm，流 出时间为62 S。Kobayashi等采用自由流电泳的分离模式在一个体积为56.5 mm×35 mm×30 mm的微分离室 (60uL)中实现了持续的蛋白质分离，并用羟丙基甲基纤维素涂覆来抑制蛋白质吸附，在25 min内有效分离了细胞 色素C和肌红蛋白。最近，Kohl．heyer等H 3。制作了一种自由流等电聚焦分离蛋白质的玻璃芯片，成功地将人 血清白蛋白(pI=4.4)与等电聚焦标记物(pH 3和9)分离。
仪器要求
所用的仪器为毛细管电泳仪。正文中凡采用毛细管电泳法测定的品种，其所规定的测定参数，除分析模式、 检测方法(如紫外光吸收或荧光检测器的波长、电化学检测器的外加电位等)应按照该品种项下的规定外，其他参 数如毛细管内径、长度、缓冲液的pH值、浓度、改性剂添加量、运行电压或电流的大小、运行的时间长短、毛细 管的温度等，均可参考该品种项下规定的数据，根据所用仪器的条件和预试验的结果，进行必要的调整。
检测方法
毛细管电泳通常用到的检测方法有吸收光谱，荧光光谱，热镜，拉曼光谱，质谱和电化学方法。
毛细管电泳-质谱联用技术及其在药物和生物分析中的应用
毛细管电泳-质谱联用技术及其在药物和生物分析中的应用周韦;刘易昆;陈子林【摘要】毛细管电泳-质谱(CE-MS)联用技术是在液相色谱-质谱联用技术基础上发展起来的一项新型分析技术,它结合了毛细管电泳具有的分离效率高、分离速度快、样品消耗量少以及质谱检测具有的高灵敏度和强结构解析能力等优点,现已成为倍受分析化学工作者关注的新型微量分析技术.目前,CE-MS联用技术是中药有效成分分析,体内药物分析以及生物样品,如氨基酸、多肽、蛋白质和多糖等分析的重要手段.本文对CE-MS联用技术中同轴鞘流及无鞘流纳流电喷雾等几种接口装置的研究进展,CE-MS技术在中药活性成分分析及多级质谱结构解析以及氨基酸、多肽及蛋白质等生物样品分析中的应用研究进行了综述,并对该技术的发展进行了展望.%Capillary electrophoresis-mass spectrometry (CE-MS), developed on the basis of liquid chromatography-mass spectrometry, is a new hyphenated technique that combines the advantages like high separation efficiency, short analytical time, low sample consumption in CE and the high sensitivity, powerful molecular structure elucidation in MS.It has been paid great attention by analytical scientists and become a powerful tool for analysis of active components in Chinese medicine, in vivo drugs and bio-samples like amino acids, peptides, proteins and polysaccharides.In this paper, a brief review was given on recent advance in CE-MS and its applications, including advance in sheath-flow and sheathless nano-spray interfaces and applications in analysis of pharmaceutical and biological samples.The first part of this review summarizes the development of stable and efficient interfaces to improve the feasibility of CE-MStechnique.Several interfaces like coaxial sheath-flow, electrokinetic sheath-flow, liquid injection and sheathless interface with etching emitter have been reviewed.The second part introduces the application of CE-MS in the past few years.The applications are categorized according to the types of analytes, including the analysis for active components in Chinese medicines, in vivo drugs, amino acids, peptides, proteins and carbohydrates.Coatings for capillary inner wall, online processing strategies, sample preparation methods and other experiment methods have been discussed in each category.In the last part of this review, a perspective of this technique has been discussed.【期刊名称】《质谱学报》【年(卷),期】2017(038)004【总页数】13页(P362-374)【关键词】毛细管电泳-质谱(CE-MS);电喷雾离子化接口装置;药物分析;生物分析;综述【作者】周韦;刘易昆;陈子林【作者单位】武汉大学药学院,湖北武汉 430071;武汉大学药学院,湖北武汉430071;武汉大学药学院,湖北武汉 430071【正文语种】中文【中图分类】O657.63毛细管电泳(CE)具有分离速度快、样品消耗量少、分离效率高等特点。
毛细管电泳的基本原理及应用
毛细管电泳的基本原理及应用————————————————————————————————作者：————————————————————————————————日期：毛细管电泳的基本原理及应用摘要：毛细管电泳法是以弹性石英毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力，依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的电泳分离分析方法。
该技术可分析的成分小至有机离子、大至生物大分子如蛋白质、核酸等。
可用于分析多种体液样本如血清或血浆、尿、脑脊液及唾液等，比HPLC 分析高效、快速、微量。
关键词：毛细管电泳原理分离模式应用1概述毛细管电泳(Caillary Electrophoresis)简称CE，是一类以毛细管为分离通道，以高压直流场为驱动力的新型液相分离分析技术。
CE的历史可以追溯到1967年瑞典Hjerten最先提出在直径为3mm的毛细管中做自由溶液的区带电泳(Capillary Zone Electro-phoresis，CZE)。
但他没有完全克服传统电泳的弊端[1]。
现在所说的毛细管电泳(CE)是由Jorgenson和Lukacs在1981年首先提出，他们使用了75mm的毛细管柱，用荧光检测器对多种组分实现了分离。
1984年Terabe将胶束引入毛细管电泳，开创了毛细管电泳的重要分支: 胶束电动毛细管色谱(MEKC)。
1987年Hjerten等把传统的等电聚焦过程转移到毛细管内进行。
同年，Cohen 发表了毛细管凝胶电泳的工作。
近年来，将液相色谱的固定相引入毛细管电泳中，又发展了电色谱，扩大了电泳的应用范围。
毛细管电泳和高效液相色谱（HPLC）一样，同是液相分离技术，因此在很大程度上HPCE与HPLC可以互为补充，但是无论从效率、速度、样品用量和成本来说，毛细管电泳都显示了一定的优势毛细管电泳（C E）除了比其它色谱分离分析方法具有效率更高、速度更快、样品和试剂耗量更少、应用面同样广泛等优点外，其仪器结构也比高效液相色谱（HPLC）简单。
用毛细管电泳联用检测技术分析环境污染物的研究进展
摘要 对毛细管电泳联用检测技术的研 究进展进行 了综述。
关键 词 毛细 管电 泳 ； 用检 测技 术 联
中图分类号 ’ ７８ Ｘ ０
文献标识码 Ａ 文章编号 ０ １—６ １２０ ）２ ０３ ８０ ５７ ６ １（０ ７０ —０４ — ５
Ａｄ ａ ｃ ｓ ｆ ｐ ｅ ａ ｅ ｅ ｈ ｉ ｕ ｕ ｌ ｏＣａ ｉａ ｙＥｌｃ ｒ ｐ ｏ ｅ ｉ ｆ ｒ ｔｃｉ ｎ ｖ ｎ ｅ ｏ Ｈｙ ｈ ｎ ｔ ｄ Ｔ ｃ ｎ ｑ ｅＣｏ ｐ ｅ ｔ ｐ ｌ ｒ ｅ ｔｏ ｈ ｒ ｓｓ ｏ ｅ ｔ ｄ ｌ Ｄｅ ｏ
Ａｂ ｔａ ｔ Ｉ ｅ ｅ ｔ ｅ ｒ， ｒ ａ ｐｏ ｒ ｓ ａ ｅ ｎ ｍａ ｅ ｏｅ ｈ ｎ ｅｔ ｅｄ ｔｃｉｎｓ ｎ ｉｖ ｔ ｏ ａ ｉ ａ ｌｃｒ ｐ ｏｅ ｉ ｎ ｌｓ ， ｎ ｈ ｃ ａ ｓｒ ｃ ｎｒ ｃ ｎ ａ ｓ ｇ ｅ ｔ ｒｇ ｅ ｓ ｓ ｅ ｄ ｎ ａ ｃ ｅｅ ｔ ｓｔ ｉ ｆ ｐｌ ｒ ｅｅ ｔ ｈ ｒｓｓ ａｙ ｉ ａ ｄｗ ｉｈｃ ｌ ｙ ｈ ｂ ｔ ｈ ｏ ｅ ｉ ｙ ｃ ｌｙ ｏ ａ ｓ ｌ
困难 ， 毛细管电泳具有 比较强的分离效能 ， 因此 ，ＥＬＦ Ｃ － 用于 Ｉ 生物胺的检测是比较好的选择， 检测限在 ０ ５～０ ｏＬ 。 ． ０ １ ｍ 】 ２ ／
境分析等不同领域的应用和发展。 气相色谱 、 液相色谱 的检 测器类型比较 多， 发展比较快 ， 它们是否可以作 为毛细管电 泳的检测手段； 另外 ， 其他的检测技术 ， 如化学发光 、 拉曼光 谱、 红外 、 电导 、 质谱等是否也可以与毛细管电泳联用？ 围绕 这些问题 ， 科技工作者开展了针对性的研究工作 ， 一系列成 功的毛细管电泳在线检测联用技术不断涌现。 １ 毛细管电泳一 激光诱导荧光检测技术（ ＥＬ ） Ｃ －Ｗ
毛细管电泳-激光诱导荧光检测法分析胃癌组织及癌旁正常组织蛋白质的差异性
Ｄ ５ ３ ２ Ｓ（ Ｔ ａ Ｋ ａ Ｒ ａ 公司） ； 二 甲苯 为化 学纯 ； 苏 木精染
液、 伊红染 液 、 １ ％ 盐 酸乙醇 分化液 由本实 验室 配制 。
１ ． ２ 样 品采集及 苏木 精一 伊红 （ Ｉ － Ｉ Ｅ） 染 色
胃癌 组织及 癌旁 正常组 织样 品取 自兰州军 区兰
。
目前 人们 通常 采 用极 端 ｐ Ｈ、 添加 剂 、 外 加 径 向
电场和 聚合物 涂层 等几种 方法来 抑制 蛋 白质 在管壁
的 吸 附 。本 实 验 对 毛 细 管 管 壁 添 加 化 学 涂 层 ， 并
采用 ｐ Ｈ ｌ ０的 ｌ×Ｔ Ｂ Ｅ（ Ｔ ｒ ｉ ｓ — ｂ ｏ ｒ ａ ｔ ｅ — Ｅ ＤＴ Ａ） 作 为缓
例、 胃溃 疡 癌 变 １例 。ＨＥ染 色 按 常 规 病 理 染 色 方
法进 行 。
（ ２ Ｄ — Ｐ Ａ Ｇ Ｅ） 、 质谱 （ ＭＳ ） 等 。虽 然 这 些 技术 分 离 蛋
白质 具有较 高 的灵敏 性 ， 但 如 何 从繁 杂 的信 息 中发
１ ． ３ 毛 细 管 柱 修 饰
蛋 白质 吸附是 影响 毛细管 分离蛋 白质 的难题 之
一
现差 异蛋 白质并 从 中提 取 有 用 的信 息 ， 使 其成 为 敏
感性 和特异 性均 高 的标 记物 是研究 的重 点和难 点 。 毛细管 电泳 （ Ｃ Ｅ ） 易 与其他分 析技术 联用 ， 从而 大大 增加 了其应 用 范 围 ， 是 目前 发展 最 为 迅 速 的分 离分 析技 术 之 一 。关 于 毛 细 管 筛 分 生 物 大 分 子 的机 理 已有 报 道 ’ ， 且 毛 细 管 电泳 与 激 光 诱 导 荧 光检 测法 （ Ｃ Ｅ — Ｌ Ｉ Ｆ） 联 用 检测 核 酸 和 蛋 白质 的技 术 已经 成熟 ， 比紫外 检测 的 灵敏 度 高 ｌ ０—１ ０ ０ ０倍 。
毛细管电泳与激光诱导荧光检测耦联法检测酿造过程及啤酒样品中的生物胺
通过 比较 样 品 峰 和 不 同浓 度 标 样 峰位 移 时 间来进 行 定 性 分 析 ， 用标准 添加 法进行 定量分
析。
１ ． ４ 衍 生化处 理
Ｉ 、 Ｎ Ｈ ：
＾ — — ＼ ／ Ｎ Ｈ ：
２ 苯基Ｚ 胺 （ ９ ）
腿 丁胺 （ １ ）
维普资讯
维普资讯
乏 五 壹 薪 型 巴 氏 杀 菌 监 嬲 仪 贝膛 １ ０ －
８ ４ ８Ｏ１
．
８ ４６ ０１ ３ ６
３ ６ ； ８ ４ Ｆ ６ ０ １ ３ １ １ ３ ０ ９ 昌 ： “
ＣＨ ３ ＮＨ ２
甲胺 （ １ ５ ）
组胺 （ ８ ）
Ｓ
图 ２ 各种胺类的化学结构
图１ Ｆ Ｉ Ｔ Ｃ和胺 化合物间的衍 生化 反应
为获得最佳分辨率 和最高灵敏度 ， 我们研究
１ ． ５ 电泳 方法
了实 验 和 仪 器 条 件 ， 最后 确 定 ： 电 压 最 佳 值 为 ３ ０ ｋ Ｖ， 因 为 在 此 条 件 下 可 以 获 得 最 短 的分 析 时 间； 进 样 的最 佳 时 间 为 １ ２ ｓ ； ｐ Ｈ＝９ ． ３时 分 离度 最 好 。在 本研究 中 ， 离子 强 度 和有 机 修 饰 剂 是 影 响 生 物胺 分离 效果 最 显 著 的变 量 。在 ｐ Ｈ＝９ ． ３时 ， 我们 用 １ ５ ％ 的丙 酮 溶 剂研 究 了离 子 强度 对 １ ５ 种 生物胺 分离度 的影 响 ， 通 过 改 变 硼酸 钠 缓 冲液 的
ｎ ８ ｃ ｏ ｎ
Ｅ ￣ － ｍａ ｉ ｔ ： Ｉ Ｉ ｑ 自 ｈ
缱阻颐 贝 复套 日中』 羁甚 代理
毛细管电泳仪
毛细管电泳仪
一、小分子检测
1、有紫外吸收
首先选择二极管阵列检测器或UVD。
2、无紫外吸收
（1）可衍生化：可先采用衍生的方法，再用UVD检测，如氨基酸和还原性糖等。
（2）不可衍生化：可采用间接紫外法用UVD检测，也可用电化学检测器检测。
3、有荧光或需要高灵敏度检测：可用LIFD检测。
4、需要测定结构或难以用光学检测器检测：可用MS检测。
二、大分子检测
1、蛋白质和核酸
（1）首先选择UVD。
（2）需要高灵敏度检测：可采用柱前或柱上衍生的方法标记荧光，再用LIFD检测。
（3）需要特异性检测：可使用特异性荧光探针标记后，再用LIFD检测。
（4）需要测定分子量或氨基酸序列：可用MS检测。
2、多糖
（1）含量较高的多糖：可采用末端吸收法用UVD检测。
（2）含量较低的还原性多糖：可采用衍生试剂标记后，再用LIFD和UVD检测。
毛细管电泳仪（CE）是以毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力，利用荷电粒子之间的淌度差异和分配系数差异进行分离，是分析科学继液相色谱仪之后的又一重大进展，使分析科学从微升级进入到了纳升级水平，不仅使单细胞乃至单分子分析成为可能，也使蛋白质和核酸等生物大分子分析有了新的转机。
由于CE溶质区带的超小体积的特性导致光程太短，而且圆柱形毛细管作为光学表面不够理想，对检测器灵敏度要求相当高，检测是CE
分析的关键。
毛细管电泳法的特点和CEMS的构造
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实验操作流程
01
02
03
04
样品处理
将待分析样品进行适当的预处 理，如稀释、过滤、离心等，
以去除杂质和干扰物质。
毛细管清洗与填充
使用适当的清洗液清洗毛细管 内壁，然后填充合适的缓冲液
和胶体。
进样与分离
将预处理后的样品注入毛细管 ，在电场作用下进行分离。
检测与记录
采用适当的检测器对分离后的 组分进行检测，记录检测数据
高通量分析
随着技术的不断发展，毛细管电泳法在高通量分析方面取得了重要进展，能够同时分离和检测多个样 品中的组分。
多模式分析
除了传统的分离模式外，毛细管电泳法还发展出了多种分离模式，如毛细管凝胶电泳、毛细管等电聚 焦等，能够适应不同组分的分离需求。
cems的发展趋势与展望
• 微纳尺度分离：随着微纳加工技术的进步，毛细 管电泳法的分离通道尺寸越来越小，分离效率越 来越高。
03
毛细管电泳-质谱联用系统（Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry，简 称CE-MS）：CE-MS是将毛细管电泳分离技术与质谱检测技术相结合的分析方法， 具有高分离效能、高灵敏度、高分辨率等优点。
cems的构造与原理
进样系统
进样系统是将待测样品引入到毛细管电泳分离通 道的装置，一般采用注射器、定量环或自动进样 器等。
对缓冲液和电极的要求高
01
毛细管电泳法的分离效果受到缓冲液和电极质量的影响较大，
需要高质量的试剂和电极才能获得准确的结果。
对样品前处理的依赖性较大
02
对于复杂样品，需要进行适当的前处理才能进行有效的分离和
毛细管电泳的原理及应用(第二讲)毛细管电泳的原理及应用.
（２）激 光诱导荧 光检测器 （ＬＩＦ ：激光 的高 光流 量 、聚光性 、单 色性等 特点使 其成 为理想 的激励源 。 常 用 氦－镉 激 光 器 （３２５ｎｍ ）和 氩 离 子 激 光 器 （４８８ｎｍ 。对荧光 黄最 低检 测限 为 １０－ ｍｏｌ／Ｌ，约 ６００００个分子或更低［。 有关ＬＩＦ的应用可参见最 新文献［１。
５ 电化学检测器
电化学检测器 （ＥＣ）可避免 ＣＥ中光学类检测器 遇到的光程太短 的问题 ＥＣ和 ＬＩＦ同为 ＣＥ中灵敏 度最高的检测器 ，其缺点在于商 品化较难 ，至今没有 商品 电化学检测器供 应 。
（１电导检测器 ：柱 上电导检测是 在毛细管 壁上 用激 光钻 两 个孔 ，插 上 两根 铂 电极 ，再 将孔 封 住 即 成。其检测限 以 Ｌｉ＋计可达 １０－７ｍｏｌ／Ｌ １０－１８ ｍｏｌ［２０］。柱尾检测 则在 分离毛细管后再接上 电导检 测器 。还有 的是将柱尾 电导检测器和 安培检测器组
×１０－ｍｏｌ１．３ １０－１２ｍｏｌ／Ｌ １３］。还出现荧光二极 管 阵 列检 测 器［４和 ＬＩＦ／电荷 藕 合 器 件 （ＣＣＤ）系 统［１］，对 ＦＩＴＣ衍生氨基酸 的检 测限为 ２ １０－２０ｍｏｌ （约 １０－１２ｍｏｌ／Ｌ。最新的动向是采用价格低廉的半 导体激光器作激励源［１６］，激发波长在 ６３５ ８５０ｎｍ， 用于可 见和近红 外区 ，检测 限可达 ｆｍｏｌ级。
用激 光束 聚焦到毛 细管 上 ，产生 的散射光 由一 束 围绕着毛 细管 的光纤 引导到拉曼光谱仪 的接收器 上 ，即构成 了激光 拉曼检测器 ，检测限 以甲基红计 ， 为２．５ １０－６ｍｏｌ／Ｌ［２６］，与ＵＶ检测器相当。也可采 用 ＣＣＤ作拉 曼光谱检测器 ［２７］。这种检测方法 的最 大特点是能 获得 溶质 的结构信息 。
毛细管电泳中常用的检测方法
毛细管电泳中常用的检测方法毛细管电泳(C E ) 以其高效、快速的分离, 成为一种令人瞩目的分析手段。
为了便于热量散失和进行柱上检$lJ , 采用了极小内径的毛细管(≤50 umi.d.) , 这样允许进样量就很小(10 一9 g )。
如此小的进样量要求有高灵敏的检测方法, 才能进行定性、定量分析。
紫外吸收法：一般, 常用于C E 的检测器是市售的紫外和荧光检测器。
当采用紫外一可见吸收法时, 石英毛细管壁的内涂层常常用有机溶剂溶解或灼烧而刮去, 使出现一个“小窗口” , 作为柱上检测的流通池。
内径很小的毛细管使得流通池的长度也相应很小, 检测灵敏度相当有限, 尤其在生物样品分析中常常需要先行样品预富集然后再检测, 以提高灵敏度。
在使用长方形徽面的毛细管进行电泳分离分析时,柱上检测的光学流通池长度明显增大, 使检测灵敏度提高7 1 5 倍。
采用高能量的光源, 如氨灯、激光等, 可较大地提高检测灵敏度, 但费用较高, 又因可供选择使用的人射光波长范围较窄, 限制了它的应用。
荧光检测法：荧光检测的灵敏度比紫外吸收法高几个数量级。
对于有适当的激发荧光和发射荧光的供试品, 采用激光诱导荧光检测法和光电倍增管, 可使检测灵敏度大大提高, 而对于绝大多数无自然荧光的化合物, 则必须进行柱前或柱后衍生化, 才能进行荧光检测。
间接检测法：对供试品进行衍生化的操作繁琐, 且易引入误差, 对于被测浓度极低的生物样品更是如此。
于是, 间接检测法应运而生。
间接检测就是在电泳缓冲液中加入具有检测响应的检测剂, 如发色团、荧光物质等, 作为本底响应,以产生基线信号。
供试品进样后, 供试品离子与反电荷的检测剂离子形成离子对, 或置换了检测剂的同电荷离子, 分别产生正峰和负峰,使基线信号发生改变而被检测。
在间接荧光法中, 被分析物能吸收荧光辐射或使本底荧光淬灭, 本底信号因此降低或消失而进行检测。
这种方法要求供试品必须能吸收荧光或淬灭荧光。
毛细管电泳在氨基酸分析中应用的进展
质的差异，再通 过 电泳系统进行分 离。具体 方法 有：① 加入环糊精 。报 道最多的分离对映体 的方 法 是向缓冲液 中加八环糊精 有报道用组胺修饰 的 Ｂ环糊精分离 了 １ 种 Ｄ 衍生氮 基酸 的对 映 ． ４ ＮＳ 体。Ｋ ｎｔ等”用 环糊精修 饰的毛细凝胶管 ． ａｅ ａ Ｉ 对氰兰衍 生的氨基酸进 行手性 分离。 ｚｇｅ等 Ｄ ｙｉｌ 报 道 了 ＊环 糊精 分 离未衍 生 芳香 氨基 酸对 映
的荧光试 剂有荧光 异硫氰酸 盐 （ １Ｃ）、ＯＰ ＦＴ Ａ、 ＮＤ Ａ、荧光胺 等 。有 些新 荧光 团可用 一 极管 激
发展最快 的分 离分析 方法之 一，具有 高效 、快 速 、灵敏 、进样 少 、成本 低等 优点 。分 离模式 主要有 ：毛细 管区 带 电泳 （ Ｚ Ｃ Ｅ）、胶 束 电动 毛细管色谱 （ Ｃ 、 ＭＥ Ｃ） 毛细管 凝胶 电泳 （ ＧＥ 、 Ｃ ） 毛细 管 等 电 聚焦 （ ｌＦ） 、毛细 管 等速 电泳 ＣＥ （ ＩＰ ＣＴ ）、 毛细 管 电色 谱 （ Ｅ Ｃ Ｃ）等 。在生化 及其他领 域 ，微量氨 基 酸 的测定常 常 具有重要 意义 。 前进 行氨 基酸 的分 析多采 用高 效液相 色谱法 ，分析成 本高 ，分析时问 Ｋ。现在 Ｃ Ｅ Ｚ 和 ＭＥ Ｃ 在这方面 的应用研 究极 为广泛 。其 中 Ｃ
酯 （Ｉｃ）等 ，主要 用 于柱 前衍 生 。最新 的衍 ＰＴ 生方 法是柱 内衍 生， 即衍生 反 应在毛 细管 柱 内
进行。Ｔ ｇ ａａ等ｌ Ｊ １研究了用 Ｏ Ａ 在柱内衍生氮 Ｐ
作者单位：０５ ０８ １０ ９中山大学 中山医学院化学教研室 ②５０ ７ １２ ５中山大学化学与化工学院
本文对 ＣＥ在氮基 酸分 析中的检测 、 分离和 应用
荧光检测毛细管电泳法
通过荧光检测毛细管电泳法快速灵敏地检测人体血浆中的亚硝酸盐的方法本文选自塔兰塔(Talanta)，爱思唯尔(Elsevier)出版，纯分析化学期刊。
作者：安范舒普代尔，来自比利时鲁汶大学。
摘要:分析亚硝酸盐,NO指示剂在体内的产生,为研究NO在体内的合成提供了一个有用的工具。
通过其衍生反应和2、3二氨基萘(DAN)中一个快速、灵敏荧光-毛细管电泳法被发展来测定了人体血浆中的亚硝酸盐。
亚硝酸盐在人体血浆中很容易与DAN在酸性条件下反应得到收益率很高的荧光2,3-萘酚三唑(NAT)。
荧光检测是完成施达赛检测的最佳化方式，它允许一种等离子体样品的直接分析而不像大多数堆积样品的CE-UV方法。
乙腈可去除蛋白质。
短程注射和高压电(30千伏)可缩短分析时间。
用20mm,pH值为9.23的缓冲溶液可更好的分离。
NAT的分离在1.4分钟内完成，除蛋白等离子体样品以5s每50 mbar水动力地的速度被注射到60厘米×75微米的内部直径无涂层的玻璃毛细管里。
激发波长被选中为一个宽带滤波器(240-400nm),发射光在418nm被测量通过采用一个截止过滤器。
在2到500nm的范围内获得一个好的线性关系(R2=0.9975)。
在原始血浆样本中亚硝酸盐的检测极限是0.6nm, 比我们此前的CE-UV法低了750倍。
先进的荧光-毛细管电泳法相对于目前的荧光高效液相色谱法，具有更简单的系统和更低的成本优势，同时也很灵敏。
这个研究表明该方法测定人体血浆中亚硝酸盐在的浓度与频繁报道的一致。
1介绍研究表明，亚硝酸盐在生理和病理条件下有可能成为NO合成的一个标志，因此在实验和临床研究中可能作为一个生化参数。
但是到目前为止，还没有真正关于人体血浆中亚硝酸盐的浓度的共识。
具报告，一般水平的亚硝酸盐在人体血浆中“不能检测”的范围达到26微米。
人体血浆中亚硝酸盐的浓度最合理的范围是从100纳米到1微米，通过大多数研究者团体的测量最常报道的结果是从100纳米到200纳米。
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研究简报发光二极管诱导荧光用于毛细管电泳检测杨丙成 谭 峰 关亚风3(中国科学院大连化学物理研究所,大连116012)摘 要 利用发光二极管作为激发光源,组装了用于毛细管电泳的荧光检测器。
光纤用于传输荧光信号;光纤端面修饰成球形使耦合效率比平面端光纤提高了50.8%;光阑、光纤及毛细管检测池之间的光学校准简单、便捷。
荧光素染料用于评价该体系性能,得到了fm ol 的质量检出限。
关键词 发光二极管,诱导荧光检测,光纤,荧光素 2002210230收稿;2003206206接受本文系国家自然科学基金资助项目(N o.29925514)1 引 言荧光(fluorescence ,Fl )检测,尤其是激光诱导荧光检测(LIF 2D ),是毛细管电泳(capillary electrophoresis ,CE )中常用的高灵敏检测技术。
尽管LIF 2D 具有极高的灵敏度,但激光器成本高,体积大,能耗高的缺点在很大程度上限制了LIF 2D 的应用。
半导体激光器具有体积和成本优势,但目前其发射波长主要局限在长波区,在此区域很难找到合适的商品荧光染料。
发光二极管(light 2emitting diodes ,LE Ds )具有输出功率稳定、能耗低、体积小、适当高的亮度(～5000mcd )、寿命长(～100万h )等优点,非常适合于微型化仪器。
近年来,LE Ds 应用于CE 检测逐渐引起了人们的关注,但主要是集中于吸收检测1,2,荧光检测报道的还非常有限3,4。
本文探讨了利用高亮度LE D 应用于荧光检测的可行性。
为增加装置的灵活性,采用光纤接收荧光信号,以荧光素为标样评价了该体系,结果表明:其性能达到了常规荧光检测器的指标。
2 实验部分2.1 电泳操作自组装了一简易CE 装置。
高压电源:0～30kV ;虹吸进样:10cm 25s ;分离场强:300V Πcm ;毛细管:0.1mm i.d.×60Π45cm (总长Π有效)(河北永年光导纤维厂)。
2.2 设备与试剂光纤:纤芯200μm Π包层220μm (P olymicro T echnologies );LE D :中心波长470nm ,波长半宽度FWH M 20nm ,亮度～3000mcd (深圳世峰光电);光电倍增管(PMT ):R446(Hamamatsu ,Japan )。
为消除新的LE D 固有的低频噪声,根据文献5对LE D 进行“老化”处理。
荧光素,国产分析纯,用25m L 乙醇和75m L 水配制成10-4m ol ΠL 的工作液,使用时稀释到所需浓度。
所用试剂均为分析纯,Milli 2Q 超纯水配制。
溶液均用0.22μm 滤膜过滤。
2.3 光学系统本装置采用柱上检测模式。
由于LE D 为非相干光源,使用透镜很难将其发射光束聚焦至和毛细管内径相适配。
为减小背景杂散光,利用光阑限制其光斑。
因光阑、毛细管及光纤的尺寸均为微米级,三者之间的光学校准并非易事。
在本光学系统中,从LE D 发出的光束由两透镜准直聚焦至毛细管中;光阑用于限束;光纤在与激发光束垂直的方向上收集荧光,经干涉滤光片后被PMT 检测。
通过自制校准系统很好的实现了LE D 、光阑、毛细管及光纤之间的校准。
为屏蔽室内杂散光,光纤外表面罩一黑色塑第31卷2003年9月 分析化学(FE NXI H UAX UE ) 研究简报Chinese Journal of Analytical Chemistry 第9期1066～1068 图1 LE D 诱导荧光检测系统装置示意图Fig.1 Schematic diagram of light 2emitting diode (LE D )2induced fluorescence detection system1.熔融石英毛细管(fused 2silica capillary );2.电极槽(reserv oir );3.铂电极(platinum electrode );4.校准系统(alignment cartridge );5.石英光纤(silica optic fiber );6.干涉滤光片(interfere filter );7.光电倍增管(photoelectric multiplier ,PMT );8.LE D ;9.透镜(lens )。
管。
整个光学系统放置在自制暗箱内。
图1为装置示意图。
3 结果与讨论3.1 注入电流对LE D 输出功率的影响图2是注入电流对LE D 输出功率的影响。
显然,二者呈现出很好的线性关系。
对荧光检测而言,系统的信噪比往往随激发光强度的增加而增大,故在一定程度上可以通过提高注入电流增强其检测灵敏度。
3.2 球形端面光纤的使用研究表明,通过将光纤的水平端面修饰成球形可使光纤接收角明显增加6,7。
该技术曾在通讯领域得到应用,但还未见应用于荧光检测的报道。
本文探讨了通过将光纤端面修饰成球形用于提高荧光 图2 LE D 注入电流对输出功率的影响Fig.2 The effect of injection current on LE D output 的收集效率。
表1给出了球形端面光纤与平面端面光纤之间的对比。
由表1可见,球形端面光纤耦合效率较平面光纤可提高50.8%。
表1 球形端面和平面端面光纤对输出信号的影响aT able 1 The comparis on between spherical 2ended and flat 2endedoptic fiber a 光纤类型T ypes 信号S ignal (μV )噪声N oise (μV )信噪比S ignal Πnoise 平面端Flat end 128621.3球形端S pherical end193727.6 a.荧光素(fluorescein ):1μm ol ΠL ;光纤(optic fiber ):纤芯(core )200μm Π包层(cladding )220μm ;d Π2r =0.8;测试条件见实验部分(theconditions are shown in the experimental section )3.3 性能测试 图3 0.4μm ol ΠL 荧光素电泳图Fig.3 The electropherogram of 0.4μm ol ΠL fluorescein s olution 缓冲溶液(running bu ffer )Na 2B 4O 7,0.01m ol ΠL ,pH 9.2;重力进样(gravity injection )(10cm 25s );分离电压(v oltage ):18kV 。
利用荧光素评价了该荧光检测系统。
其噪声(P 2O 2P )约为7μV ;浓度检出限为0.18μm ol ΠL (S ΠN =5)。
图3是0.4μm ol ΠL 的荧光素电泳图。
该系统在2×10-7m ol ΠL ～4×10-5m ol ΠL 范围内相关系数R 2=0.993。
测试结果表明:该性能达到了溴钨灯作为激发光源的荧光检测器性能8,能够满足一般的测试需要,同时也说明LE D 用于诱导荧光检测是可行的。
4 结 论探讨了以高亮度LE D 为激发光源应用于CE 荧光检测的可行性。
利用光纤接收荧光信号使整个光学结构灵活、紧凑。
以荧光素为检测样品评价了该体系性能,得到了fm ol 的质量检出限,达到了普通荧光检测器的性能。
尽管该性能指标较LIF 2D 相比还有很大的差距,但考虑到LE D 尺寸小、低功耗、低成本的特点,LE D 诱导荧光检测还是具有较高的性价比。
采用脉冲驱动电源,对光纤端面进一步抛光处理等措施,有望能进一步降低检出限。
7601第9期杨丙成等:发光二极管诱导荧光用于毛细管电泳检测 8601 分析化学第31卷R eferences1 Boring C B,Dasgupta P K.Anal.Chim.Acta,1997,342:123～1322 T ong W,Y eung E S.J.Chromatogr.A,1995,718:177～1853 Dasgupta P K,Zhang G,Li J,Boring C B,Jambunathan S,Al2H orr R.Anal.Chem.,1999,71:1400～14074 Wang S,Huang X,Fang Z.Anal.Chem.,2001,73:4545～45495 Smith B W,Jones B T,Winefordner J D.Appl.Spectros.,1988,42:1469～14726 K ato D.J.Appl.Phys.,1973,44:2756～27587 Brackett C A.J.Appl.Phys.,1974,45:2636～226378 X iong Shaoxiang(熊少祥),Li Jianjun(李建军),Chen Jieke(程介克).Journal o f Analytical Science(分析科学学报),1995,11(3):12～15Light Emitting Diode2I nduced Fluorescence Detectionin C apillary E lectrophoresisY ang Bingcheng,T an Feng,G uan Y afeng3(Dalian Institute o f Chemical Physics,Chinese Academy o f Sciences,Dalian116012)Abstract A miniaturized fluorescence detector for capillary electrophoresis,based on a high brightness light emitting diode as excitation s ource,is described.Optical fiber was used to collect the fluorescence,leading to a com pact and easily im plemented optical system.The flat end of optical fiber was m odified to spherical end,resulting 50.8%increase of efficiency than that of the flat end.A sim ple device for optical alignment of fibers and capillary column was designed which sim plified the alignment into a slid2in operation.The performance of the detector was evaluated with fluorescein as standard sam ple,attaining mass detection limit of fm ol.K eyw ords Light emitting diodes,induced fluorescence detection,optical fiber,fluorescein(Received30October2002;accepted6June2003)《中国无机分析化学文摘》2004年征订启事 《中国无机分析化学文摘》经国家科委批准,1984年创刊,公开发行(刊号ISS N1003-5249/C N11-1835/O6)。