鱼藤酮及神经肽PACAP27对PC12细胞PAC1受体及内源性PACAP表达的影响
鱼藤酮对大鼠中脑神经元多巴胺转运、储存和代谢的影响
鱼藤酮（ ｒ ｏ ｔ ｅ ｎ ｏ ｎ ｅ ） 是一种线粒体复合体 Ⅰ 抑制 剂， 近年来广泛应用于蔬菜、 瓜果等病虫害的防治和
１ ］ 鱼塘清理 ［ ， 其造成的环境污染及对人体的危害正
观和行为变化。然后麻醉处死大鼠， 取中脑黑质组 织。分别用免疫组织化学法、 Ｗｅ ｓ ｔ ｅ ｒ ｎ蛋白印迹法和 Ｒ Ｔ Ｐ Ｃ Ｒ法检测鱼藤酮对大鼠中脑黑质 Ｄ Ａ神经元 突触囊泡单胺转运体（ Ｖ Ｍ Ａ Ｔ ） 表达的影响； 以卞胺 ２ 为底物进行比色， 检测组织单胺氧化酶（ Ｍ Ａ Ｏ ） 的活 性； 高效液相色谱 荧光检测器流速梯度法测定黑质 Ａ及其代谢产物 ３ ， ４ 二羟基苯乙酸 组织 内 Ｄ （ Ｄ Ｏ Ｐ Ａ Ｃ）和 高 香 草 酸 （ Ｈ Ｖ Ａ）的 含 量。 结 果 注射鱼藤酮２ ８ｄ后， 大鼠发生外观和行为改变， 出 现类 帕 金 森 病 症 候 群 特 征； 中脑黑质 Ｄ Ａ神 经 元 Ｖ Ｍ Ａ Ｔ 鱼藤酮 １ ． ０ ２ 蛋白免疫深染的细胞数量减少； 和１ ． ５ｍ ｇ · ｋ ｇ 组Ｖ Ｍ Ａ Ｔ ２ 蛋白和基因表达与正常对 照组比 较 明 显 降 低， Ｍ Ａ Ｏ活 性 分 别 从 对 照 组 的 （ ２ ３ ． ６± ７ ． ６ ） 升高至 （ ３ ７ ． ８± ５ ． ０ ） 和（ ４ ０ ． ５± ４ ． ３ ） ｋ Ｕ · ｈ· ｇ 蛋白， 均具有统计学意义； 实验组大鼠中 Ａ及其代谢产物 Ｄ Ｏ Ｐ Ａ Ｃ和 Ｈ Ｖ Ａ含 脑黑质组织内 Ｄ 量明显减少。结论 鱼藤酮可抑制大鼠中脑黑质 Ｄ Ａ 神经元 Ｖ Ｍ Ａ Ｔ 增强 Ｄ Ａ代谢相关酶 Ｍ Ａ Ｏ的 ２ 的表达， 活性， 进而影响 Ｄ Ａ的转运、 储存和代谢， 这可能是鱼 藤酮 Ｄ Ａ神经元选择性毒性作用机制之一。 关键词：鱼藤酮；多巴胺；突触囊泡单胺转运体； 单胺氧化酶；神经元 中图分类号：Ｒ ９ ９ ６ 文献标识码：Ａ 文 章 编 号： １ ０ ０ ０ ３ ０ ０ ２ （ ２ ０ ０ ８ ） ０ ３ ０ ２ ２ ７ ０ ６ Ｄ Ｏ Ｉ ： １ ０ ． ３ ８ ６ ７ ／ ｊ ． ｉ ｓ ｓ ｎ ． １ ０ ０ ０ ３ ０ ０ ２ ． ２ ０ ０ ８ ． ０ ３ ． ０ １ ２
鱼藤酮的神经毒性研究进展
收稿日期 :2005-08-03 ; 修回日期 :2005-10-09 作者简介 :黄超培 (19622) ,男 ,硕士 ,研究方向 :卫生毒理学 。 审者简介 :赵鹏 ,男 ,硕士 ,研究方向 :卫生毒理学 。
© 1994-2007 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved.
[6 ] Ema M , et al. [J ] . Reprod Toxicol , 2003 , 17
Perspect , 2003 , 111 (14) :1783-17851
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[19 ] Latini G. [J ]. Biol Neonate , 2000 , 78 :269-2761
发现从鱼藤胶中分离出来的几种鱼藤酮类化 合物对细胞均有毒性作用 ,其中鱼藤酮的细 胞毒性最大 。
现已证实 ,鱼藤酮能与细胞内线粒体的 线粒体复合物 Ⅰ(complex Ⅰ) 即还原型烟酰 胺腺嘌呤二核苷酸 (NADH) 脱氢酶结合并抑 制其活性 ,阻断细胞呼吸链的递氢功能和氧 化磷酸化过程 ,进而抑制细胞呼吸链对氧的 利用 ,造成内呼吸抑制性缺氧 ,导致细胞窒 息 、死亡 ,从而产生细胞毒作用[3] 。鱼藤酮抑 制 NADH 的活性是其产生细胞毒性过程中的 中心环节 ,但目前对其详细过程尚不十分清 楚 。哺乳动物细胞的内呼吸是在线粒体内进 行的 ,线粒体呼吸链由脱氢酶 、黄酶 、复合物 Ⅰ和细胞色素氧化酶共同组成 。复合物 Ⅰ包 含有以核黄素单核苷酸 ( FMN) 为辅基的黄素 蛋白和以 Fe- S 簇为辅基的铁硫蛋白 。在正 常情况下 ,复合物 Ⅰ通过 FMN 和 Fe- S 簇中 的 Fe 原子将电子传给泛醌 ( ubiquinone) ,即 辅酶 Q 。目前的研究表明 ,鱼藤酮对复合物 Ⅰ有较强的亲和力 ,可选择性地阻断 Fe- S 簇 与辅酶 Q 的作用 ,从而终止线粒体呼吸链的 正常 运 转 , 使 呼 吸 链 不 能 将 NADH 氧 化 为 NAD ;此外 ,当复合物 Ⅰ功能受到抑制时 ,还 会使 ATP 合成减少 ,同时引发脂质过氧化和 自由基的产生 ,后者可进一步造成线粒体 DNA 的突变和蛋白质的变性 ,加重对细胞的 损伤[3 ,4] 。 212 对多巴胺能神经的毒性作用
PACAP对神经系统疾病保护作用的研究进展
Ｋ ｙｗ ｒ ｓ Ｐ Ｃ Ｐ ｆｃｌ ｅｅｒｌ ｓｈｍｉ； ｒｕ ａ ｃｂａ ｎ ｒ ； ｃ ｉ ｐ ｒｎａ ｅ ｏ ｄ Ａ Ａ ； ｏａ ｃｒｂａ ｉ ｅ ａ ｔ ｍ ｔ ｒｉ ｉ ｕ ｓｈｚ ｈｅ ｉ ｃ ａ ｉ ｎ ｊｙ ｏ
垂 体 腺 苷 酸 环 化 酶 激 活 肽 （ ｉ ｉｒ ｄ ｎ ｌ ｅ ｐ ｕｔ ｙ ａ ｅｙａ ｔ ａ ｔ
ｃｃ ｓ．ｃ ｖｔ ｇ ｏ ｐｐｌｅ Ｐ Ｃ Ｐ）是 Ｍｉａ ｙｌ ｅａｔ ａ ｎ ｐ ｌ ｅｔ ， Ａ Ａ ａ ｉ ｉ ｙ ｄ ｙｔ ａ
腺 苷 酸 环 化 酶 激 活 肽 受 体 １ ｖ ｓａｆ ｅ ｉｔ ｔ ａ （ ａｏｃ ｖ ｎｅ ｉ ｌ ｉ ｓｎ
ｐ ｐ ｉ ｅ ｐ ｔ ｉ ｒ ａ ｅ ｙ ａｅ ｙ ｌ ｓ —ｃ ｉａｉ ｇ ｅ ｔ ｅ ｅ ｔ ／ ｉ ｔ ｙ ｄ ｎ ｌｔ ｃ ｃ ａ ｅ ａ ｔ ｔ ｐ ｐｉ ｄ ｕ ａ ｖ ｎ ｄ
受体 （ ｉ ｉ ｒ ｄ ｎｌｔ ｃ ｃ ｓ—ｃ ｖｔ ｇｐｌ ｅｔ ｅ ｐｔ ｔ ａｅ ｙ ｅ ｙｌ ｅａｔ ａ ｎ ｏ ｐ ｐｉ ｕａ ｙ ａ ａ ｉ ｉ ｙ ｄ ｒｃｐｏ ，Ｐ Ｃ ） 体 ， Ｐ Ｃ Ｐ具 有 高 亲 和 性 ， ｅｅｔｒ １ Ａ １受 与 ＡＡ 对 Ｖ Ｐ的亲和 力较低 ； Ｉ 另一类 为血 管活性 肠肽／ 体 垂
脑 缺 血 损 伤 。Ｎ ｋ ｍａｈ 等 研 究 发 现 Ｐ Ｃ Ｐ基 ａａ ｃｉ ＡＡ 因缺失 大 鼠与野 生 型大 鼠相 比， 水肿 明显 加重 ， 脑 而
两 组 大 鼠在 缺血 期 的缺 血侧 大脑 皮层 和对 侧大 脑皮
层 的血 流量 是一 样 的 。
Ｐ Ｃ Ｐ可 减 少 兴 奋 性 氨 基 酸 的释 放 而 发 挥 对 ＡＡ
ｓ ｎｇ ｄ ｓ ａ ｅ ａ ｄ Ａｌｈ ｉ ｒ ｉｅ ｓ ．Ｎｏ ｏ ｉｅ ｓ ｎ ｚ ｅｍｅ ｇ ｄ ｓ ａ ｅ ｗ，ｗｅ ｒ ｖｅ ｄ ｔ ｅ ｒ ｓ ａｃ ｄ ａ ｃ ｓａ ｏ ｔｔ ｅ ｐｒｔ ｃｉｅ ｒ ｌ ｅ ｉｗｅ ｈ ｅ ｅ ｒ ｈ ａ ｖ ｎ ｅ ｂ ｕ ｈ ｏｅ ｔｖ ｏｅ ｏ ＡＣＡＰ ｉ ｈ ｅ ｖ ｕ ｙ ｔｍ ｉｅ ｓ ｓ ｆＰ ｎ ｔ ｅ ｎ ｒ ｏ ｓ ｓ ｓｅ ｄ ｓ ａ ｅ ．
农药鱼藤酮对表达_突触核蛋白细胞的作用
农药鱼藤酮对表达α2突触核蛋白细胞的作用3珠帕尔・木拉提2 杨 慧133 蔡 青1 赵春礼1 梁 源1 赵焕英1 胡 宇2(1首都医科大学北京神经科学研究所北京神经再生修复研究重点实验室 北京 1000542新疆医科大学公共卫生学院劳动卫生与环境卫生教研室 乌鲁木齐 830054)摘要 本研究利用农药鱼藤酮作用于神经细胞,观察鱼藤酮对神经细胞的损伤作用以及线粒体功能障碍与α2synuclein 积聚之间的关系。
方法:本实验选用人神经母细胞瘤细胞株SH 2SY 5Y,实验组为α2synuclein 2G FP 基因转染的细胞,鱼藤酮处理的转基因细胞和非转基因细胞,对照组为未处理的SH 2SY 5Y 细胞。
通过RT 2PCR 检测α2synuclein 基因转染细胞的基因表达情况。
荧光显微镜观察细胞内α2synuclein 2G FP 表达产物绿色荧光蛋白。
MTT 法检测各组细胞活性。
DCF 检测细胞氧应激。
HE 染色、免疫组化检测α2synuclein 在细胞中的状态。
电镜观察细胞超微结构的改变。
结果:RT 2PCR 显示转基因细胞α2synuclein 基因的表达。
荧光显微镜观察显示细胞浆内可见绿色荧光蛋白,绿色荧光分布不均匀,可见蛋白积聚。
MTT 检测结果显示,与对照组相比,鱼藤酮处理的细胞增殖速度明显减小(P <0101)。
鱼藤酮的浓度为75nm ol ΠL 、100nm ol ΠL 时,未转基因与转基因的细胞活性相比较,前者的细胞活性低于后者(P <0105)。
HE 染色,鱼藤酮处理的转基因细胞胞浆减少、转基因细胞胞浆内也可见自噬体。
胞浆内有嗜酸性包涵体样结构。
免疫组化可见鱼藤酮处理高表达α2synuclein 细胞明显变成梭形并有很长的突起。
电镜显示鱼藤酮处理的细胞线粒体肿胀,嵴断裂,胞浆内形成自噬体。
DCF 检测转基因细胞内存在明显的氧化应激,并随鱼藤酮处理加重。
结论:农药鱼藤酮对多巴胺能神经细胞有明显的损伤作用,转基因细胞显示对较高浓度的鱼藤酮损伤有一定的耐受作用。
PACAP27抑制鱼藤酮诱导细胞凋亡的实验研究
的基础研究 ”资助项目 (No G1999054000) 作者简介 :王 刚 (1976 - ) ,男 ,博士生 , Tel: 021264370045, E2mail:
F ig 3 Protective effects of PACAP27 aga in st rotenone2induced neurotox ic ity of PC12 cells # P < 0105 vs rotenone ( 250 nmol·L - 1 ) group ( ↓) ; ## P < 0101 vs Rotenone ( 250 nmol·L - 1 ) group
wgneuron@ hotmail. com; 陈生弟 (1955 - ) ,男 ,博士 ,教授 ,主任医师 ,博士生导师 , 研究方向 : 神经 变性疾 病的发 病机制 和治疗 , Tel: 0212 64370045, E2mail: chen_sd@medmail. com. cn
鱼藤酮 (Rotenone, R )毒性作用的报道则少见 。本实 验在我们以往研究的基础上 ,采用体外培养的大鼠 嗜铬细胞瘤细胞 ( PC12 细胞 ) ,以新型的致帕金森 病相关神经毒素鱼藤酮损伤作为细胞模型 ,对 PAC2 AP27可能的保护作用及其机制进行初步的研究 。 1 材料与方法 1. 1 药品与试剂 DM EM 高糖培养基和神经生长 因子 (NGF)为 Gibco公司产品 。胎牛血清购自 In2 vitrogen公司 。鱼藤酮 、PACAP27、PACAP6227、四甲 基偶氮唑盐 (M TT) 、二甲亚砜 (DM SO ) 均购自 Sig2 ma公 司 。磷 脂 结 合 蛋 白 (Annexin2V ) 、碘 化 丙 啶 (p rop idium iodide, P I)购自 Santa Cruz B iotechnology 公司 。其余均为国产分析纯试剂 。
神经肽PACAP对帕金森病的保护作用
神经肽ＰＡＣＡＰ对帕金森病的保护作用孙 悦 刘梅芳△ 郇 宇 高 波（济宁医学院药学院，日照２７６８２６）摘要 帕金森病（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ＇ｓｄｉｓｅａｓｅ，ＰＤ）是一种常见的与年龄相关的神经退行性疾病，损害运动和认知功能。
其特征性病理改变表现为黑质致密部多巴胺能神经元的变性死亡。
垂体腺苷酸环化酶激活肽（ｐｉｔｕｉｔａｒｙａｄｅｎｙｌａｔｅｃｙｃｌａｓｅ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ，ＰＡＣＡＰ）是一种具有多种生物学功能的神经肽。
已有研究表明，ＰＡＣＡＰ与帕金森病密切相关，帕金森病动物模型和细胞模型上的研究均证实ＰＡＣＡＰ对黑质多巴胺能神经元具有保护作用。
本文就近些年来ＰＡＣＡＰ对帕金森病的保护作用及其机制进行综述。
关键词 神经肽，ＰＡＣＡＰ，帕金森病，神经保护作用中图分类号 Ｒ７４２ 帕金森病（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ＇ｓｄｉｓｅａｓｅ，ＰＤ）是一种常见的与年龄相关的神经退行性疾病，损害运动和认知功能［１］。
ＰＤ的特征性病理改变是黑质致密部（ｓｕｂ ｓｔａｎｔｉａｎｉｇｒａｐａｒｓｃｏｍｐａｃｔａ，ＳＮｐｃ）多巴胺能神经元的变性死亡。
ＰＤ患者多巴胺能神经元进行性死亡的原因尚未完全明确，与遗传因素、环境因素、炎症反应、氧化应激、线粒体功能障碍、兴奋毒和神经营养因子缺乏等有关［１］。
目前ＰＤ的主要治疗方法是对症治疗，临床广泛使用的左旋多巴（Ｌ ３，４ ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ，Ｌ ＤＯＰＡ）是治疗ＰＤ的“良药”。
Ｌ ＤＯＰＡ作为多巴胺前体可增加纹状体内多巴胺含量，改善运动症状，但不能阻止黑质多巴胺能神经元的退行性病变。
近些年来，人们致力于寻找内源性神经保护物质来延缓或逆转黑质多巴胺能神经元的退行性病变。
垂体腺苷酸环化酶激活肽（ｐｉｔｕｉｔａｒｙａｄｅｎｙｌａｔｅｃｙｃｌａｓｅ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ，ＰＡＣＡＰ）是一种具有多种生物学功能的神经肽，对神经退行性疾病具有保护作用［２］。
鱼藤酮PLGA纳米粒的制备及诱导大鼠帕金森病模型的实验研究
鱼藤酮PLGA纳米粒的制备及诱导大鼠帕金森病模型的实验研究毛全高【摘要】目的:制备鱼藤酮聚合物纳米分散液,建立与人类帕金森病发病特征相类似的动物模型.方法:采用溶剂扩散法制备鱼藤酮聚乳酸-羟基乙酸共聚物[poly(lactic-co-glycolic acid),PLGA]纳米粒,检测冷冻干燥保护剂(海藻糖、甘露醇、葡萄糖)及其浓度对冻干样品粒径的影响.将PLGA纳米粒制成冻干粉,28只SD大鼠分为4组,分别为空白对照组(6只),鱼藤酮组(6只),高剂量鱼藤酮PLGA纳米粒组(R-PLGA,8只)以及低剂量R-PLGA组(8只).各组均为皮下注射给药,空白对照组给予生理盐水,鱼藤酮组给予普通鱼藤酮溶液,R-PLGA组给予鱼藤酮纳米粒冻干粉.除高剂量组每4天给药1次(剂量为3.5 mg/kg)外,其他组均为每3天给药1次,每次剂量均为2.5 mg/kg.各组整个处理过程均为27 d.采用纳米粒度仪/Zeta电位仪测定纳米粒的粒径与Zeta电位;差示扫描量热仪(DSC)分析纳米粒中鱼藤酮的熔点,HPLC法测定鱼藤酮含量.观察大鼠外观行为表现(评分)、体质量、实格试验中移动潜伏期,用免疫组化法测定大鼠黑质酪氨酸羟化酶(TH)免疫阳性细胞数.结果:制得的R-PLGA 纳米粒平均粒径为306.5 nm,Zeta电位为-2.66 mV,包封率为89.14％,载药量为18.22％.2％海藻糖作为冷冻干燥保护剂保护作用最好,冻干粉平均粒径312.6 nm.与对照组比较,普通鱼藤酮组与高、低剂量R-PLGA组的大鼠行为学评分升高(P＜0.01),移动潜伏期从(0.93±0.21)s延长至(7.35±3.27)s,差异有统计学意义(P＜0.05).对照组TH免疫阳性细胞数为82.06±10.20,低剂量模型组(17.54±4.20)明显减少(P＜0.01).结论:制得可用于制作帕金森病大鼠模型的R-PLGA纳米粒冻干粉.【期刊名称】《江苏大学学报（医学版）》【年(卷),期】2016(026)001【总页数】6页(P82-87)【关键词】帕金森病;鱼藤酮;聚乳酸-羟基乙酸共聚物;免疫组织化学染色法;大鼠【作者】毛全高【作者单位】如皋市人民医院药剂科,江苏如皋226500【正文语种】中文【中图分类】R944;R994.39［Abstract］ Objective：To establish a method for preparing animal models with onset characteristics simi-lar to that of human Parkinson′s disease（PD）．Methods：The rotenone poly（lactic-co-glycolic acid）（PL-GA）nanoparticles was prepared by using solvent diffusion method．Inspecting the types of freeze-drying pro-tectants and concentration on the influence of sample diameter of freeze-drying powder．The Parkinson′s dis-ease model was induced in adult SD rats by subcutaneous injection of rotenone PLGA，the model of low dose 2．5 mg／kg every 3 days，and high dose 3．5 mg／kg every 4 days．Altogether the drug treatment lasted for 27 days．Diameter and Zeta potential of nanoparticles was determined by nanometer particle size analyzer．With differential scanning calorimetry（DSC）the physical state of rotenone in nanoparticles was analyzed．Rote-none of the contents was determined by HPLC．Grid experiment test were applied to investigateanimal be-havior change and prolonged start latency before and after rotenone was exposed．The injury of dopaminergic neuron was examined by the method of immunohistochemisty．Results：The mean diameter of the particle was 306．5 nm and Zeta potention was－2．66 mV．Its entrapement ratio reached 89．14%with the drugloading of 18．22%．The effectiveness of protection is best when using 2%concentration trehalose．The mean diameter of the particle was 312．6 nm．Compared with the control group，the rats of general rotenone group and model group，behavior score was rised（P＜0．01）；the start latency was prolonged to（7．35±3．27）s （P＜0．05），respectively，compared with in control group（0．93±0．21）s．The number of nigral tyrosine hydroxylase（TH）positive cells decreased significantly from82．06±10．2 in control group to 17．54±4．2 （P＜0．01）．Conclusion：Good quality freeze-dried preparations can be obtained and the adult rat PD models were established successfully under the condition．［Key words］Parkinson′s disease；rotenone；poly（lactic-co-glycolic acid）；immunohistochemical stai-ning method；rat帕金森病是常见的神经退行性疾病，临床表现为静止性震颤、肌僵直、运动迟缓和姿势不稳。
鱼藤酮致帕金森病动物模型研究进展
鱼藤酮致帕金森病动物模型研究进展唐慧玲; 张平【期刊名称】《《医学理论与实践》》【年(卷),期】2019(032)007【总页数】3页(P966-967,950)【关键词】帕金森病; 鱼藤酮; 动物模型【作者】唐慧玲; 张平【作者单位】南华大学湖南省衡阳市 421001; 南华大学附属南华医院神经内科【正文语种】中文【中图分类】R-33帕金森病是继阿尔茨海默病后第二常见的神经退行性疾病。
其发病很少发生在50岁之前，发病率的急剧增加发生在60岁之后。
在60岁以上的人群中受帕金森病的影响为1%～2%，男性的患病率高于女性。
最重要的是，这是一种渐进性疾病，它导致帕金森病病人的生活质量不断恶化。
因此，帕金森病给国家造成社会和经济负担[1]。
帕金森病的病理特征是细胞内蛋白质的包裹体Lewy小体和营养障碍性神经突,主要是由突触前蛋白α-突触核蛋白错误折叠和聚集及黑质多巴胺神经元丢失引起。
黑质多巴胺神经元的丢失导致背侧纹状体突触末端的多巴胺水平显著降低,最终导致黑质纹状体通路的缺失。
纹状体多巴胺的减少会引发一系列的运动症状，包括运动迟缓、静止性震颤、姿势障碍和僵直，这些都是帕金森病运动障碍的共同特征[2]。
本文结合目前已有的文献, 对鱼藤酮帕金森病动物模型的研究现状进行简要的综述, 期望为研究者提供参考价值。
1 帕金森病的动物模型目前迫切需要临床相关的模型来研究帕金森病的发病机制，并促进帕金森病的有效治疗。
了解帕金森病致病机制可能使我们能够:(1)推断潜在的病因，包括遗传因素，环境因素和基因—环境相互作用；(2)制定有效的治疗策略，如神经保护药物、基因治疗、手术、干细胞移植和其他医疗器械。
由于帕金森病病因学的复杂性，动物模型可以对帕金森病的所有临床特征和病理改变进行概括，如多巴胺神经元的特异性退化和Lewy小体形成[3]。
目前, PD动物模型可大致分为:(1) 鱼藤酮、1-甲基-4-苯基-1, 2, 3, 6-四氢吡啶(MPTP) 和6-羟基多巴(6-OHDA)等神经毒素模型；(2)脂多糖诱导的炎症模型；(3)利血平诱导的药理学模型；(4)parkin、 PINK1 和DJ-1等基因模型[4]。
鱼藤酮诱导帕金森病模型的制备方法及其机制研究进展
鱼藤酮诱导帕金森病模型的制备方法及其机制研究进展万叶;郭春燕;李永民【期刊名称】《中国药理学与毒理学杂志》【年(卷),期】2017(031)008【摘要】建立与临床疾病特征相似的帕金森病(PD)模型对研究治疗PD的药物至关重要.鱼藤酮具有极强的亲脂性,能透过血脑屏障和细胞膜,其致PD动物模型的行为学改变和病理学特征均与临床PD具有很大的相似性.鱼藤酮诱导PD动物模型的方法有立体定位、静脉注射、腹腔注射、皮下注射、脑微透析、灌胃、皮下埋置缓释微球和皮肤接触给药等,体外模型多采用SH-SY5Y和PC12细胞及多巴胺神经元的培养方法;毒性机制包括α-突触核蛋白异常聚集、线粒体功能异常和活性氧产生增加、抗氧化防御系统受损及神经细胞凋亡和神经细胞自噬途径等.本文对鱼藤酮诱导PD模型的体内、外方法及其毒性机制进行系统阐述,旨在为构建更接近PD特征的模型提供参考.%It is important to establish animal models of Parkinson disease (PD) similar to clinical features of human disease. Rotenone can readily penetrate the blood-brain-barrier and cytomem-branes due to its strong lipophilic ability. Rotenone models of PD can not only simulate behavioral changes in patients with PD, but also bear a strong resemblance to the human disease characteristics and pathological process of PD. Based on to researches at home and abroad in recent years, this paper summarizes and analyzes the modeling methods and toxic mechanisms of rotenone-induced PD. These methods include stereotaxis, intravenous injection, abdominal injection, subcutaneous injection,microdialysis drug, intragastric administration, subcutaneous embedded slow-release microspheres and exposure to drugs. The In vitro model invotves SH-SY5Y cells, PC12 cells and DA neurons. The toxic mechanisms involveα-synuclein abnormal aggregation, mitochondrial dysfunction, the generation of reactive oxygen species, damage to the antioxidant defense system, nerve cell apoptosis, and autophagy.【总页数】9页(P840-848)【作者】万叶;郭春燕;李永民【作者单位】河北北方学院药学系,河北张家口 075000;河北北方学院药学系,河北张家口 075000;河北北方学院药学系,河北张家口 075000【正文语种】中文【中图分类】R965【相关文献】1.siRNA沉默Drp1对鱼藤酮诱导的帕金森病模型细胞自噬和凋亡的影响 [J], 周鸿雁;张德元;申存周;郑一帆;陈玲2.鱼藤酮微球制备及其诱导大鼠帕金森病模型的初步研究 [J], 王英舟;刘梅芳;谢东锋;张春燕3.鱼藤酮PLGA纳米粒的制备及诱导大鼠帕金森病模型的实验研究 [J], 毛全高4.基于Nrf2/HO-1通路探讨石参有效成分对鱼藤酮诱导的帕金森病细胞模型的保护作用 [J], 赵燕芬;吴伟斌;梁结斐;梁少明;刘文华5.鱼藤酮诱导的帕金森病动物模型的研究进展 [J], 李莹莹;蓝秀建;朱振宇;皮荣标因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
一种新发现的脑肠肽——垂体腺苷酸环化酶激活肽(PACAP)
提 取 出一 种新 的多 肤
ATP
由于这 种 肤在 培养 的大 故称为 垂体腺 昔 酸 环 化
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胰 腺腺 泡 上 研究 的 结果 常用 的
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.
鼠垂 体 前 叶 细 胞 中 能 激 活 腺 昔 酸 环 化 酶 使 转变 为
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个术 语
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一 种 高 亲合 力 受体
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胰 液素 )
PH I
( 组异肤 )
PH
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一 种低亲合力 受 体 (
PA C A P3s
PACAP在肾脏中的保护作用
PACAP在肾脏中的保护作用【摘要】本文将介绍Pituitary Adenylate Cyclase-Activating Polypeptide（PACAP）在肾脏中的保护作用。
在正文部分中，将探讨PACAP对肾脏损伤的保护作用、对肾小管细胞保护作用的机制、对肾功能的保护作用、在肾脏疾病中的应用以及在肾脏移植中的作用。
研究发现，PACAP可以减轻肾脏损伤、保护肾小管细胞免受损伤、维护正常的肾功能，并有望成为治疗肾脏疾病的潜在药物。
在将展望PACAP在肾脏中的保护作用的研究前景，并强调其作为治疗肾脏疾病的潜在药物的重要性。
通过本文的阐述，深入了解PACAP在肾脏中的保护机制，对未来的研究和临床应用具有重要意义。
【关键词】PACAP, 肾脏, 保护作用, 肾小管细胞, 肾功能, 肾脏疾病, 肾脏移植, 研究前景, 潜在药物,治疗1. 引言1.1 PACAP在肾脏中的保护作用一、引言Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP)是一种重要的神经递质和神经调节因子，已被广泛研究其在神经系统中的作用。
除了神经系统，最近的研究表明PACAP在肾脏中也具有重要的保护作用。
肾脏是人体重要的排泄器官，对维持体内水电解质平衡和酸碱平衡起着关键作用。
保护肾脏健康对于人体的整体健康至关重要。
本文将就PACAP在肾脏中的保护作用进行深入探讨，并探讨其在肾脏疾病治疗和肾脏移植中的潜在应用，为未来PACAP在肾脏保护领域的研究提供参考和启示。
2. 正文2.1 PACAP对肾脏损伤的保护作用PACAP（Pituitary Adenylate Cyclase Activating Polypeptide）是一种神经肽，已经被证明在多个组织和器官中具有保护作用。
在肾脏中，研究表明PACAP能够对肾脏损伤起到保护作用。
1. 抗氧化作用：PACAP能够抑制氧化应激反应，减少自由基的生成，保护肾脏细胞免受氧化损伤。
鸢尾黄素可拮抗鱼藤酮诱导PC12细胞损伤
鸢尾黄素可拮抗鱼藤酮诱导PC12细胞损伤【摘要】目的：探讨鸢尾黄素对鱼藤酮诱导的PC12细胞氧化应激的保护作用及其可能机制。
方法：用鱼藤酮建立PC12细胞损伤模型，给予不同剂量的鸢尾黄素（5和10 μmol?L-1）预处理30 min后与鱼藤酮（1 μmol?L-1）共同孵育细胞24 h，采用CCK-8法检测细胞存活率，Hoechst 33258荧光染色观察细胞凋亡，NBT还原法检测细胞内活性氧类物质（ROS）水平，比色法检测细胞内总超氧化物歧化酶（SOD）的活性。
结果：与正常对照组相比，鱼藤酮（0.5、1和2 μmol?L-1）组细胞存活率都下降（P < 0.05），且呈剂量依耐性，而预处理5μmol?L-1和10 μmol?L-1鸢尾黄素30 min均可明显减轻1 μmol?L-1鱼藤酮对PC12细胞增殖活力的抑制（P < 0.05），改善鱼藤酮诱导的PC12细胞核固缩、裂解的现象，明显降低PC12细胞内ROS的含量（P < 0.05），明显增加PC12 细胞内SOD的活性（P < 0.05）。
结论：鸢尾黄素可拮抗鱼藤酮诱导的PC12细胞损伤，其机制可能与清除细胞内ROS，诱导抗氧化酶的活性有关。
【关键词】鸢尾黄素；鱼藤酮；PC12细胞；凋亡；氧化应激帕金森病（Parkinsons disease，PD）是一种常见的神经退行性疾病，在65岁以上人群发病率达到1%-3%，流行病学研究显示：环境因素在PD发病中起了重要作[1]。
鱼藤酮（Rotenone）是从鱼藤的根部提取的一种天然复合物，被广泛用作杀虫剂和鱼塘、水库清理剂。
研究证实鱼藤酮能抑制线粒体复合物I的活性，导致细胞对氧的利用障碍和能量产生不足，从而导致神经元细胞死亡；动物研究也表明鱼藤酮可导致黑质多巴胺能神经元变性，诱发帕金森样症状[2]。
大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞（pheochromocytoma，PC12）具有神经分泌细胞和神经元的性质，且PC12细胞在含有的酶类、膜受体及合成的递质等方面接近中脑多巴胺神经元，现已成为国内外研究PD的常用细胞模型[3]。
水溶性辅酶Q10对鱼藤酮致PC12细胞凋亡的保护作用及其机制
水溶性辅酶Q10对鱼藤酮致PC12细胞凋亡的保护作用及其机制江毓敏;李海宁;林邵青;陈燕燕;安静;马春换;宦楠楠;成江【摘要】目的探讨水溶性辅酶 Q10(CoQ10)对鱼藤酮(Rot)诱导帕金森病(PD)细胞模型的保护作用及其可能的机制,为CoQ10 用于PD的治疗提供理论依据.方法将对数生长期的PC12 细胞分为对照组、Rot组、CoQ10 组及 CoQ10治疗组;CCK8 检测细胞存活率;采用荧光探针2',7'-二氢二氯荧光黄双乙酸钠(DCFH-DA)使用荧光分光光度计检测细胞内活性氧(ROS)水平;Western blot检测CoQ10 对凋亡信号蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-9、active Caspase-3 及凋亡诱导因子(AIF)表达的影响.结果 Rot处理 24 h后的 PC12 细胞存活率显著降低(P＜0.01)并与剂量呈负相关,Rot引起 ROS水平升高(P＜0.01),CoQ10 可改善 Rot 处理诱导的PC12 细胞存活率降低(P＜0.01)及降低 ROS 水平(P＜0.01);Western blot实验表明CoQ10 可降低Rot引起的Caspase-9(P＜0.05)、active Caspase-3(P＜0.05)及Bax (P＜0.01)的表达增多,上调Bcl-2 的表达(P＜0.01);阻止 AIF向核内转移(P ＜0.05).结论水溶性CoQ10 对 Rot致PC1 2 细胞凋亡具有保护作用,机制可能是通过清除细胞内氧自由基改善细胞氧化应激状态,阻止 AIF 向核内转移,以及上调Bcl-2、下调Bax、同时降低 active Caspase-3 和Caspase-9 的表达而实现的.%Objective To investigate the protective effect and the underlying mechanism of water soluble coenzyme Q10 (CoQ10)against rotenone induced injury on PC12 cells model.Methods PC12 cells were cultured with rotenone,water-soluble CoQ1 0 was added to the culture media 3 hours prior to the rotenone incubation.We determined cell viability byCCK8;reactive oxygen species (ROS)was detected byspectrophotometer;and Bcl-2, Bax,active Caspase-3,Caspase-9 and apoptosis-inducing factor (AIF)were measured by Western blotting after 24-hour rotenone incubation.Results After the treatment by rotenone,cell viability decreased significantly (P＜0.01)and ROS level increased (P＜0.01).CoQ10 could improve PC12 cell viability (P＜0.01)and reduce the level of ROS (P＜0.01).Western blotting experiments showed that CoQ10 could reduce rotenone-induced Caspase-9 (P＜0.05),active Caspase-3 (P＜0.05)and Bax (P＜0.01)expressions,increase the expression of Bcl-2 (P＜0.01),and prevent nuclear translocation of AIF (P＜0.05).Conclusion CoQ10 has a protective effect on rotenone-induced apoptosis in PC12 cells,the mechanism of which may be through scavenging ROS in cells;decreasing caspase-9 ,active caspase-3 and Bax expressions;and increasing the expression of Bcl-2 ;and preventing AIF nuclear translocation.【期刊名称】《西安交通大学学报（医学版）》【年(卷),期】2018(039)004【总页数】5页(P514-518)【关键词】水溶性辅酶Q10;鱼藤酮;帕金森病;PC12细胞【作者】江毓敏;李海宁;林邵青;陈燕燕;安静;马春换;宦楠楠;成江【作者单位】宁夏医科大学临床医学院,宁夏银川 750004;宁夏医科大学总医院神经内科,宁夏银川 750003;宁夏医科大学临床医学院,宁夏银川 750004;宁夏医科大学临床医学院,宁夏银川 750004;宁夏医科大学临床医学院,宁夏银川 750004;宁夏医科大学临床医学院,宁夏银川 750004;宁夏医科大学临床医学院,宁夏银川750004;宁夏医科大学总医院神经内科,宁夏银川 750003【正文语种】中文【中图分类】R741.02帕金森病(Parkinson’s disease, PD)，又名震颤麻痹(paralysis agitans)，是一种常见于老年人的神经系统变性疾病，临床上以静止性震颤、运动迟缓、肌强直和姿势平衡障碍为主要特征。
人参二醇对鱼藤酮、MPP+诱导的PC12细胞损伤的作用
人参二醇对鱼藤酮、MPP+诱导的PC12细胞损伤的作用金晓蓉;孙馨;林筱洁;苗青;高瑞兰;方桂伦【摘要】目的观察人参二醇对鱼藤酮、MPP+诱导的大鼠嗜铬细胞瘤损伤的影响。
方法以大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞为研究对象，以鱼藤酮（0.3、1、3、10、30μmol/L）或MPP+（0.1、0.3、1、3mmol/L）诱导细胞损伤。
设阴性对照组、人参二醇对照组（10、25、50、75、100mg/L）、鱼藤酮（3μmol/L，24h）或MPP+（1mmol/L，48h）组，人参二醇（10、25、50、75、100mg/L）联合鱼藤酮（3滋mol/L）或MPP+（1mmol/L）组。
采用MTT法检测细胞增殖活性；PI和Hoechst 33342染色检测细胞坏死和凋亡；并以免疫组织化学测定细胞酪氨酸羟化酶（TH）的表达。
结果人参二醇（10、25、50、75、100mg/L）本身不会抑制PC12细胞增殖，其中50、75mg/L人参二醇还可促进细胞增殖；各浓度人参二醇对鱼藤酮诱导的细胞损伤均不具有保护作用；在MPP+处理诱导细胞损伤后，50、75mg/L人参二醇可提高细胞增殖活性，但人参二醇对细胞凋亡和坏死及TH的表达无影响。
结论人参二醇（50、75mg/L）对MPP+诱导的PC12细胞损伤有保护作用，其作用机制与促进细胞增殖有关；人参二醇对鱼藤酮诱导的细胞损伤无明显保护作用。
% Objective To evaluate the effects of panoxadiol on rat pheochromocytoma PC12 cel injury induced by rotenone or MPP+. Methods PC12 cel injury was induced by rotenone (0.3, 1, 3, 10, 30μmol/L,24h) or MPP+ (0.1, 0.3, 1, 3 mmol/L, 48h). Panoxadiol (10, 25, 50, 75,100 mg/L) was used to treat rotenone or MPP+induced PC12 cel s. Cel proliferation was assessed by MTT method, cel necrosis and apoptosis was detected by flow cytometry with PI (propidium iodide) and Hoechst 33342 stain, respectively. The expression of tyrosine hydroxylasewas measuared via immunohistostaining. Results Panoxadiol (10, 25, 50, 75, 100mg/L) had no affcts on proliferation of PC12 cel s and had no protection effects on cel injury induced by rotenone. When PC 12 cel injury was induced by MPP+, panoxadiol(50,75 mg/L) promoted cel proliferation but had no effects on necrocytosis and apoptosis and the expression of tyrosine hydroxylase. Conclusion Panoxadiol (50、75 mg/L) might have pro-tection effects on PC12 cel injury induced by MPP+, which may be related to facilitation of cel proliferation;however, panoxadiol has no protection effects on cel injury induced by rotenone.【期刊名称】《浙江医学》【年(卷),期】2013(000)012【总页数】4页(P1143-1146)【关键词】人参二醇;鱼藤酮;MPP+;大鼠;PC12细胞【作者】金晓蓉;孙馨;林筱洁;苗青;高瑞兰;方桂伦【作者单位】322000 义乌市中心医院内科;浙江省中医院血液病研究所;浙江省中医院血液病研究所;浙江省中医院血液病研究所;浙江省中医院血液病研究所;322000 义乌市中心医院内科【正文语种】中文【 Abstract】 Objective To evaluate the effects of panoxadiol on rat pheochromocytoma PC12 cell injury induced by rotenone or MPP+. Methods PC12 cell injury was induced by rotenone(0.3,1,3,10,30μmol/L，24h)or MPP+ (0.1,0.3,1,3 mmol/L,48h).Panoxadiol(10,25,50,75,100mg/L)was used to treat rotenone or MPP+induced PC12 cells.Cell proliferation was assessed by MTT method,cell necrosis and apoptosis was detected by flow cytometry with PI(propidium iodide)and Hoechst 33342 stain,respectively.The expression of tyrosine hydroxylase was measuaredvia immunohistostaining. Results Panoxadiol (10,25,50,75,100mg/L)had no affcts on proliferation of PC12 cells and had no protection effects on cell injury induced by rotenone.When PC 12 cell injury was induced byMPP+,panoxadiol(50,75 mg/L)promoted cell proliferation but had no effects on necrocytosis and apoptosis and the expression of tyrosine hydroxylase. Conclusion Panoxadiol(50、75 mg/L)might have protection effects on PC12 cell injury induced by MPP+,which may be related to facilitation of cell proliferation;however,panoxadiol has no protection effects on cell injury induced by rotenone.帕金森病（Parkinson disease，PD）是一种常见的中老年退行性神经系统疾病，病因复杂，致残率较高。
益智仁中的原儿茶酸对鱼藤酮损伤PC12细胞的保护作用
益智仁中的原儿茶酸对鱼藤酮损伤PC12细胞的保护作用刘叶明;郑甜甜;徐美娟;林景峰;孙淑华;李其久【摘要】建立鱼藤酮(rotenone)诱导的大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤细胞(Pheochromocytoma,PC12)损伤的类帕金森病细胞模型,探讨益智仁中的原儿茶酸(PCA)对该类帕金森病细胞模型的保护作用及其可能作用机制.采用四唑盐(MTr)方法检测细胞活力,并且采用乳酸脱氢酶(LDH)方法作为细胞活力的进一步验证;对于细胞形态变化采用Hoechst 33258染色法进行观察;采用细胞内常见的抗氧化酶试剂盒(超氧化物歧化酶(SOD),过氧化氢酶(CAT),谷胱苷肽过氧化物酶(GSH-Px))分别检测细胞内各抗氧化酶含量的变化;对于细胞内活性氧(ROS)水平的变化采用2',7'-二氯荧光素二乙酸(DCF-DA)进行检测;用Caspase-3/CPP32 Colorimetric 试剂盒检测细胞内Caspase-3的活性.将0.5μM鱼藤酮作用于PC12细胞48 h后,诱导其产生典型间接氧化应激过程并产生凋亡特征,益智仁中的1mM原儿茶酸对鱼藤酮诱导的PC12细胞损伤有明显的抗凋亡保护作用,其可能机制是增强细胞内源性抗氧化酶的活力,抑制活性氧的产生,阻止Caspase-3的激活途径,从而达到减少或抑制细胞凋亡的目的.【期刊名称】《辽宁大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2016(043)001【总页数】7页(P61-67)【关键词】原儿茶酸;鱼藤酮;氧化应激;凋亡;PC12细胞【作者】刘叶明;郑甜甜;徐美娟;林景峰;孙淑华;李其久【作者单位】大连诚泽检测有限公司,辽宁大连116011;辽宁大学生命科学院,辽宁沈阳116036;辽宁仙人洞国家级自然保护区管理局,辽宁庄河116407;辽宁仙人洞国家级自然保护区管理局,辽宁庄河116407;辽宁仙人洞国家级自然保护区管理局,辽宁庄河116407;辽宁大学生命科学院,辽宁沈阳116036【正文语种】中文【中图分类】Q26常见的中枢神经系统退行性疾病的病理学特征是选择性黑质致密部里的多巴胺能神经元凋亡或变性，帕金森病(Parkinsons disease,PD)就是其中的一种.在大多数天然有机杀虫剂中，鱼滕酮具有亲脂性的，并可透过血脑屏障，强烈抑制脑组织线粒体呼吸链复合体Ⅰ的活性，而且引起黑质-纹状体多巴胺的神经系统选择性的变性，增强多巴胺能神经元对氧化应激的敏感程度.大量研究表明[1-2]，由于物质的代谢失衡而导致的氧化应激在PD中起主要作用.大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤细胞(Pheochromocytoma,PC12)与多巴胺能神经元在生理生化特征方面有许多相似之处.能够表达多巴胺转运体,并分泌多巴胺[3]，是研究体外神经细胞损伤及保护最为广泛的细胞系.作为我国的四大南药之一的益智仁，以往被大多数人用在温和脾胃，预防腹泻，摄唾涎，固精缩尿等方面.经过现代药理学研究后表明，益智仁提取物还在强心，防癌，抗过敏，延缓衰老等方面有着特殊的药理作用.最近文献表明，从益智仁中已经首次提取单体活性化合物原儿茶酸，具有明显神经保护作用[4].本文的研究是采用不同浓度鱼藤酮对PC12细胞进行不同时间的孵育作用，考察其对PC12细胞增殖和凋亡的影响，以建立一种类帕金森病的细胞损伤模型.在鱼藤酮诱导的PC12细胞损伤之后，探讨原儿茶酸对其是否具有保护作用，并研究了其可能的药理作用机制，在防治由氧化应激介导的帕金森病药物开发中，可以将原儿茶酸作为主要成分之一而提供有力依据.1.1 材料大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞：采购于中科院上海细胞所细胞库；胎牛血清和DMEM培养基：采购于美国Gibco公司；青霉素和链霉素：采购于大连美罗制药；四唑盐，鱼藤酮，Hoechst 33258和碘化丙啶(propidium iodide，PI)，2′,7′-二氯荧光素二乙酸(2′,7′-dichlorofluorescin diacetate，DCF-DA)：采购于Sigma公司；Caspase-3/CPP32 Colorimetric检测试剂盒：采购于美国BioVision；LDH，SOD，CAT，GSH-Px检测试剂盒：采购于自南京建成生物工程研究所；益智仁：采购于大连中医药大厦；其余试剂为国产分析纯.益智仁中原儿茶酸的制备[4]：将3kg益智仁干粉采用95%乙醇室温渗漉，提取液通过减压蒸馏的方式，使其浓缩至浸膏，然后加水分散后，用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取，收集其中的乙酸乙酯相，并采用100~140目硅胶柱进行干法上样层析，洗脱液为氯仿-甲醇一系列浓度梯度，同时采用细胞活性跟踪实验，收集具有活性的层析组分并重新溶解于甲醇中，最后采用Sephadex LH-20凝胶层析，甲醇洗脱，重结晶后得到活性单体化合物PCA，即原儿茶酸(如图1所示)，用于实验.1.2 PC12细胞的培养及药物处理1.2.1 细胞培养在37 ℃，5% CO2的孵箱中培养PC12细胞，细胞培养基是DMEM基础上添加10%灭活胎牛血清,100 U/mL青霉素,100 mg/L链霉素，培养48 h后换液.在细胞传代时，首先吸去培养瓶中的培养基，并加入适量的0.25%胰蛋白酶消化后轻轻吹打，达到吹散细胞团的目的，并取对数生长期的细胞进行以下实验.1.2.2 鱼藤酮对PC12损伤模型的建立在96孔培养板中接种细胞，每孔接种100 μL，接种密度为1×105个/mL，培养24 h后，在细胞培养基中添加不同量的鱼藤酮(事先用DMSO溶解，终浓度小于0.1%)，使其终浓度分别为0.01，0.05，0.1，0.25，0.5μM，并在孵箱中分别继续培养细胞24 h和48 h后，终止培养，采用MTT法检测细胞的活力.1.2.3 原儿茶酸的药物干预研究不同浓度原儿茶酸对鱼藤酮诱导的PC12损伤细胞时的影响，原儿茶酸预孵0.5 h后，再加入0.5 μM鱼藤酮处理，共同培养48 h，采用MTT法检测细胞活力，其中，原儿茶酸终浓度分别为0.1，0.2，0.5，1.0 mM.1.3 MTT法检测细胞存活率[5]在96孔培养板中接种细胞，每孔100 μL，接种密度为1×105个/mL，经过药物处理终止培养前，每孔加入MTT，使其终浓度为0.5 mg/mL，并继续在37 ℃，5% CO2孵箱中培养4 h后，将培养液吸出，在每孔中加入100 μL的DMSO，待紫色结晶物质完全溶解后，在570 nm处，参比波长设定为630 nm，采用M450型酶标仪测定每孔吸光值，计算细胞存活率.细胞存活率=(各浓度组吸光值/对照组吸光值)×100%1.4 细胞内乳酸脱氢酶(LDH)漏出率的测定在24孔培养板中接种细胞，每孔500 μL，接种密度为1×105个/mL，在培养24 h后加鱼藤酮于培养孔中，使其终浓度为0.5 μM，同时分别加入终浓度为0.1，0.2，0.5，1.0 mM的原儿茶酸，再培养48 h后，收集培养液.实验按照LDH检测试剂盒说明操作，通过如下公式计算细胞培养液的LDH漏出率.LDH漏出率=(培养液OD值)/(培养液OD值+细胞匀浆液OD值)×100%1.5 Hoechst 33258染色的细胞形态学变化观察参照文献[6]，细胞经过不同处理作用48 h后终止培养，将培养液吸出，4%多聚甲醛固定30 min，吸去多聚甲醛后以PBS洗3次，每次5 min.加入Hoechst 33258至终浓度为10 μg/mL，37 ℃避光染色15 min.荧光显微镜观察、拍照.1.6 细胞内相关抗氧化酶活力变化在24孔培养板中接种细胞，每孔500 μL，接种密度为1×105个/mL，在培养24 h后加鱼藤酮于培养孔中，使其终浓度为0.5 μM，同时加入终浓度为1.0 mM 的原儿茶酸，再培养48 h 后，收集培养液和细胞，按照SOD，CAT，GSH-Px检测试剂盒说明书，采用Bradford(1976)[7]的方法测定蛋白含量.1.7 细胞内活性氧(ROS)水平变化参照文献[8-9]，PC12细胞经过不同处理后，加入DCF-DA(终浓度1 mM)在37 ℃，5% CO2的孵箱中孵育PC12细胞60分钟后，用PBS清洗三次.细胞经1 000 g离心5 min，并去掉上清液后，采用1%TritonX-100溶解，在激发波长480 nm，发射波长540 nm处，应用荧光分光光度仪测定细胞内ROS水平. 1.8 细胞内的Caspase-3活性变化收集不同处理组的细胞(大约2×106个)分别于1.5 mL离心管中，并加入50 μL 预冷的Cell Lysis Buffer，在冰上孵育10 min；于4 ℃下，10 000 g离心1 min 后，缓慢将上清液(即胞质提取液)吸取至新的1.5 mL离心管中，放在冰上保存待用；对样品中蛋白含量进行测量，并根据所测每个样品的蛋白浓度，分别稀释一定量的蛋白(50~200 μg)至50 μL的Cell Lysis Buffer中，进行下一步的实验；加入50μL的2×Reaction Buffer(含有10 mM DTT)，再加入5 μL的4 mM DEVD-pNA底物(终浓度200 μM)，在37℃孵育1~2 h后，转移至96孔板中，用酶标仪在405 nm处测定其吸光值，并采用Bradford(1976)[7]的方法测定蛋白含量.1.9 统计学处理采用统计软件Origin 7.5对实验结果进行统计分析，数据用表示，组间比较用t 检验，P< 0.05为差异显著，P< 0.01为差异极显著.2.1 鱼藤酮对PC12细胞的损伤作用如图2所示，低浓度鱼藤酮(0.01 μM与0.05 μM)对PC12细胞的损伤不明显，但是当浓度超过0.1 μM以上时，PC12细胞存活率降低，并且鱼藤酮损伤程度呈时间、剂量依赖性，培养时间越长，即当鱼藤酮添加浓度越大，其诱导的细胞损伤程度越大.其中，终浓度0.5 μM的鱼藤酮处理48 h后，细胞存活率降低到(40.08±2.28)%，接近于半数细胞损伤，所以选择0.5 μM鱼藤酮作用于PC12细胞48 h，以考察原儿茶酸作用于这种损伤细胞的影响.2.2 原儿茶酸对鱼藤酮损伤的PC12细胞活力的影响如图3所示，不同浓度的原儿茶酸保护细胞的存活率都高于单独鱼藤酮损伤组，说明原儿茶酸可以抑制鱼藤酮对PC12细胞的损伤，其中，0.5 mM及1.0 mM保护组与损伤组相比有极显著差异，具有明显的保护作用.2.3 原儿茶酸对鱼藤酮损伤的PC12细胞胞内LDH漏出率的影响如图4所示，在终浓度0.5 μmol鱼藤酮处理PC12细胞48 h后，导致了细胞中LDH的漏出率为(64.26±2.11)%，而对照细胞的漏出率仅为(2.51±1.10)%.随着原儿茶酸的加入，可以剂量依赖地减轻了LDH的漏出，0.1，0.2，0.5，1.0 mM的原儿茶酸分别使细胞中LDH的漏出减少到(54.36±2.11)%，(50.38±2.00)%，(32.36±1.60)%和(17.36±2.00)%.因此，这更深层次揭示了在鱼藤酮造成的PC12细胞质膜破坏而生存力丧失后，原儿茶酸能够减弱这种影响，并减少LDH从细胞中漏出.2.4 Hoechst 33258染色观察细胞凋亡如图5所示，在荧光显微镜下观察，正常对照组(如图5A所示)中，PC12的染色质分布均匀，显示出极淡的荧光，当0.5 μM鱼藤酮与PC12细胞共同孵育48 h 后，有大量的细胞核呈致密浓染或碎块状浓染的固缩形态，显示出较强的荧光，产生少量凋亡小体(如图5B所示)，发生了明显的凋亡特征.但是在同时加入1 mM原儿茶酸(如图5C所示)时，可以看出细胞荧光强度明显减弱，染色体浓缩以及出现凋亡小体的细胞减少，细胞核状态接近于正常对照组，这揭示了原儿茶酸能抑制鱼藤酮诱导的PC12细胞凋亡.2.5 原儿茶酸对胞内相关抗氧化酶活性的影响如图6所示，与正常对照组相比，单独添加1 mM原儿茶酸没有影响PC12细胞中SOD，CAT和GSH-Px的活性，而0.5 μM鱼藤酮处理组同时降低了这三种抗氧化酶的活性.当细胞在鱼藤酮和原儿茶酸同时处理后，比较单独鱼藤酮处理组，尽管GSH-Px的活性没有明显的变化，但SOD和CAT的活性得到了明显的提高.而且与正常对照组相比，在0.5 μM鱼藤酮和1 mM原儿茶酸的共同孵育48 h后，CAT的活性提高了103.43%.这个结果提示：在单独添加原儿茶酸处理后，虽然对正常PC12细胞内的抗氧化酶表达没有影响，但在鱼藤酮刺激下，能够激活抗氧化酶表达途径，对由于鱼藤酮所引起的细胞内抗氧化酶活性降低起到明显抑制作用. 2.6 原儿茶酸对胞内活性氧(ROS)的水平的影响如图7所示，与正常对照组相比，当PC12细胞被加入0.5 μM鱼藤酮处理48 h 后，引起细胞内ROS水平增加到(225.54±7.89)%，而添加原儿茶酸后，其明显抑制了ROS的形成，0.1，0.2，0.5及1.0 mM的原儿茶酸分别使ROS水平剂量依赖地下降至(217.15±12.24)%，(199.92±10.10)%，(174.91±11.53)%和(136.63±10.05)%.这说明损伤的PC12细胞受到氧化应激程度，随原儿茶酸浓度增加而呈明显地剂量依赖性减弱.2.7 原儿茶酸对胞内的Caspase-3活性的影响如图8所示，与正常对照组相比，当PC12细胞被加入0.5 μM鱼藤酮处理48 h 后，细胞内caspase-3活性增加到正常对照组的(242.34±12.74)%，而原儿茶酸的加入明显抑制了caspase-3的活性，0.1，0.2，0.5，1.0 mM的原儿茶酸分别使Caspase-3的活性下降至(235.39±13.49)%，(220.96±13.02)%，(160.39±12.93)%及(130.59±12.87)%.这说明原儿茶酸抑制caspase-3的活性呈明显地剂量依赖性.最近的许多文献表明,神经退行性疾病发病过程中，神经元凋亡或缺失发挥着重要作用[10],但是其凋亡或缺失的原因和机制还没有完全被阐明，普遍存在的一种观点认为，这与神经元在受到氧化应激过程中的敏感程度强弱有密切关系.因此，直接或间接地增强机体抗氧化防御体系，减少或抑制细胞凋亡是目前防治神经退行性疾病的基本策略之一.本实验采用不同浓度的鱼藤酮，在体外建立诱导PC12细胞凋亡的类帕金森病细胞损伤模型之后,探讨原儿茶酸在体外对该模型的保护作用.通过PC12细胞与鱼藤酮共同孵育,采用四唑盐(MTT)方法、乳酸脱氢酶(LDH)方法及细胞核形态观察等方法，证明鱼藤酮诱导的PC12细胞凋亡是典型的类帕金森病细胞损伤模型，并进一步通过胞内抗氧化酶活性，活性氧水平，及Caspase-3活性分析实验表明，推测该凋亡可能Caspase依赖的线粒体通路有关.实验结果表明，当0.5 μM鱼藤酮作用于PC12细胞48 h后，细胞质膜被破坏，乳酸脱氢酶(LDH)漏出率明显升高；从形态上观察，细胞性状发生变化，皱缩成圆形或椭圆形，在胞浆中可见到存在的颗粒及空泡，并且细胞核中的DNA发生凝集和断裂，通过Hoechst 33258染色法可以观察到高亮蓝色荧光，并有凋亡小体存在,表现出明显的凋亡特征.本课题组先前实验显示，益智仁中的原儿茶酸在细胞[11-12]与动物[13]水平上具有明显的神经保护作用，本文的研究揭示，在鱼藤酮诱导的PC12细胞凋亡过程中，原儿茶酸起到明显地抑制作用.当加入1.0 mM原儿茶酸时,通过Hoechst 33258染色法观察到蓝色荧光明显减弱,出现凋亡小体的细胞明显减少，细胞内源性抗氧化酶活性由于鱼藤酮导致的氧化应激所激发而增强，产生的活性氧含量受到明显抑制，并且Caspase-3的激活途径被阻止.因此，原儿茶酸对鱼藤酮诱导的PC12细胞保护作用的可能机制与以下几个方面有关，一是增强细胞内源性抗氧化酶的活力；二是抑制活性氧的产生；三是阻止Caspase-3的激活途径，从而达到减少或抑制细胞凋亡的目的.【相关文献】[1]Zhang J,Perry G,Smith MA,et al.Parkinson′s disease is associated with oxidative damage to cytoplasmic DNA and RNA in substantia nigra neurons[J].Am J Pathol,1999,154(5):1423-1429.[2]Yoritaka A,Hattori N,Mori H,et al.An immunohistochemical study on manganese superoxide dismutase in Parkinson′s disease[J].J Neurol Sick,1997,148(2):181-186.[3]Kadota T,Yamaai T,Saito Y,et al.Expression of dopamine transporter at the tips of growing neuritis of PC12 cells[J].J Histo-chem Cytochem,1996,44(9):989-996.[4] An L J,Guan S,Shi G F,et al.Protocatechuic acid from Alpinia oxyphylla against MPP+-induced neurotoxicity in PC12 cells[J].Food and Chemical Toxicology,2006,44(3):436-443.[5]Lourdes Massieu,Julio Moran,Yves Christen.Effect of Ginkgo biloba(EGb 761)on staurospor ine-induced neuronal death and caspase activity in cortical cultured neurons[J].Brain Research ,2004,1002:76-85.[6] Chen A Y,Yu C,Bodley A,et al.A new mammalian DNA topp-isomerase I poison Hoechst 33258:cytotoxicity and drug resistance in human cell culture[J ].Cancer Res,1993,53(6):1332-1337.[7]Bradford MM.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding[J].Analyt Biochem,1976,72(3):248-254.[8]Wang H,Joseph J A.Quantifying cellular oxidative stress by dichlorofluorescein assay using microplate reader[J].Free Radicals in Biology and Medicine,1999,27:612-616.[9] Lautraite S,Bigot-Lasserre D,Bars R,et al.Optimization of cell-based assays for medium throughput screening of oxidative stress[J].Toxicology in Vitro ,2 003,17:207-220.[10]Nirit Lev,Eldad Melamed,Daniel Offen.Apoptosis and Parkinson′s disease[J].Progress in Ne uro-psychopharmacology & Biological Psychiatry,2003,27:245-250.[11] Guan S,Jiang B,Bao Y M,et al.Protocatechuic acid suppresses MPP+-induced mitochondrial dysfunction and apoptotic cell death in PC12 cells[J].Food and Che mical Toxicology,2006,44:1659-1666.[12]Guan S,Bao Y M,Jiang B,et al.Protective effect of protocatechuic acid from Alpinia oxyphyll a on hydrogen peroxide-induced oxidative PC12 cell death[J].European Journal of Pharmacology,2006,538(1-3):73-79.[13]Shi G F,An L J,Jiang B,et al.Alpinia protocatechuic acid protects against oxidative damage i n vitro and reduces oxidative stress in vivo[J].Neuroscience Letters,2006,403:206-210.。
鱼藤酮对慢性帕金森病小鼠中脑黑质致密部α-突触核蛋白表达的影响
鱼藤酮对慢性帕金森病小鼠中脑黑质致密部α-突触核蛋白表达的影响万金城;张玉平;龙汉春;赵臣勇;周长青;彭国光【摘要】目的观察长期小剂量鱼藤酮暴露对C57BL小鼠行为学和中脑黑质区病理学的改变,并观察鱼藤酮对中脑黑质区α-突触核蛋白(α-syn)表达的影响.方法将雄性C57BL小鼠随机分为鱼藤酮组(n=14)和对照组(n=10).鱼藤酮组给予背部皮下注射鱼藤酮1mg/kg,1次/d,连续注射40d;对照组经相同方式给予相同体积的DMSO和生理盐水混合液.采用自由活动实验和游泳实验评价小鼠的行为学改变.免疫组化法检测小鼠中脑黑质致密部酪氨酸羟化酶(TH)和α-syn的表达,RT-PCR检测α-syn mRNA的表达情况.结果行为学观察发现,鱼藤酮组自由活动实验和游泳实验显示,末次给药后3d鱼藤酮组和对照组小鼠穿梭距离分别为165.4±5.5、257.6±4.6格,下肢站立次数分别为20.3±3.3、34.9±3.5次;游泳实验活动能力评分分别为1.8±0.4、2.8±0.2;两组间差异均有统计学意义(P<0.05).免疫组化检测发现,鱼藤酮组TH阳性细胞计数(18.5±4.0个)比对照组(24.2±2.4个)明显减少(P<0.05).鱼藤酮组中脑黑质部存在α-syn阳性包涵体,且α-syn阳性细胞的积分光密度值(2160.00α±86.20)较对照组(1698.00±78.22)明显增加(P<0.01).结论慢性鱼藤酮中毒能诱导C57BL小鼠发生PD样的行为学和病理学改变,导致中脑黑质TH阳性多巴胺能神经元减少,促使α-syn表达增高并聚集.【期刊名称】《解放军医学杂志》【年(卷),期】2010(035)006【总页数】4页(P667-670)【关键词】帕金森病;黑质;鱼藤酮;突触核蛋白【作者】万金城;张玉平;龙汉春;赵臣勇;周长青;彭国光【作者单位】400016,重庆,重庆医科大学附属第一医院神经内科;400016,重庆,重庆医科大学附属第一医院神经内科;400016,重庆,重庆医科大学附属第一医院神经内科;400016,重庆,重庆医科大学附属第一医院神经内科;400016,重庆,重庆医科大学附属第一医院神经内科;400016,重庆,重庆医科大学附属第一医院神经内科【正文语种】中文【中图分类】R74帕金森病(Parkinson′s disease,PD)是中老年人最常见的神经系统变性疾病之一,临床上以静止性震颤、运动迟缓、肌强直和姿势步态异常为主要表现,其主要病理特征是黑质多巴胺(DA)能神经元变性缺失及残存的DA能神经元内嗜酸性包涵体-路易小体(Lewy's body)形成。
牛蒡苷元联合帕金森药物对鱼藤酮诱导的PC12细胞损伤的保护作用
牛蒡苷元联合帕金森药物对鱼藤酮诱导的PC12细胞损伤的保护作用张娜;窦德强【摘要】目的:研究牛蒡苷元对鱼藤酮诱导的PC12细胞损伤的保护作用并探讨其联合阳性药(甲磺酸溴隐亭或盐酸苯海索)是否具有协同作用.方法:通过不同浓度牛蒡苷元和阳性药处理鱼藤酮诱导的PC12细胞,采用MTT法测定细胞存活率,评价牛蒡苷元和阳性药对PD细胞模型的保护作用,并通过CompuSyn软件计算两药的联合药物指数(combination index,CI).结果:牛蒡苷元、甲磺酸溴隐亭和盐酸苯海索均可显著提高鱼藤酮损伤PC12细胞的存活率(P≤0.01),周-特氏联合指数法表明,牛蒡苷元与甲磺酸溴隐亭(比例1:4和1:2)、与盐酸苯海索(比例1:1和2:1)联合使用时的CI均大于1,即表现为拮抗作用.结论:牛蒡苷元与甲磺酸溴隐亭、牛蒡苷元与盐酸苯海索对鱼藤酮诱导的PC12细胞模型的无协同保护作用,反而呈现出一定的拮抗作用.【期刊名称】《神经药理学报》【年(卷),期】2017(007)003【总页数】5页(P1-5)【关键词】牛蒡苷元;甲磺酸溴隐亭;盐酸苯海索;联合;拮抗作用【作者】张娜;窦德强【作者单位】辽宁中医药大学药学院,大连,116600,中国;辽宁中医药大学药学院,大连,116600,中国【正文语种】中文【中图分类】R285.5帕金森病（Parkinson’s disease， PD）是一种常见的神经退行性疾病，主要表现为姿势异常、静止性震颤、运动减少和肌强直［1］。
目前临床仍以药物治疗为主，包括左旋多巴、单胺氧化酶抑制剂、抗胆碱药物、儿茶酚对甲基转移酶抑制剂以及中医中药等［2-6］。
西药虽可取得一定疗效，但随着治疗时间的延长，其疗效逐渐减退，而中医中药治疗PD疗效越来越得到临床重视［7-8］。
牛蒡苷元（arctigenin）是牛蒡子（Fructus Arctii）中较早分离鉴定出的木脂素类化合物，可以与神经毒素红藻氨酸的受体结合，并能消除谷氨酸盐产生的自由基，降低神经元的过氧化水平，有较强的神经保护作用［9］。
瓜子金皂苷己对鱼藤酮损伤PC-12细胞的保护作用及其对CREB的影响
瓜子金皂苷己对鱼藤酮损伤PC-12细胞的保护作用及其对CREB的影响吴苗苗;苑玉和;陈乃宏【摘要】Objective:To investigate the effect of polygalasaponin F(PS-F)on the PC-12 cells insulted by rotenone and the expression of CREB. Methods:The cell morphology was observed by inverted microscope. Caspase 3 activity was determined by caspase 3 activity assay kit. The expression of CREB was examined by luciferase reporter assay system. Results:When exposed to 4μmol·L-1 rotenone,a lot of PC-12 cells were apoptotic,and the activity of caspase 3 was increased significantly. When treated with PS-F,the damage of the cells was reduced significantly and the caspase 3 activity was decreased significantly. PS-F could increase the expression of CREB. Conclusion:PS-F protects PC-12 cells against apoptosis induced by rotenone and the neuroprotective effect may be related to increasing the expression of CREB.%目的：观察瓜子金皂苷己（polygalasaponin F，PS-F）对鱼藤酮损伤的PC-12细胞的保护作用及其对cAMP反应元件结合蛋白（cAMP response element binding protein，CREB）表达的影响。
鱼藤酮对大鼠星形胶质细胞CaMKⅡ基因和蛋白表达的影响
鱼藤酮对大鼠星形胶质细胞CaMKⅡ基因和蛋白表达的影响刘辉;郭魁亮;董兆君【期刊名称】《中国工业医学杂志》【年(卷),期】2008(21)2【摘要】目的研究鱼藤酮对大鼠原代培养星形胶质细胞钙/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)活性的影响。
方法MTT法检测染毒星形胶质细胞活力,激光共聚焦结合Fluo-4荧光法动态测定细胞内游离钙浓度([Ca2+]i),采用RT-PCR技术检测CaMKⅡα和CaMKⅡβmRNA的表达,Western-blot技术观察磷酸化CaMKⅡ蛋白活性的变化。
结果1.0和2.0μmol/L鱼藤酮染毒时星形胶质细胞活力明显降低,染毒星形胶质细胞[Ca2+]i呈浓度依赖性升高,CaMKⅡα亚基mRNA明显下调(P<0.05),CaMKⅡ蛋白活性显著降低(P<0.01)。
结论鱼藤酮染毒星形胶质细胞内游离钙浓度的升高,CaMKⅡ基因表达和蛋白活性显著降低,可能是其诱导神经细胞变性损伤的重要原因之一。
【总页数】4页(P72-75)【关键词】鱼藤酮;星形胶质细胞;钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)【作者】刘辉;郭魁亮;董兆君【作者单位】白求恩军医学院卫勤教研室;第三军医大学毒理学教研室【正文语种】中文【中图分类】R99【相关文献】1.细胞松弛素D对大鼠脊髓星形胶质细胞水通道蛋白和内向整流性钾通道4.1基因表达的影响 [J], 杜文佳;汪玉良;党跃修;雷栓虎;黄良增;汪静;马靖琳;安丽萍2.NMDA受体2B亚单位反义寡核苷酸对缺血性脑损伤影响的实验研究/电针对脊髓损伤后星形胶质细胞增生的影响/微囊化兔坐骨神经组织移植对大鼠脊髓损伤后神经元凋亡的影响/微囊化异种坐骨神经组织细胞移植对大鼠脊髓损伤后生长相关蛋白-43表达的影响 [J],3.碱性成纤维细胞生长因子转基因治疗对放射性脑损伤大鼠星形胶质细胞相关蛋白表达的影响 [J], 刘运林4.柴胡三参胶囊对缺血性心律失常大鼠心肌组织CaMKⅡ蛋白及CaMKⅡ-mRNA 表达的影响 [J], 刘建和; 杨成龙; 袁恒佑; 潘健彬; 肖冰凌; 杨艳萍5.三七总皂甙对吗啡戒断大鼠海马组织CaMK Ⅱ活性及CaMK Ⅱ α亚基蛋白表达的影响 [J], 牛增强;闫玉仙;马春玲;丛斌;余磊;倪志宇;董玫因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。