实验二.培养基的配制及灭菌

实验二培养基的配制及灭菌一、实验目的：1. 掌握常用培养基的制备方法；2. 了解培养基的成分、类型及特点；3. 学会玻璃仪器的洗涤和灭菌前的准备工作。

4.了解培养基的配制原理和方法，掌握其配制过程和分装方法。

二、实验原理人工配制的培养基是植物组织培养的营养基础，不同材料对培养基的要求不尽相同，适当地设计和选用培养基对组织培养是至关重要的，一个完整的培养基配方应包含有无机盐、有机营养、水、植物生长调节剂、琼脂及其他成分。

培养基的主要成分的详细内容见课本p26~29。

为了省时和减少多次称量的误差，一般先将药品配制成浓缩一定倍数的母液，用时稀释，储存于冰箱低温（2~4摄氏度）中待用。

基本培养基有8中母液，即大量元素母液、微量元素母液、有机物母液、钙盐母液、铁盐母液、肌醇母液、镁元母液、生长调节物质母液，基本培养基的配制方法有两种：一是可以将培养基的每种成分配成单一化合物的母液，便于配制不同种类的基本培养基时使用；二是配成几种不同的混合液，这样在大量配制同一种培养基时更省时、省力。

在配制母液时应注意防止沉淀产生。

绝大多数生长调节物质不溶于水，可以加热并不断搅拌促使溶解，必要时加入稀酸或稀碱等物质促溶。

各类植物生长调节物质的用量极小,它们对外植体愈伤组织的诱导和根、芽等器官分化起着重要和明显的调节作用。

通常使用的浓度单位是mg/L。

配制好的培养基应在24h之内完成灭菌工作，以免造成杂菌大量繁殖。

灭菌方法有：高温高压灭菌、过滤除菌、射线除菌等方法。

培养基常采取高压灭菌的方法，灭菌时间一般是在0.105MPa压力下，温度121摄氏度时，灭菌时间应根据容积的体积确定，所需最少时间见课本P32表2ˉ2。

培养基必需保证绝对无菌，否则因其营养丰富细菌、真菌极易滋生而导致植物死亡。

灭菌后的培养基不宜马上使用，以免造成培养材料的损失。

（一）、组成培养基的五类成分目前，大多数培养基的成分是由无机营养物、碳源、维生素、生长调节物质和有机附加物等五类物质组成的。

1.无机营养物无机营养物主要由大量元素和微量元素两部分组成，大量元素中，氮源通常有硝态氮或铵态氮，但在培养基中用硝态氮的较多，也有将硝态氮和铵态氮混合使用的。

磷和硫则常用磷酸盐和硫酸盐来提供。

钾是培养基中主要的阳离子，在近代的培养基中，其数量有逐渐提高的趋势。

而钙、钠、镁的需要则较少。

培养基所需的钠和氯化物，由钙盐、磷酸盐或微量营养物提供。

微量元素包括碘、锰、锌、钼、铜、钴和铁。

培养基中的铁离子，大多以螯合铁的形式存在，即FeSO4与Na2—EDTA(螯合剂)的混合。

2.碳源培养的植物组织或细胞，它们的光合作用较弱。

因此，需要在培养基中附加一些碳水化合物以供需要。

培养基中的碳水化合物通常是蔗糖。

蔗糖除作为培养基内的碳源和能源外，对维持培养基的渗透压也起重要作用。

3.维生素在培养基中加入维生素，常有利于外植体的发育。

培养基中的维生素属于B族维生素，其中效果最佳的有维生素B1、维生素B6、生物素、泛酸钙和肌醇等。

4.有机附加物包括人工合成或天然的有机附加物。

最常用的有酪朊水解物、酵母提取物、椰子汁及各种氨基酸等。

另外，琼脂也是最常用的有机附加物，它主要是作为培养基的支持物，使培养基呈固体状态，以利于各种外植体的培养。

5.生长调节物质常用的生长调节物质大致包括以下三类：(1)植物生长素类。

如吲哚乙酸(IAA)、萘乙酸(NAA)、2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)。

(2)细胞分裂素。

如玉米素(Zt)、6-苄基嘌呤(6-BA或BAP)和激动素(Kt)。

(3)赤霉素。

组织培养中使用的赤霉素只有一种，即赤霉酸(GA3)。

（二）、几种常用培养基特点组织培养是否成功，在很大程度上取决于对培养基的选择。

不同培养基有不同特点，适合于不同的植物种类和接种材料。

开展组织培养活动时，应对各种培养基进行了解和分析，以便能从中选择使用。

下面介绍组织培养几种常用培养基的配方见表9－1。

培养基中的激素种类和数量，随着不同培养阶段和不同材料而有变化，因此各配方中均不列入。

(1) MS培养基：MS培养基是目前普遍使用的培养基。

它有较高的无机盐浓度，对保证组织生长所需的矿质营养和加速愈伤组织的生长十分有利。

由于配方中的离子浓度高，在配制、贮存、消毒等过程中，即使有些成分略有出入，也不致影响离子间的平衡。

MS固体培养基可用来诱导愈伤组织，或用于胚、茎段、茎尖及花药培养，它的液体培养基用于细胞悬浮培养时能获得明显成功。

这种培养基中的无机养分的数量和比例比较合适，足以满足植物细胞在营养上和生理上的需要。

因此，一般情况下，无须再添加氨基酸、酪蛋白水解物、酵母提取物及椰子汁等有机附加成分。

与其它培养基的基本成分相比，MS培养基中的硝酸盐、钾和铵的含量高，这是它的明显特点。

(2) B5培养基：B5培养基的主要特点是含有较低的铵，这是因为铵可能对不少培养物的生长有抑制作用。

经过试验发现，有些植物的愈伤组织和悬浮培养物在MS培养基上生长得比B5培养基上要好，而另一些植物，在B5培养基上更适宜。

（3） White培养基1943年由White设计，1963年做了改良，是一个无机盐类浓度较低的培养基。

其使用也很广泛，特别适合生根培养和幼胚培养。

(4)SH培养基1972年由Schenk和Hidebrandt设计，主要特点与B5相似，不用（NH4）2SO4，而改用NH4H2PO4，无机盐浓度较高的培养基。

在不少单子叶和双子叶植物上使用效果好。

(5) N6培养基：N6培养基特别适合于禾谷类植物的花药和花粉培养，在国内外得到广泛应用。

在组织培养中，经常采用的还有怀特(While，1963)培养基、尼许(Nitsch，1951)培养基等。

它们在基本成分上大同小异。

怀特培养基由于无机盐的数量比较低，更适合木本植物的组织培养。

三、实验材料：1.MS培养基母液、植物生长调节剂母液、蔗糖、琼脂、蒸馏水、0.1mol/L NaOH 、0.1mol/LHCL。

2.仪器与用具：天平（电子天平和粗天平）、酸度计或精密pH试纸、水浴锅、电磁炉、高压蒸汽灭菌器、量筒、胶头滴管、移液管及移液管架、吸耳球、烧杯、培养瓶、铝锅、分装器、标签纸或记号笔、剪刀、镊子等。

四、实验步骤（一）、培养液的配制1.制备母液为了避免每次配制培养基都要对几十种化学药品进行称量，应该将培养基中的各种成分，按原量10倍、100倍或1000倍称量，配成浓缩液，这种浓缩液叫做母液。

这样，每次配制培养基时，取其总量的1/10、1/100、1/1000，加以稀释，即成培养液。

现将培养液中各类物质制备母液的方法说明如下。

(1) 大量元素。

大量元素包括硝酸铵等用量较大的几种化合物。

制备时，按表中排列的顺序，以其10倍的用量，分别称出并进行溶解，以后按顺序混在一起，最后加蒸馏水，使其总量达到1升，此即大量元素母液。

(2) 微量元素。

因用量少，为称量方便和精确起见，应配成100倍或1000倍的母液。

配制时，每种化合物的量加大100倍或1000倍，逐次溶解并混在一起，制成微量元素母液。

(3) 铁盐。

铁盐要单独配制。

由硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)5.57克和乙二胺四乙酸二钠(Na—EDTA)7.45克溶于1升水中配成。

每配1升培养基，加铁盐5毫升。

(4) 有机物质。

主要指氨基酸和维生素类物质。

它们都是分别称量，分别配成所需的浓度(0.1～1.0毫克/毫升)，用时按培养基配方中要求的量分别加入。

(5) 植物激素。

最常用的有生长素和细胞分裂素。

这类物质使用浓度很低，一般为0.01～10毫克/升。

可按用量的100倍或1000倍配制母液，配制时要单个称量，分别贮藏。

配制植物生长素时，应先按要求浓度称好药品，置于小烧杯或容量瓶中，用1～2毫升0.1N(克当量浓度)氢氧化钠溶解，再加蒸馏水稀释至所需浓度。

配制细胞分裂素时，应先用少量0.5或1N的盐酸溶解，然后加蒸馏水至所需量。

以上各种混合液(母液)或单独配制药品，均应放入冰箱中保存，以免变质、长霉。

至于蔗糖、琼脂等，可按配方中要求，随称随用。

试剂配方：1、大量元素(母液Ⅰ) mg／LNH4NO3 16500KNO3 19000CaCl2·2H2O 4400MgSO4·7H2O 3700KH2PO4 17002、微量元素(母液Ⅱ)KI 83H3BO3 620MnSO4·4H2O 2230ZnSO4·7H2O 860Na2MoO4·2H2O 25CuSO4·5H2O 2.5CoCl2·6H2O 2.53、铁盐(母液Ⅲ)FeSO4·7H2O 2780Na2-EDTA·2H2O 37304、有机成分(母液Ⅳ)肌醇10000烟酸50盐酸吡哆醇(维生素B6) 50盐酸硫胺素(维生素B1) 10甘氨酸200注意：以上各种营养成分的用量，除了母液Ⅰ为20倍浓缩液外，其余的均为200倍浓缩液。

上述几种母液都要单独配成1 L的贮备液。

母液Ⅰ、母液Ⅱ及母液Ⅳ的配制方法是：每种母液中的几种成分称量完毕后，分别用少量的蒸馏水彻底溶解，然后再将它们混溶，最后定容到1 L。

母液Ⅲ的配制方法是：将称好的FeSO4·7H2O和Na2-EDTA·2H2O分别放到450 mL蒸馏水中，边加热边不断搅拌使它们溶解，然后将两种溶液混合，并将pH调至5.5，最后定容到1 L，保存在棕色玻璃瓶中。

各种母液配完后，分别用玻璃瓶贮存，并且贴上标签，注明母液号、配制倍数、日期等，保存在冰箱的冷藏室中。

MS培养基中还需要加入2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）、萘乙酸（NAA）、6 苄基嘌呤（6-BA）等植物生长调节物质，并且分别配成母液(0.1 mg/mL)。

其配制方法是：分别称取这3种物质各10 mg，将2，4-D和NAA用少量(1 mL)无水乙醇预溶，将6BA用少量(1 mL)的物质的量浓度为0.1 mol/L的NaOH溶液溶解，溶解过程需要水浴加热，最后分别定容至100 mL，即得质量浓度为0.1 mg/mL的母液。

配制培养液：用量筒或移液管从各种母液中分别取出所需的用量：母液Ⅰ为50 mL，母液Ⅱ、Ⅲ、ⅣA和ⅣB各5 mL。

再取2，4-D 5 mL、NAA 1 mL，与各种母液一起放入烧杯中。

2.配制培养基的具体操作(1)、根据配方要求，用量筒或移液管从每种母液中分别取出所需的用量，放入同一烧杯中，并用粗天平称取蔗糖、琼脂放在一边备用；(2)、将①中称好的琼脂加蒸馏水300～400毫升，加热并不断搅拌，直至煮沸溶解呈透明状，再停止加热；(3)、将①中所取的各种物质(包括蔗糖)，加入煮好的琼脂中，再加水至1000毫升，搅拌均匀，配成培养基；(4)、用1N的氢氧化钠或盐酸，滴入③中的培养基里，每次只滴几滴，滴后搅拌均匀，并用pH试纸测其pH值，直到将培养基的pH值调到5.8；(5)、将配好的培养基，用漏斗分装到三角瓶(或试管)中，并用棉塞塞紧瓶口，瓶壁写上号码。