化学合成siRNA转染人羊膜的WISH细胞的效率检测
siRNA细胞转染实验操作指南
siRNA细胞转染实验操作指南siRNA产品的最佳工作浓度、转染后检测时间因不同的细胞类型和研究目的而异。
一般推荐的siRNA工作浓度为50nM，检测时间为转染后24~72h。
可以通过设置时间梯度和浓度梯度进行组合实验来选择最优的siRNA工作浓度和检测时间。
由于siRNA过量会对细胞产生毒性，实验建议的siRNA 工作浓度优化的范围为5~100nM。
下面以Lipofectamine 2000转染24孔板的293T细胞为例，选取50nM的siRNA工作浓度，介绍siRNA转染细胞的操作步骤。
若使用其他的转染试剂，请参照对应的产品说明书进行操作。
1.在转染前一天，按1×105~5×105个/孔的量将细胞接种于不含抗生素的完全培养基中，使次日转染时细胞融合度30-50%为宜。
接种时尽量保证每孔细胞的接种数量一致，使细胞均匀地平铺在生长表面。
注意:降低转染时的细胞密度可延长转染和收样的时间间隔，避免细胞过度生长对实验结果造成影响。
可根据细胞特性和实验目的等，调整接种时的细胞密度。
2.每个待转染的细胞样品（每个培养孔），按以下体系配置转染所需的siRNA-Lipofectamine 2000复合物:（1）配制稀释液A:取25pmol siRNA于50ul Opti-MEM无血清培养基中稀释，轻轻混匀。
（*siRNA的用量计算参照表1）（2）配制稀释液B:使用前先将Lipofectamine 2000轻轻混匀，取出1ul于50ul Opti-MEM无血清培养基中稀释，轻轻混匀，室温下孵育5分钟。
注意孵育时间不能超过25min。
（3）孵育完成后，将稀释液A与B轻轻混匀得到siRNA-Lipofectamine 2000复合物，在室温下孵育20分钟。
此时溶液可能会浑浊，属于正常现象。
表1 不同细胞培养板siRNA 转染用量参考表3.将孵育好的siRNA-Lipofectamine 2000复合物分别加到对应的细胞孔中，轻轻混匀。
化学合成siRNA转染人羊膜的WISH细胞的效率检测
中国组织工程研究与临床康复第12卷第16期 2008–04–15出版Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research April 15, 2008 Vol.12, No.16 ISSN 1673-8225 CN 21-1539/R CODEN: ZLKHAH3115 1College of Animal Medicine, Northwest Agricultural & Forestry University, Yangling 712100, Shaanxi Province, China; 2Institute of Obstetrics & Gynecology, Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical College, Guangzhou 510150, Guangdong Province, ChinaHao Rong-zeng★, Studying for master's degree, College of Animal Medicine, Northwest Agricultural & Forestry University, Yangling 712100, Shaanxi Province, China; Institute of Obstetrics & Gynecology, Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical College, Guangzhou 510150, Guangdong Province, China rongzenghao@ Correspondence to: Ma Bao-hua, Associate professor, College of Animal Medicine, Northwest Agricultural & Forestry University, Yangling 712100, Shaanxi Province, ChinaSupported by: the National Natural Science Foundation of China, No. 30471828*; the Scientific Research Priming Foundation for Returned Persons of Ministry of Education, No. Jiaowaisiliu[2005] 383*Received:2008-01-02 Accepted:2008-02-13化学合成siRNA转染人羊膜的WISH细胞的效率检测**★郝荣增1,2，刘慧姝2，马保华1Chemosynthesis siRNA transfection efficiency in human amnionic WISH cellsHao Rong-zeng1,2, Liu Hui-shu2, Ma Bao-hua1AbstractAIM: Researching the pertinent literature in China Journal Full-text Database (CJFD) published between 2005 and 2008 indicatedthat the inhibitory effect of small interference RNA (siRNA) was determined by the transfection efficiency in RNA interference. Atpresent, there are few reports about detection of the transfection efficiency for human WISH cells with chemosynthesis siRNA. Inthis study， we use the flow cytometer detected the transfection efficiency and the effect on apoptosis of WISH cells after chemosynthesis siRNA transfected human WISH cells.METHODS: The experiment was performed at the Experimental Medical Research Center of Guangzhou Medical College fromMarch to December 2007. ①WISH cells were bought from Shanghai Life Science Academy of Chinese Academy Of Sciences. ②WISH cell line was transfected with CY3-Negative siRNA (0, 5, 10, 20, 30 nmol/L). Twenty-four hours later, transfectionefficiencies of different protocols were evaluated by fluorescent microscopy and flow cytometer. Apoptosis of WISH cells wasdetected with Annexin V-EGFP kit after 24-hours 20 nmol/L CY3-Negative-siRNA transfection.RESULTS: Red fluorescence was discovered under the fluorescence microscope with 5, 10, 20, 30 nmol/L CY3-Negative siRNAtransfected WISH cells, and no signals were discovered in control group. The transfection efficiency of 20, 30 nmol/L CY3-NegativesiRNA was remarkably higher than 5, 10 nmol/L CY3-Negative siRNA transfection groups (P < 0.05). There was no significant differencein transfection efficiency between 20 nmol/L and 30 nmol/L siRNA groups (P > 0.05). The apoptosis of WISH cells was detected after24-hours transfection with 20 nmol/L Negative siRNA. The apoptotic rates were 1.96% and 2.36% in the transfection and control groups,respectively. There was no significant difference in apoptosis of WISH cells between transfection group and control group.CONCLUSION：①The chemosynthesis siRNA can transfect human amnion-derive WISH cells successfully, and there is no effecton the apoptosis of WISH cells after transfection. ②Better transfection efficiency can be obtained in 20 nmol/L siRNA transfectedhuman WISH cells.Hao RZ, Liu HS, Ma BH.Chemosynthesis siRNA transfection efficiency in human amnionic WISH cells. Zhongguo ZuzhiGongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(16):3115-3118(China)[/zglckf/ejournal/upfiles/08-16/16k-3115(ps).pdf]摘要目的：检索中国期刊全文数据库2005/2008相关文献显示，RNA干扰研究中，转染效率的高低直接决定siRNA 的表达效果，目前关于应用小分子干扰RNA对人羊膜WISH细胞转染效率的检测研究少见。
细胞sirna转染操作流程
细胞sirna转染操作流程细胞siRNA转染是一种常见的实验操作，用于沉默特定基因的表达。
下面我将从多个角度全面地介绍细胞siRNA转染的操作流程。
1. 实验准备：a. 准备所需的细胞培养基、细胞培养皿、siRNA转染试剂（如Lipofectamine™ RNAiMAX等）、siRNA、目的基因的控制siRNA、PBS等。
b. 在转染前，需要将细胞培养至适当的密度，确保细胞处于良好的生长状态。
2. siRNA转染操作流程：a. 将需要转染的细胞计数并分配至培养皿中，使得在转染时细胞密度达到合适的水平。
b. 在一个离心管中混合适量的siRNA转染试剂和无血清培养基，轻轻振荡混合，并静置15分钟。
c. 将siRNA转染试剂混合物滴加到含有细胞的培养皿中，轻轻摇晃培养皿使转染试剂均匀分布。
d. 将细胞培养皿放回培养箱中，根据试剂的要求进行培养，通常在转染后的24-72小时内进行下一步实验。
3. 转染后处理：a. 根据实验需求，在转染后的适当时间点进行细胞的取样或者其他实验操作。
b. 如果需要进行长期实验或者观察，可以在转染后适当时间内更换培养基。
c. 对于不同的细胞系和siRNA转染试剂，最佳的转染条件可能会有所不同，因此需要根据实验要求进行优化。
总的来说，细胞siRNA转染是一个常用的实验技术，通过沉默特定基因的表达，可以帮助研究人员探索基因功能和细胞信号通路。
在进行操作时，需要严格按照试剂的说明书和实验要求进行操作，并且根据具体情况进行优化，以确保实验结果的准确性和可靠性。
希望这些信息能够帮助到你。
rnai实验步骤
rnai实验步骤RNAi实验步骤RNA干扰（RNAi）是一种基因沉默技术，通过RNA分子的介导，抑制特定基因的表达。
RNAi技术已经成为生命科学研究中的重要工具，可以用于研究基因功能、疾病治疗等方面。
本文将介绍RNAi实验的步骤。
1.设计siRNAsiRNA是RNAi技术中的重要组成部分，是一种双链RNA分子，可以介导RNAi反应。
在设计siRNA时，需要选择目标基因的靶点序列，并设计合适的siRNA序列。
siRNA序列应该具有一定的长度和GC含量，同时需要避免与非目标基因的序列发生杂交。
目前，有许多在线工具可以帮助设计siRNA序列，如siRNA Wizard、siRNA Target Finder等。
2.合成siRNA合成siRNA是RNAi实验的关键步骤之一。
siRNA可以通过化学合成或体外转录的方式进行合成。
化学合成是一种常用的方法，可以在短时间内合成大量的siRNA。
体外转录则是一种更加自然的方法，可以通过RNA聚合酶在体外合成siRNA。
无论采用哪种方法，合成的siRNA需要经过纯化和质量检测，确保其纯度和活性。
3.转染siRNA转染siRNA是RNAi实验的另一个重要步骤。
转染siRNA可以通过多种方式进行，如化学转染、电穿孔、病毒载体等。
其中，化学转染是最常用的方法之一，可以使用多种转染试剂，如Lipofectamine、RNAiMAX等。
在转染siRNA之前，需要确定最佳的转染条件，包括转染试剂的浓度、转染时间、细胞密度等。
4.检测RNAi效果检测RNAi效果是RNAi实验的关键步骤之一。
常用的检测方法包括实时荧光定量PCR、Western blot、免疫荧光染色等。
实时荧光定量PCR可以检测目标基因的mRNA水平，Western blot可以检测目标蛋白的表达水平，免疫荧光染色可以直接观察目标蛋白的表达情况。
在检测RNAi效果时，需要注意对照组的设置，以确保实验结果的可靠性。
siRNA化学合成(生物谷)
siRNA化学合成化学合成siRNA简介化学合成siRNA是应用起来最方便的方法，客户只需提供siRNA序列或者GeneID、Accession Number、基因名称等。
百奥迈科(Biomics)公司的siRNA使用国外最先进的仪器合成，同时配备了高容量的HPLC纯化仪。
单个靶点siRNA合成量一次性可放大到克(g)级，年产更达到公斤(Kg)级。
产品经过严格质检，确保质量并提供质量检查报告。
化学合成的siRNA与生物合成siRNA相比，有以下优点：●操作简便，研究人员得到合成好的siRNA后，进行简单的稀释处理即可实验。
●转染效率高，相对于分子量较大的DNA质粒，其转染效率高。
●对细胞的或者组织的毒副作用小。
●可大规模制备，本公司的合成规模可达到克级(一次合成量1 - 100 g)。
●特别适用于基因靶位点已确定，需要大量siRNA进行siRNA动物实验研究。
欢迎您使用Biomics的siRNA产品，我们始终为您提供优质热诚的服务！siRNA设计siRNA序列的结构对RNAi实验的成功与否起着至关重要的作用。
不同的siRNA序列，对基因的沉默效率差异很大。
因此，理性设计有效的siRNA就成为实验成功的关键因素之一。
本公司推荐考虑如下设计思想：●从起始密码子下游50 - 100个nt开始，避免5'端或3'端的UTRs，搜索AA (N19) 序列。
因为这些区域结合了大量的调控蛋白，可能会影响siRNA发挥作用。
●分析siRNA两端能量分布●N19序列3'端垂悬两个dTdT，该垂悬不与mRNA序列互补，使有义链3’端更容易解链，从而增加其沉默效率。
21个碱基的siRNA单链序列如：5'-GGCCAGAGGUUGAAAGUGAdTdT-3'●对mRNA目标区域进行二级结构预测，排除作用复杂的二级结构的siRNA序列。
因为二级结构越复杂，siRNA沉默效率越低。
下图表明设计的siRNA结构优势依次递增a) < b) < c)●在NCBI数据库（/Blast.cgi）中进行Blast对照，排除设计的序列和其他基因的同源性，降低脱靶效应。
sirna转染常见问题解答
sirna转染常见问题解答siRNA转染常见问题解答SiRNA导入细胞有以下几种方法：化学转染技术、电穿孔法、磷酸钙共沉淀技术、显微注射和载体导入技术。
选择时应该依据实验条件考虑以下因素：细胞对转入方式的承受能力、细胞对病毒侵染的易感性、细胞的生长特性等。
其中，化学转染技术是目前最为常用的方法，由于电转的方法对细胞损伤比较大，一般不建议选择电转。
针对最常见的化学转染技术，有几种常见的问题以及解决方法。
一、哪种转染试剂效果好？在选择转染试剂时，一般要考虑的是结合特定的细胞株，而不是被导入细胞中的物质。
选择细胞毒性小，转染效率高的转染试剂。
脂质体试剂的毒性较大，建议选择非脂质体的转染试剂，如BIODAI的RFect系列纳米材料转染试剂。
二、转染后出现细胞死亡是什么原因？如何优化转染条件？转染后细胞死亡，原因也是多样的，如脂质体毒性，转染浓度过高，转染前的细胞状态不佳等都可能导致转染后细胞死亡的情况发生，这种情况下就需要适当优化转染条件；在优化转染条件时需要考虑以下因素：转染试剂和细胞特有的自身条件。
例如：siRNA与转染试剂的比例、转染时间、细胞传代数和细胞密度等。
一般说，转染试剂毒性小，转染时所需的细胞密度就小，如RFect系列siRNA转染试剂一般要求30-50%细胞密度，而lipo2000转染时所需的细胞密度一般在70%左右。
如果经优化后细胞死亡仍很多，应及时考虑更换转染试剂。
三、如何优化siRNA与转染试剂的比例？SiRNA的量与转染试剂的比例需要进行优化，一般选择24孔板进行优化，比较节省各种试剂。
可以在10-100nM之间设定几个siRNA的浓度水平，如30nM，50nM，80nM，100nM。
转染试剂根据说明书推荐的剂量上下浮动各3个浓度。
之后siRNA的量与转染试剂的量进行两两组合，从中选择转染效率最高的组合用于接下来的实验。
如果通过荧光显微镜观察荧光判断转染效率的话，siRNA的最低终浓度不要低于10nM，一般推荐的siRNA终浓度多在50-100nM。
细胞sirna转染操作流程
细胞sirna转染操作流程细胞siRNA转染操作流程一、引言细胞siRNA转染是一种常用的基因沉默技术，通过引入特定的小干扰RNA (siRNA) 分子来抑制目标基因的表达。
本文将介绍细胞siRNA转染的操作流程，以及该技术的应用和优势。
二、材料与方法1. 细胞培养：选择合适的细胞系，如人类癌细胞系HeLa，细胞应保持在优良的培养条件下，并处于快速增殖期。
2. 转染试剂：选择适合的转染试剂，如lipofectamine 2000等，根据试剂说明书进行操作。
3. siRNA设计与合成：根据目标基因序列设计合适的siRNA，确保siRNA具有高效的靶向作用和沉默效果。
4. 细胞培养基和缓冲液：准备含有适当浓度的无血清培养基和缓冲液。
三、操作流程1. 处理细胞：将细胞用适量的培养基悬浮在培养皿中，使细胞密度达到合适的转染浓度，一般为60-80%的细胞密度。
2. siRNA与转染试剂复合：将设计好的siRNA与转染试剂按照试剂说明书中的比例混合，并在室温下静置一段时间使其形成复合物。
3. 转染操作：将复合物缓慢滴加到细胞培养皿中，轻轻摇晃培养皿以保证复合物均匀分布在细胞上。
4. 培养细胞：将培养皿放入培养箱中，以适当的条件（如37℃，5% CO2）培养细胞一定时间，以便siRNA能够有效进入细胞并起到沉默目标基因的作用。
5. 细胞分析：根据实验需要，在转染后一定时间内收集细胞，进行相应的实验分析，如蛋白质检测、细胞增殖实验等。
四、应用与优势细胞siRNA转染技术广泛应用于生命科学研究中，可用于研究基因功能、新药靶点筛选、疾病机制探究等领域。
该技术的优势在于操作简便、效率高、靶向性强，并且可用于多种细胞系，适用范围广泛。
五、结论细胞siRNA转染是一种重要的基因沉默技术，通过引入siRNA分子抑制目标基因的表达。
本文介绍了细胞siRNA转染的操作流程和相关应用及优势。
随着该技术的不断发展，相信它将在生命科学研究中发挥越来越重要的作用。
sirna转染实验步骤及实验要点
sirna转染实验步骤及实验要点siRNA转染实验步骤如下：1.细胞接种：提前一天将细胞种植在24孔板中，以转染时细胞汇合度在30%左右为宜，转染前全培养基总量为0.45ml。
2.转染过程：•取0.67μg (50pmol) 的siRNA，加入一定量无血清稀释液，充分混匀，制成RNA稀释液，终体积为25μl。
注意：无血清稀释液建议采用OPTI-MEM、无血清DMEM或1640。
•取1μl的EntransterTM-R4000，然后加入24μl无血清稀释液体，充分混匀，制成EntransterTM-R4000稀释液，终体积为25μl。
室温静置5分钟。
•将EntransterTM-R4000稀释液和RNA稀释液充分混合（可用振荡器振荡或用加样器吹吸10次以上）混合，室温静置15分钟。
转染复合物制备完成。
•将50μl转染复合物滴加到有0.45ml全培养基（可含10%血清和抗生素）的细胞上，前后移动培养皿，混合均匀。
注意：对本试剂，采用含血清的全培养基有助于提升转染效率。
•转染后6小时观察细胞状态，如状态良好可不必更换培养基，继续培养24-96小时得到结果。
3.观察和检测：根据具体实验需求，可以在转染后的不同时间点观察细胞状态、检测基因表达、蛋白质表达等。
实验要点：1.细胞接种密度要适宜，一般在30%左右汇合度较好。
2.无血清稀释液的选择对于siRNA的稳定性和转染效率至关重要。
建议采用OPTI-MEM、无血清DMEM或1640等品牌。
3.在制备转染复合物时，要保证各个步骤的混合均匀，避免产生气泡。
4.在将转染复合物加入细胞时，要保证细胞的生存环境，避免对细胞造成损伤。
5.在转染后的观察和检测中，要注意保证实验结果的准确性和可靠性。
以上信息仅供参考，建议查阅专业文献获取更准确的信息。
测定细胞转染率的方法
测定细胞转染率的方法测定细胞转染率的方法包括但不限于以下几种：1. 流式细胞术：使用流式细胞仪检测细胞中转染的荧光酶或核酸基因编码蛋白，从而估计出转染效率。
2. 西方印迹：使用含有转染基因的质粒和拷贝上载到细胞中，然后浸泡混合物在Tris-HCL液中，用十种或十种以上的底物H2O2转染，在光面板之前通过特殊仪器识别和检测，从而使得转染成功的拷贝被荧光染料打上标签，最终通过流式细胞术的仪器实现图像计数的方式，从而得出细胞转染效率。
3. Smoke一次实验：将带有“正向和反向质粒”备份体系（也称为插入串）转染到细胞中，每个细胞同时转染2-4种质粒，用特殊的染料标记每一次转染，通过流式细胞技术检测和图像分析仪识别和计数，结合正反质粒的表达情况，加以计算得出转染效率。
4. 对比序列分析法：在转染前后对某个区域的DNA序列进行对比，如果DNA片段数量较大，说明转染效率也就相对较高。
5. 实时定量PCR检测：实时荧光定量PCR (Quantitative Real-time PCR)是一种在DNA扩增反应中,以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。
通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。
Real-time PCR是在PCR扩增过程中,通过荧光信号,对PCR进程进行实时检测。
由于在PCR扩增的指数时期,模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系,所以成为定量的依据。
但是,荧光定量PCR 所检测的是转染后细胞中待测基因的mRNA的表达水平,对于目的基因的蛋白表达水平不能够检测。
6. Wester Blot检测：Western Blot又称蛋白质免疫印迹(免疫印迹实验),其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或者生物组织样品进行着色,并通过分析着色的位置和着色的深度获得特定蛋白在所分析的细胞或者组织中表达情况的信息。
以上方法仅供参考，具体操作请根据实际情况调整。
siRNA 使用说明
siRNA 使用说明siRNA 使用说明1.介绍siRNA（小干扰RNA）是一种能够特异性沉默靶基因表达的双链RNA分子。
本文档旨在提供关于siRNA的详细使用说明，包括实验前准备、实验步骤和数据分析等内容。
2.实验前准备2.1 选择siRNA：选择适合的siRNA靶向靶基因。
可以通过文献研究或生物信息学预测来确定siRNA的序列。
2.2 siRNA合成与纯化：合成和纯化siRNA应该由可靠的供应商进行。
确保合成的siRNA纯度高且无附加污染物。
2.3 细胞培养：选用适当的细胞系，并且按照常规细胞培养方法将其培养在适宜的培养基中。
3.实验步骤3.1 载体转染：将siRNA与特定的转染试剂混合，并按照转染试剂的说明书将其转染入细胞中。
注意控制组设置。
3.2 RNA干扰效率检测：根据靶基因的表达情况选择适当的方法检测siRNA的干扰效果，如定量PCR或Western blot等。
3.3 功能检测：根据实验需要，选择适当的功能检测方法，如细胞增殖、凋亡、迁移或侵袭等。
4.数据分析4.1 干扰效果分析：对实验结果进行统计学分析，比较siRNA处理组和对照组之间的差异，并计算干扰效果的百分比。
4.2 功能检测结果分析：对功能检测结果进行统计学分析，比较siRNA处理组和对照组之间的差异，并进一步解释其生物学意义。
5.附件本文档涉及的附件包括实验记录表、数据分析表和相应的图表。
请在需要时参考附加的文件。
6.法律名词及注释6.1 siRNA：小干扰RNA，一种双链RNA分子，用于特异性沉默靶基因表达。
6.2 RNA干扰：通过siRNA分子的特异性结合和降解，抑制靶基因的转录和翻译过程。
6.3 转染：将外源DNA或RNA导入靶细胞以实现外源基因的表达或干扰基因的沉默。
6.4 培养基：一种用于细胞培养的含有营养物质和生长因子的液体或固体培养基质。
7.结束语感谢您阅读本siRNA使用说明，希望本文档能帮助您顺利进行siRNA实验。
siRNA转染 Protocol
siRNA转染实验是一种常用的基因沉默技术，其基本原理是通过将小干扰RNA（siRNA）引入细胞，从而在翻译水平上抑制特定基因的表达。
以下是siRNA转染的实验原理、所需试剂和耗材、实验仪器、准备工作、实验方法、注意事项、常见问题及解决方法。
一、实验原理siRNA是一种21-23个核苷酸长的双链RNA，它与靶基因的mRNA 序列互补，通过碱基配对原则与mRNA结合，抑制基因表达。
siRNA 转染实验是通过将siRNA转入细胞内，利用细胞内自然存在的RNA 干扰机制，在转录后水平抑制基因表达。
这种技术具有高效性、特异性和可逆性等特点，被广泛应用于基因功能研究、药物筛选和疾病治疗等领域。
二、所需试剂和耗材1.试剂：o siRNA：针对特定基因的siRNA分子。
o转染试剂：如Lipofectamine、JetPrime等，用于将siRNA转入细胞。
o培养基：如DMEM、F12等，用于细胞培养。
o血清：如胎牛血清，提供细胞生长所需的营养物质。
o抗生素：如青霉素、链霉素等，用于防止细胞污染。
2.耗材：o细胞培养瓶、板：用于细胞培养。
o离心管：用于离心和分离细胞。
o移液器及枪头：用于精确加样。
o过滤器：用于过滤溶液中的杂质。
o无菌水：用于稀释和配制溶液。
三、实验仪器1.实验室搅拌器：用于混合溶液。
2.高速冷冻离心机：用于离心和分离细胞。
3.水浴锅：用于加热溶液。
4.无菌工作台或超净工作台：用于进行无菌操作。
5.分光光度计：用于测量细胞生长状况和转染效率。
6.荧光显微镜：用于观察细胞转染后荧光蛋白的表达情况。
7.CO2培养箱：提供细胞培养所需的气体环境。
8.显微镜：观察细胞的生长状态和siRNA转染后的细胞变化。
9.细胞计数板或细胞计数仪：用于细胞计数，确定细胞的密度和生长状态。
10.酶标仪或多功能读板仪：用于检测细胞因子的浓度。
四、实验准备工作1.确认细胞系和siRNA：实验前要明确所使用的细胞系以及针对的目标基因。
sirna转染原理
sirna转染原理Sirna转染原理。
siRNA（small interfering RNA）是一种短小的双链RNA，可以通过RNA干扰技术抑制靶基因的表达。
siRNA转染是一种常见的实验手段，用于研究基因功能和疾病治疗。
siRNA转染原理涉及到siRNA的合成、转染剂的选择和细胞内siRNA的靶向作用等多个方面。
下面将详细介绍siRNA转染的原理。
首先，siRNA的合成是siRNA转染的基础。
siRNA可以通过化学合成或者体外转录的方式获得。
化学合成的siRNA具有较高的纯度和稳定性，适合大规模生产和应用。
而体外转录的siRNA则可以根据实验需要进行定制，具有更高的灵活性。
无论是哪种方式获得的siRNA，在使用前都需要进行纯度和活性的检测，确保siRNA的质量符合要求。
其次，选择合适的转染剂对siRNA的转染效率和细胞毒性具有重要影响。
常用的转染剂包括脂质体转染剂和聚合物转染剂。
脂质体转染剂通过与siRNA形成复合物，促进siRNA进入细胞内。
而聚合物转染剂则通过电荷作用或者其他机制实现siRNA的转染。
在选择转染剂时，需要考虑到细胞类型、siRNA的特性以及实验的目的，以获得最佳的转染效果。
另外，siRNA转染的成功与否还与siRNA的靶向作用有关。
siRNA可以通过与RISC复合物结合，形成siRNA-RISC复合物，从而识别并降解靶基因的mRNA。
siRNA的靶向作用取决于siRNA序列的选择和siRNA-RISC复合物的稳定性。
因此，在设计siRNA时需要考虑到靶基因的序列和结构，以及siRNA与RISC复合物的结合能力。
最后，siRNA转染还需要考虑到细胞内信号转导通路的调控。
siRNA转染可能会影响到细胞内的信号转导通路，导致细胞功能的改变。
因此，在进行siRNA转染实验时，需要对siRNA的作用机制和细胞的响应进行全面的分析，以确保实验结果的准确性和可靠性。
综上所述，siRNA转染原理涉及到siRNA的合成、转染剂的选择、siRNA的靶向作用以及细胞内信号转导通路的调控等多个方面。
sirna转染原理
sirna转染原理Sirna转染原理。
siRNA（small interfering RNA）是一种由约21-23个核苷酸组成的小分子RNA，能够通过RNA干扰途径特异性地抑制靶基因的表达。
siRNA转染技术已被广泛应用于基因沉默、基因功能研究以及潜在的治疗用途。
本文将介绍siRNA转染的原理及相关技术。
siRNA转染原理。
siRNA转染是通过将siRNA引入细胞内，使其与靶基因的mRNA结合，从而介导mRNA的降解，最终实现基因的沉默。
siRNA转染的原理主要包括siRNA的合成、转染剂的选择以及转染过程中的细胞内行为。
首先，siRNA需要经过化学合成或体外转录的方式进行制备。
合成的siRNA需要具有特定的序列，能够与靶基因的mRNA部分互补，形成双链RNA结构。
siRNA的设计需要考虑到靶基因的特异性和转染效率，通常选择靶向靶基因编码区域的siRNA序列。
其次，选择合适的转染剂也是siRNA转染的关键。
转染剂可以帮助siRNA穿过细胞膜，进入细胞内。
常用的转染剂包括脂质体、聚合物以及蛋白质等。
这些转染剂可以形成复合物，与siRNA结合后形成siRNA转染复合物，提高siRNA的稳定性和转染效率。
最后，在siRNA转染过程中，siRNA转染复合物需要与细胞表面的受体结合，进入细胞内。
随后，siRNA被释放出来，与靶基因的mRNA结合，启动RNA干扰途径，并介导mRNA的降解。
siRNA的引入和靶基因的沉默是一个动态的过程，需要考虑siRNA的稳定性和细胞内的代谢途径。
siRNA转染技术。
siRNA转染技术已经成为研究基因功能和潜在治疗的重要工具。
在基因功能研究中，研究者可以设计特异性的siRNA，沉默感兴趣的基因，观察其对细胞表型和生物学过程的影响。
在潜在治疗方面，siRNA转染技术可以用于治疗某些遗传性疾病和癌症等疾病。
总结。
siRNA转染技术是一种有效的基因沉默方法，可以用于基因功能研究和潜在的治疗用途。
两种常用转染试剂转染siRNA至HL-60细胞转染效率的比较
两种常用转染试剂转染siRNA至HL-60细胞转染效率的比较王巍;张晓希;刘新光【摘要】目的比较两种常用转染试剂转染小干扰RNA(siRNA)至悬浮细胞的转染效率及对细胞毒性的影响.方法以羧基荧光素(FAM)标记的siRNA为报告基因,以lipofectamine 2000和siPORT NeoFX为转染试剂,用流式细胞仪检测转染效率,倒置显微镜观察细胞形态,MTT法检测细胞存活率.结果 siRNA>100 nmol/L 时,lipofectamine 2000的转染效率高于siPORT NeoFX(P<0.05);siRNA<100 nmol/L时,前者低于后者(P<0.05).siRNA终浓度及转染试剂用量相同时,lipofectamine 2000组HL-60细胞存活率与SiPORT NeoFX组比较,差异无统计学意义(P>0.05).结论在使用高浓度siRNA时,lipofectamine 2000对HL-60细胞有较高的转染效率和较小细胞毒性.%Objective To compare the transfection efficiency and cytotoxicity between two cationic transfection reagents. Methods Small interfering RNA(siRNA) marked with FAM as a report gene,lipofectamine 2000 and siPORT NeoFX were used as the transfection reagents. Flow cytometer,microscope and MTT assay were used to detect transfection efficiency and cytotoxicity. Results The transfection efficiency of lipofectamine 2000 was higher than siPORT NeoFX when siRNA was over 100 nmol/L(P＜0.05) ,otherwise with siRNA under 100 nmol/L(P＜0. 05). At the same siRNA concentration and transfection reagent volume, there was no significant difference of vial cells ratios between two groups(P＞0.05). Conclusion lipofectamine 2000is an effective and safe transfection reagent to HL-60 cells when siRNA is over 100 nmol/L.【期刊名称】《重庆医学》【年(卷),期】2011(040)004【总页数】4页(P313-314,318,封2)【关键词】脂质体;转染;RNA,小分子干扰【作者】王巍;张晓希;刘新光【作者单位】广东医学院临床血液检验学教研室,东莞,523808;中国人民解放军第四二二医院,广东湛江,524023;广东医学院检验医学研究所,东莞,523808【正文语种】中文RNA干扰(RNA interference,RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA 诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象[1-3]。
细胞sirna转染操作流程
细胞sirna转染操作流程引言：细胞sirna转染是一种常用的实验技术，用于研究基因功能和基因调控机制。
本文将详细介绍细胞sirna转染的操作流程，以帮助读者全面了解该技术并正确进行实验。
一、实验前准备在进行细胞sirna转染实验之前，需要进行以下准备工作：1.1 细胞培养选择适当的细胞系并进行培养，确保细胞处于良好的状态。
培养细胞时，需注意细胞密度和培养基组分的合理调配，以保证细胞的健康生长。
1.2 设计sirna序列根据研究目的，设计合适的sirna序列，选择靶向特定基因的sirna。
确保sirna序列的特异性和有效性，以提高实验结果的可靠性。
1.3 转染试剂准备准备细胞转染试剂，如转染试剂A和转染试剂B，根据试剂说明书进行配制。
确保试剂的质量和浓度符合实验要求。
二、细胞sirna转染操作流程细胞sirna转染的操作流程包括以下步骤：2.1 细胞分装将培养好的细胞按照需求分装到培养皿或孔板中，使细胞达到适当的密度。
根据实验设计，将不同处理组的细胞分装到相应的培养皿或孔板中。
2.2 转染试剂配制根据转染试剂说明书的要求，将转染试剂A和转染试剂B按照比例配制好。
确保试剂配制的准确性和稳定性。
2.3 sirna转染将设计好的sirna溶解在适量的转染试剂中，形成sirna转染复合物。
将转染复合物加入到细胞培养皿或孔板中，轻轻摇晃培养皿或孔板，使转染复合物均匀分布。
2.4 培养细胞将转染后的细胞置于恒温培养箱中，以适当的温度和湿度进行培养。
根据实验要求，培养时间可根据需要延长或缩短。
2.5 细胞采集培养一定时间后，根据实验要求采集转染后的细胞。
采集细胞时，可选择细胞裂解液进行细胞裂解，以获得细胞内的目标蛋白或核酸。
2.6 目标分析采集到的细胞样品可用于进一步的目标分析。
根据实验需要，可以选择Western blot、PCR等技术进行目标蛋白或核酸的检测和定量。
三、实验结果分析根据实验结果，进行数据统计和分析。
软骨细胞 siRNA转染原理及转染试剂的选择
软骨细胞 siRNA转染原理及转染试剂的选择RNA干扰（RNA interference，RNAi）是近年来生命科学领域最为重大的发现之一。
它是指小分子双链RNA可以特异性地降解同源mRNA,从而抑制或关闭特定基因表达的现象。
人们只要知道了某种疾病的致病基因，就可以设计出针对该基因mRNA的小分子干扰RNA（Small interfering RNA，siRNA），抑制或封闭该致病基因的表达，从而达到治疗疾病的目的。
siRNA是目前最为热门的生命科学研究领域，也是未来最有发展前途的新药开发领域。
除此之外，siRNA技术还可以广泛应用于农业、林业、畜牧业和渔业等多种领域，进行良种培育、良种筛选和疾病治疗等。
siRNA导入细胞有以下几种方法：化学转染技术、电穿孔法、磷酸钙共沉淀技术、显微注射和载体导入技术。
其中，化学转染技术是目前最为常用的方法，由于电转的方法对细胞损伤比较大，一般不建议选择电转。
化学转染能否成功的关键在于转染试剂的选择，目前常用的转染试剂有RFect系列转染试剂、Lipo2000、RNAiMAX等。
如何选择合适的转染试剂，一般可从以下几个方面考虑：一、对siRNA有较高的转染效率。
转染效率的确定，常用的是使用荧光定量PCR、荧光显微镜和流式细胞仪检测的方法。
金标准无疑是检测目标基因的mRNA 水平，因为转染试剂不仅要把siRNA转染进入细胞，还应及时把转入细胞的siRNA 释放出来，发挥抑制基因表达的作用。
通过荧光显微镜判断转染效率至少存在两方面的问题：1、荧光显微镜看到的荧光点可能是非特异吸附的结果；2、有些转染试剂能够将siRNA转染入细胞，但不能充分释放，导致基因抑制效率并不高。
因而，判断转染试剂转染效率的金标准应该是荧光定量检测mRNA水平，仅靠观察荧光显微镜判断转染效率、选择转染试剂往往会导致误判，影响实验的进展。
目前国内应用最广的转染试剂有RFect系列转染试剂、Lipo2000、RNAiMAX等，其中，Lipo2000、RNAiMAX为国外知名品牌，RFect转染试剂虽在国内生产，但实际上是在美国研发成功，拥有国际发明专利。
siRNA的合成方法与技巧
siRNA的合成方法与技巧展开全文siRNA合成的方法主要包括：1、化学合成2、体外转录3、长片断dsRNA经RNaseIII类降解（如Dicer、E.coli、RNaseIII）4、siRNA表达载体或者病毒载体在细胞中表达siRNAs5、PCR制备的siRNA表达框在细胞中表达前三种方法主要都是体外制备siRNAs，并且需要专门的RNA转染试剂将siRNAs转到细胞内。
后两种方法的优点在于不需要直接操作RNA，依赖能够表达siRNAs的DNA载体或者表达框转染到细胞中。
每种方法都有有缺点，具体那种方法最好取决于试验目的。
一、化学合成siRNA分子：尽管化学合成是最贵的方法，但是却是最方便的。
研究人员几乎不需要做什么工作。
生物公司可以根据用户要求提供高质量的化学合成siRNA。
主要的缺点包括价格相对来说比其他方法高，定制周期长，特别是有特殊需求的。
由于价格比其他方法高，为一个基因合成3-4对siRNAs 的成本就更高了，比较常见的做法是用其他方法筛选出最有效的序列再进行化学合成。
最适用于：已经找到最有效的siRNA的情况下，需要大量siRNA 进行研究不适用于：筛选siRNA等长时间的研究，主要原因是价格因素二、体外转录合成siRNA分子：通过体外转录的方法可以合成siRNAs，这样的成本相对化学合成法而言比较低，是一种性价比高的筛选siRNAs的好方法。
更重要的是采用这种方法能够比化学合成法更快的得到siRNAs。
这个方法的不足之处是实验的规模受到限制，虽然一次体外转录合成能提供足够做数百次转染的siRNAs，但是反应规模和量始终有一定的限制。
而且和化学合成相比，还是需要占用研究人员相当的时间。
毕竟，化学合成只需要定购就可以了。
值得一提的是体外转录得到的siRNAs只要较低的浓度就可以达到化学合成siRNAs较高浓度得到的效果。
优点：体外转录得到的siRNA毒性小，稳定性好，效率高。
达到同样的转染效率只需要化学合成量的1/10。
化学合成siRNA转染人羊膜的WISH细胞的效率检测
化学合成siRNA转染人羊膜的WISH细胞的效率检测郝荣增;刘慧姝;马保华【期刊名称】《中国组织工程研究》【年(卷),期】2008(012)016【摘要】目的:检索中国期刊全文数据库2005/2008相关文献显示,RNA干扰研究中,转染效率的高低直接决定siRNA 的表达效果,目前关于应用小分子干扰RNA对人羊膜WISH细胞转染效率的检测研究少见.实验应用化学合成siRNA转染人羊膜WISH细胞,通过流式细胞仪检测转染效率,并初步检测转染对细胞凋亡的影响.方法:实验于2007-03/12在广州医学院试验医学研究中心完成.①实验材料:实验中应用的人羊膜WISH细胞株购于中国科学院上海生命科学研究所.②实验方法:应用0,5,10,20,30 nmol/L化学合成的CY3-Negative siRNA转染人羊膜WISH细胞,转染后24 h应用荧光显微镜和流式细胞仪定性、定量评估其转染效率;20 nmol/L CY3-Negative-siRNA转染细胞24 h后,应用Annexin V-EGFP试剂盒检测细胞早期凋亡情况.结果:荧光显微镜显示,5,10,20,30 nmol/L CY3- Negative siRNA转染细胞内均可见红色荧光,对照组无荧光信号.20 ,30 nmol/L CY3-Negative siRNA 的转染效率明显高于5,10 nmol/L组(P < 0.05);20 nmol/L和30 nmol/L siRNA组转染效率差异不显著(P > 0.05).检测20 nmol/L Negative siRNA转染细胞24 h后的细胞早期凋亡情况,转染组与对照组细胞早期凋亡率分别为1.96 %和2.36 %,两组之间细胞早期凋亡率差异不显著.结论:①化学合成的siRNA可以成功转染人羊膜WISH细胞,转染后对细胞的早期凋亡率无影响.②20 nmol/L的siRNA即可获得理想的转染效果.【总页数】4页(P3115-3118)【作者】郝荣增;刘慧姝;马保华【作者单位】西北农林科技大学动物医学院,陕西省杨凌,712100;广州医学院第三附属医院,广州市妇产科研究所,广东省广州市,510150;广州医学院第三附属医院,广州市妇产科研究所,广东省广州市,510150;西北农林科技大学动物医学院,陕西省杨凌,712100【正文语种】中文【中图分类】R394.2【相关文献】1.两种常用转染试剂转染siRNA至HL-60细胞转染效率的比较 [J], 王巍;张晓希;刘新光2.Smad2特异性siRNA转染肝星状细胞的效率检测 [J], 罗海峰;王洪江;王忠裕3.靶向性半乳糖化聚乙二醇-聚乙烯亚胺纳米载体介导siRNA质粒对肝癌细胞BEL-7402的转染效率检测 [J], 聂常富;韩风;张玲;庞春;王云检;陈规划4.Gal-PEG-PEI/psiRNA肝靶向性纳米基因载体对人胎肝细胞系L-02细胞的转染效率检测 [J], 聂常富;张彤;陈规划;韩风;邱大鹏;王云检;庞春5.体外化学合成bcl-2 siRNA及脂质siPORT脂质体转染siRNA至细胞HL-60的鉴定 [J], 燕春艳;雷小勇;涂玉林因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
siRNA化学合成(生物谷)
siRNA化学合成化学合成siRNA简介化学合成siRNA是应用起来最方便的方法，客户只需提供siRNA序列或者GeneID、Accession Number、基因名称等。
百奥迈科(Biomics)公司的siRNA使用国外最先进的仪器合成，同时配备了高容量的HPLC纯化仪。
单个靶点siRNA合成量一次性可放大到克(g)级，年产更达到公斤(Kg)级。
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化学合成的siRNA与生物合成siRNA相比，有以下优点：●操作简便，研究人员得到合成好的siRNA后，进行简单的稀释处理即可实验。
●转染效率高，相对于分子量较大的DNA质粒，其转染效率高。
●对细胞的或者组织的毒副作用小。
●可大规模制备，本公司的合成规模可达到克级(一次合成量1 - 100 g)。
●特别适用于基因靶位点已确定，需要大量siRNA进行siRNA动物实验研究。
欢迎您使用Biomics的siRNA产品，我们始终为您提供优质热诚的服务！siRNA设计siRNA序列的结构对RNAi实验的成功与否起着至关重要的作用。
不同的siRNA序列，对基因的沉默效率差异很大。
因此，理性设计有效的siRNA就成为实验成功的关键因素之一。
本公司推荐考虑如下设计思想：●从起始密码子下游50 - 100个nt开始，避免5'端或3'端的UTRs，搜索AA (N19) 序列。
因为这些区域结合了大量的调控蛋白，可能会影响siRNA发挥作用。
●分析siRNA两端能量分布●N19序列3'端垂悬两个dTdT，该垂悬不与mRNA序列互补，使有义链3’端更容易解链，从而增加其沉默效率。
21个碱基的siRNA单链序列如：5'-GGCCAGAGGUUGAAAGUGAdTdT-3'●对mRNA目标区域进行二级结构预测，排除作用复杂的二级结构的siRNA序列。
因为二级结构越复杂，siRNA沉默效率越低。
下图表明设计的siRNA结构优势依次递增a) < b) < c)●在NCBI数据库（/Blast.cgi）中进行Blast对照，排除设计的序列和其他基因的同源性，降低脱靶效应。