不连续凝胶电泳示意图

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不连续凝胶电泳示意图

（三）聚丙烯酰胺胶体的制备
制胶模 1 梳形样品槽模板 2 长玻璃板（后面） 3 短玻璃板（前面） 4 U形橡胶框
（四）聚丙烯酸胺凝胶电泳的特点与用途 • 1、电渗作用比较小 • 2、凝胶孔径可调 • 3、电泳分辨率高 • 4、化学稳定性和热稳定性好 • 5、机械强度高
二、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
（二）按有无固体支持物分类
1、按有无固体支持物可以分为两2、类支：持自物由电泳电根泳据和所支用持的支物持电物泳不。
同又可分为纸电泳、醋酸纤维薄膜电泳、琼脂凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）、SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳
第二节常用电泳分离技术ห้องสมุดไป่ตู้
一、聚丙烯酰胺凝胶电泳
（一）基本原理 1、凝胶的聚合及孔径 2、电泳效应（1）连续性电泳系统的凝胶浓度一致，凝胶中的pH值
第八章电泳分离技术
第一节电泳的基本理论及分类
一、原理
（一）概念及原理 1、电泳：是指带电粒子在电场中向与其自身
带相反电荷的电极移动的现象。
2、原理
电泳技术就是利用在电场作用下，由于待分离样品中各种分子带点性质以及分子本身大小、性状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而对样品进行分离、鉴定或提纯。
选择聚丙烯酰胺凝胶浓度参考值
样品蛋白质（酶）核酸（RNA）
分子量范围
<104 (1～4)×104 4×104～1×105 1×105～5×105
>5×105
<104 104～105 1×105～2×106
适宜的凝胶浓度 (T%)
20～30 15～20 10～15 5～10 2～5
15～20 5～10 2～3.6

不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳

溶液的离子强度电渗现象环境因素
聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶
两单体构成的人工合成凝胶丙烯酰胺（Acr） N，N-亚甲基双丙烯酰胺（Bis）
作为电泳介质的优点自由调节孔径；韧性好；性质稳定；无电渗作用；无色透明。
合成聚丙烯酰胺凝胶的两种方法
化学合成系统过硫酸铵（AP）四甲基乙二胺（TEMED）
实验结果的分析
相关理论
表-1 血清中各蛋白质的相关特性
种类
分子量(万） PI
分布(%)
清蛋白
6.9
6.1
55
1-球蛋白 2.1~30.8 7.3
5.0
2-球蛋白 4.1~72.5 6.8
9.0
-球蛋白
1.2~25 7.6
13.0
-球蛋白
15.6
8.0
11.0
-球蛋白
-球蛋白 2-球蛋白 1-球蛋白清蛋白前清蛋白
光学合成系统核黄素四甲基乙二胺（TEMED）
聚丙烯酰胺凝胶浓度与交联度
凝胶总浓度T=[(a+b)/m]×100% 交联剂百分比C=[b/(a+b)] ]×100%
a为Acr克数，b为Bis克数， m为缓冲液体积（ml) a:b＜10 凝胶变脆、硬、呈乳白色 a:b＞100易断裂（一般a:b=30左右，根据T可适当调整））
蛋白质聚丙烯胺凝胶电泳
不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳（圆盘电泳）
电泳的概念
带电粒子（胶体颗粒、离子等）在电场的作用下在特定的介质中向与其电荷性质相反的电极方向定向泳动的现象。
广泛应用于生物大分子的分离和鉴定
电泳的基本原理
利用物质的两个差异来分离物质
电荷差异
电荷性质电荷数量

(色谱分析)凝胶电泳

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2021/1/13
26
凝胶干燥器
2021/1/13
27
凝胶成像系统
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SDS－PAGE测定蛋白质相对分子质量
2021/1/13
29
实验过程
安装电泳槽
凝胶制备
电泳
样品处理与加样
剥胶与固定
染色与脱色
2021/1/13
30
实验过程流程图
2021/1/13
31
考马斯亮蓝染色法
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蛋白质组学和双向电泳技术
一、蛋白质组学产生背景 1. 20世纪中后期，生命科学研究进入了分子生物学时代。随着人类基因组全序列测定，生命科学跨入了后基因组时代。 2. 因mRNA的表达情况不能直接反应蛋白质的表达水平。 3. 蛋白质有自身特有的活动规律，如动态修饰、加工、转运定位、结构形成、代谢等，均无法从基因组水平上的研究获知。蛋白质构象更难于只靠DNA序列来解释。 4. 蛋白质才能动态反映生物系统所处的状态。 20世纪90年代中期，国际上萌发了蛋白质组学。
稳定的线性pH梯度中电泳，结果导致每种蛋白质分子迁移到等于其pI的pH处（此时蛋
白质分子的净电荷为零），最终聚集形成一个很窄的蛋白区带
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40
+
pH 3
+
pH 3
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+
pH 3
+
pH 3
pH 7.5 pH 7.5 pH 7.5 pH 7.5
–
pH 10
–
pH 10
–
465nm
棕红色
在酸性酸条性溶件液下中，蛋白质与考马斯亮兰R-250结合形成蓝色复合物（595nm处最大吸收与峰蛋）白质，疏蓝水色区结的合深浅与蛋白质浓度成正比关系

(色谱分析)凝胶电泳

2-DE使得分离分辨率大大提高，获得的信息也明显增多，是目前电泳技术中分辨率最高、信息获得最多的技术，常用于分析复杂样品及绘制蛋白质组图谱，是蛋白质组学研究的核心技术
2020/10/4
54
2020/10/4
55
二维电泳基本操作流程
① 样品准备 ② 等电聚焦（IEF, 第一维） ③ SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE,第二维) ④ 染色 ⑤ 图像分析 ⑥ 质谱分析 ⑦ 数据库分析，鉴定蛋白
CH=CH2
CH CH2 ( CH CH2 )n
形
C=O
C=O
C NH2
成
NH
O
NH
O
凝胶
CH2
催化剂
+ 2nCH2=CH C NH2
CH2
的
NH
NH
O
反
C=O
C=O
C NH2
应
CH=CH2
式
CH CH2 ( CH CH2 )n
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6
聚丙烯酰胺凝胶浓度与蛋白质分子量的关系
C=2.6%
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在电场中以一定的迁移率从负极移向正极
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天然琼脂（agar）:又名琼胶、菜燕、冻粉，从石花菜及其它红藻类植物提取出来的一种线状高聚物。
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D-半乳糖
3，6-脱水-L-半乳糖
琼脂糖链依分子内和分子间氢键及其它力的作用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束，构成大网孔型凝胶。
稳定的线性pH梯度中电泳，结果导致每种蛋白质分子迁移到等于其pI的pH处（此时蛋
白质分子的净电荷为零），最终聚集形成一个很窄的蛋白区带

第13章_电泳技术

1醋酸纤维素薄膜电泳

电泳仪器
架膜
加盖
接导线，开机

实验操作：
浸泡将醋酸纤维素薄膜在缓冲溶液中浸泡20min，
取出识别光面和麻面。
点样用镊子将薄膜置于滤纸上，吸收多余的液体，
用铅笔在薄膜麻面一端2cm处画一细线，利用载玻片一侧蘸取样品，于细线处点样。
电泳将薄膜麻面朝下，平悬于电泳槽支架的滤纸
㈢电泳结束后的变化所有的载体两性电解质分子以增加 pI级数的办法将分别在阳、阴极之间到达它们自己的位置而给出一个pI梯度。
优点：混合物可以达到完全分离，而且只要电场保持不变，扩散和对流迁移就不会影响分离的有效性。
缺点： ①.载体两性电解质对产品产生污染；
②.pH梯度的稳定性不高；
定义：等速电泳是根据分子电荷的差别而不是分子大小差别来进行物质分离的。仅适用于同种电荷的分离。原理:在上层凝胶层中，以迁移率最大的阴离子为前导离子（Cl-)，迁移率最小的阴离子为末尾离子（甘氨酸离子），以阳离子为反离子，电泳开始时，将含有目标蛋白质的料液加入到前导离子和末尾离子之间。
等速电泳特点
①分子量要小，以便与被分离大分子物质分离； ②化学性质稳定； ③各成分的pI彼此接近，并在其pI值附近有良好的缓冲能力； ④在pI处具有足够的电导，导电性均匀； ⑤两性电解质载体的数目要足够多； ⑥可溶性好； ⑦对280nm的紫外光没有或仅有很低的吸
2.载体两性电解质的合成
加成反应
丙烯酸+多乙烯多胺
不连续凝胶电泳：
最基本的凝胶电泳的凝胶柱中凝胶浓度和pH值均一，为了提高凝胶电泳的分离性能，人们开发了不连续凝胶电泳法。
电泳过程示意图
A为电泳前3层凝胶排列顺序，3层胶中均有快离子、慢离子 B显示电泳开始后，蛋白质样品夹在快、慢离子之间被浓缩成极窄的区带。 C显示蛋白质样品分离成数个区带。

聚丙烯酰胺凝胶电泳

实验过程
安装电泳槽凝胶制备源自电泳样品处理与加样
剥胶与固定
染色与脱色
实验步骤
一、制胶
1.配胶
配胶应根据所测蛋白质相对分子质量范围选择适宜的分离胶浓度。由于SDS-PAGE 有连续体系和不连续体系两种，两者各有不同缓冲体系，因而
蛋白质的相对分子量分离胶的浓
的范围
度
勇于开＜始1，04才能找到成 20%～30%
❖ 注意： ❖ TEMED量多少都会影响催化作用，须在碱性
条件下聚合
❖ 分子氧存在，聚合不完全，须去除分子氧，隔绝氧
❖ 升高温度能提高聚合，降低温度能延迟聚合
（2）光聚合：核黄素-TEMED系统
❖ 核黄素（riboflavin）在光照下（可见光或紫外光）分解，其黄素部分被还原成无色型，但在有氧条件下无色型又被氧化成带有游离基的黄素，其也能使Acr和Bis聚合形成凝胶。
（十二烷基硫酸钠，sodium dodecyl sulfate, SDS)
阴离子去污剂变性剂助溶性试剂
断裂分子内和分子间的氢键分子去折叠破坏蛋白质分子的二级和三级结构
❖ (2)强还原剂巯基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）
使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂，这样分离出的谱带即为蛋白质亚基。
实验原理
不同分子量范围的蛋白质应选用不同的凝胶浓度。
蛋白质的分子量在15-200 kD之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系，因此SDS-PAGE不仅可以分离鉴定蛋白质，还可以根据迁移率的大小测定蛋白质亚基的分子量。
PAGE的浓度与孔径的关系
❖ PAGE孔径的大小主要由Acr和Bis这两种单体的浓度决定。可以根据要分离物质分子的大小，选择合适的单体浓度。

(色谱分析)凝胶电泳

度越快
蛋白质分子的大小和形状分子质量越小、形状越接近球形，在电
场中迁移速度越快
2020/7/22
12
SDS-PAGE
1967年由Shapiro建立。 1969年由Weber和Osborn进一步完善。
他们发现样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂（SDS）以后,蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小,电荷因素可以忽视。
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2020/7/22
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凝胶干燥器
2020/7/22
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凝胶成像系统
2020/7/22
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SDS－PAGE测定蛋白质相对分子质量
2020/7/22
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实验过程
安样品处理与加样
剥胶与固定
染色与脱色
2020/7/22
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实验过程流程图
2020/7/22
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考马斯亮蓝染色法
(色谱分析)凝胶电泳
电泳
带电粒子在电场力作用下向着所带电荷相反的方向泳动的现象叫电泳。
凝胶电泳
2020/7/22
电泳的用途？ 2
聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide Gel Electrophoresis ，PAGE）
2020/7/22
3
原理
聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acrylamide，简
CH=CH2
CH CH2 ( CH CH2 )n
形
C=O
C=O
C NH2
成
NH
O
NH
O
凝胶
CH2
催化剂
+ 2nCH2=CH C NH2
CH2
的
NH
NH
O

容易被误读的凝胶电泳图分析条带拖尾不一定都是DNA降解

容易被误读的凝胶电泳图分析条带拖尾不一定是DNA降解经常会遇到一些电泳新手的对DNA有降解问题困扰，究其原因是看电泳没经验，误读导致的误解。

所以很有必要就一种很容易被误读的电泳图进行深入分析。

以某一用户反馈的实验电泳图为例，用户提取的是新鲜分离的小鼠肝脏组织DNA实验。

图一：1-4孔为Q-PCR产物电泳图5为DNA Marker电泳图6、7为DNA电泳图大家第一眼看上去觉得最后一孔出现拖尾带是个什么情况？拖尾严重且DNA主带较暗，是DNA降解了吗？错。

主带（长片段）是基因组DNA，拖尾带是残留的降解RNA条带。

--凭什么这么说？用户提取的是新鲜分离的小鼠肝脏组织DNA，并且没有加RNA酶消化。

同样条件提取的DNA（第六孔）残留的拖尾带是不连续的，集中在某一区域（可以解读为残留的降解RNA较少，如果降解DNA的典型带型参考图四）。

所以我们立刻坚决地否定了用户有关DNA有降解的投诉，并预言：如果在提取DNA时加入RNase A就不会出现这种现象。

延长电泳时间，RNA拖尾会消失，DNA主带会变亮。

将电泳凝胶放置一段时间（如过夜），拖尾带会变暗甚至消失，而DNA主带会变亮（可能变模糊但不会消失）。

用户带着满满的疑惑尝试了延长电泳，结果对比如图二：图二：左边是电泳时间较长的电泳图，右边是电泳时间较短的电泳图有人也许会有疑问，如果不是DNA降解的话，那么DNA主带为什么会这么暗呢？其实这并非DNA量少产生的，而是由于残留的RNA过多以致电泳过程中将大部分EB带走，使得DNA主带没有足够的EB对其进行染色。

但是如果继续电泳一段时间，或者干脆电泳至RNA跑到电泳缓冲液中后，DNA也就会染上足够的EB了，这时就能看到正常亮度的DNA主带了。

我们来看看真正有降解的DNA条带是怎样的吧：图三：第一孔为DNA Marker电泳图后面几孔均为DNA 电泳图（从长期冻存的血液中提取的DNA）是不是觉得第二孔和图一的第七孔很像呢？如果说这是DNA降解的拖尾而不是RNA 降解的拖尾，是不是有点懵了。

(色谱分析)凝胶电泳

成复合物，大约每两个氨基酸残基结合一个 SDS分子。
2020/7/8
16
2020/7/8
17
当蛋白质的分子量在15000～200000之间时，蛋白质-SDS复合物的电泳迁移率与蛋白质分子量的对数呈线性关系，符合下列方程：
lgMrlgKbmK1bm
常数斜率
迁移率
通过已知分子量的蛋白与未知蛋白的比较，就可以得出未知蛋白的分子量。
度越快
蛋白质分子的大小和形状分子质量越小、形状越接近球形，在电
场中迁移速度越快
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SDS-PAGE
1967年由Shapiro建立。 1969年由Weber和Osborn进一步完善。
他们发现样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂（SDS）以后,蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小,电荷因素可以忽视。
—VE =
__Q___ 6πrη
V=迁移速度； E=电场强度； η=介质粘度
➢ 在同一介质中电泳，m只与蛋白分子自身大小和形状（r）、所带电荷数量（Q）相关
➢ 利用蛋白质混合物中各蛋白的迁移率不同
（蛋白性质差异造成），而达到分离的效果
2020/7/8
9
2020/7/8
6种蛋白质混合物的电泳结果图
2020/7/8
18
电泳过程中分子迁移的规律，小分子在前，大分子滞后。电泳凝胶相当于凝胶过滤中的一个带孔胶粒。
混合样品
大分子
电泳方向
电泳带孔胶
小分子
按分子
不2020/7同/8 分子量的蛋白质在凝胶中运动示意图
大小分19离
2020/7/8
20
SDS-PAGE分类
SDS-PAGE按照缓冲液pH值和凝胶孔径差异分为连续

实验7 聚丙烯酰胺凝胶电泳

实验7 聚丙烯酰胺凝胶电泳实验7 聚丙烯酰胺凝胶电泳原理一聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis,简称PAGE），由称盘状电泳。

这种电泳是在区带电泳的基础上，以孔径大小不同的聚丙烯酰胺凝胶作为支持物，采用电泳基质的不连续体系（即凝胶层的不连续性、缓冲液离子成分的不连续性、pH的不连续性及电位梯度的不连续性），使样品在不连续的两相间积聚浓缩成很薄的起始区带（厚度为10-2cm），然后再进行电泳分离。

圆盘电泳名称来源即由于此法的原理是依靠基质的不连续性（discontinuity），凑巧在垂直柱形凝胶上分散出的区带也很象圆盘状（discoid shape），取“不连续性”和“圆盘状”的英文字头“disc”。

因此英文名称为“disc electrophoresis”，中文直译为盘状电泳。

仪器装置：如图A所示，上下两个槽为圆形或方形，其中注入缓冲液（图中曲线表示缓冲液面）。

上下槽的缓冲液分别有正负电极通入。

下槽外壳在必要时可通入冷水促使降温，水流方向用箭头表示。

上槽底部有许多小孔，可插入装有聚丙烯酰胺的玻璃管。

图A在圆盘电泳过程中有三种物理效应：①样品的浓缩效应，②凝胶的分子筛效应，③一般电泳分离的电荷效应。

由于这三种物理效应，使样品分离效果好，分辨率高。

下面就圆盘电泳过程中的三种物理效应的原理加以说明：1. 样品的浓缩效应：由于电泳基质的4个不连续性，使样品在电泳开始时，得以浓缩，然后再被分离。

（1）凝胶层的不连续性：浓缩胶：为大孔凝胶，有防止对流的作用。

分离胶：为小孔凝胶，也有防止对流的作用。

样品在其中进行电泳和分子筛分离。

蛋白质在大孔凝胶中受到的阻力小，移动速度快。

进入小孔凝胶时遇到的阻力大，速度就减慢了。

由于凝胶的不连续性，在大孔胶与小孔胶的界面处就会使样品浓缩，区带变窄。

（2）缓冲离子成分的不连续性。

(3)电位梯度的不连续性。

(4)pH的不连续性：在浓缩胶和分离胶之间有pH的不连续性，浓缩胶应有的pH应为8.3，分离胶应有的pH为8.9。

不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳

不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳
实验原理
电泳：带电粒子在电场中泳动的现象。
泳动的速度取决于粒子带电的多少、分子的大小和形状
聚丙烯酰胺凝胶电泳：被电泳的物质
在聚丙烯酰胺凝胶中电泳，分出的组分形成不连续的圆盘形区带。聚丙烯酰胺凝胶电泳具有电泳和分子筛的双重作用。
实验原理
不连续体系：凝胶孔径大小不连续
→ 甩去封顶掖
上电泳槽
电极缓冲液样品浓缩胶 1cm 绿色胶塞分离胶 7cm 电极缓冲液
下电泳槽
操作步骤
二、安装凝胶管
1. 去除白胶塞，将凝胶小玻管依次垂直安装在电泳仪上槽小孔内, 塞紧绿胶塞。注意：不能漏水，上槽先加少许缓冲液M检漏
2. 电泳仪下槽加电极缓冲液，应浸没下槽中的电极及小玻管的下端
红B黑
通直流电. 恒流
3mA/管，3×12管=36mA 3×24管=72mA 电压180-400v（自动，不用调）
600v 100mA 推进推进恒流不推开推进调整
调整mA →36 mA/72mA
电泳时间1小时 → 绿胶塞下出现染料蓝色带 → 关电泳仪开关 →拔电源插头 →取下电极线 →取玻管→ 倒去上槽中的缓冲液
2 4 4 10 mL
沿玻管壁加至绿胶塞顶部高度→ 沿管壁滴入封顶液X 3滴 →15-20分成胶
→ 甩去封顶掖
操作步骤
2. 浓缩胶：核黄素-TEMED系统，光聚合依次加入 B:D:E:F 8mL →轻搅匀 → 1cm/管
1 2 1 4 mL
→ 封顶液X 3滴 → 垂直放入圆盘电泳仪孔中
→ 紫外线照射5-10分成胶
胶蓝色、蛋白质蓝黑色带
结果分析
一、浓缩胶中的浓缩效应二、分离胶中的蛋白质分离

不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳基本原理

不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳基本原理不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳包含了两种以上的缓冲液成分、pH值和凝胶孔径，而且在电泳过程中形成的电位梯度亦不均匀。

由此产生的浓缩效应、电荷效应和分子筛效应。

1．浓缩效应样品在电泳开始时，通过浓缩胶被浓缩成高浓度的样品薄层(一般能浓缩几百倍)，然后再被分离。

当通电后，在样品胶和浓缩胶中，解离度最大的Cl—有效迁移率最大，被称为快离子，解离度次之的蛋白质则尾随其后，解离度最小的甘氨酸离子(PI=6．0)泳动速度最慢，被称为慢离子。

由于快离子的迅速移动，在其后边形成了低离子浓度区域，即低电导区。

电导与电势梯度成反比，因而可产生较高的电势梯度。

这种高电势梯度使蛋白质和慢离子在快离子后面加速移动。

因而在高电势梯度和低电势梯度之间形成一个迅速移动的界面，由于样品中蛋白质的有效迁移率恰好介于快、慢离子之间，所以，也就聚集在这个移动的界面附近，逐渐被浓缩，在到达小孔径的分离胶时，已形成一薄层。

2．电荷效应当各种离子进入pH8．9的小孔径分离胶后，甘氨酸离子的电泳迁移率很快超过蛋白质，高电势梯度也随之消失，在均一电势梯度和pH的分离胶中，由于各种蛋白质的等电点不同，所带电荷量不同，在电场中所受引力亦不同，经过一定时间电泳，各种蛋白质就以一定顺序排列成一条条蛋白质区带。

3．分子筛效应由于分离胶的孔径较小，分子量大小或分子形状不同的蛋白质通过分离胶时，所受阻滞的程度不同，因而；迁移率不同而被分离。

此处分子筛效应是指样品通过一定孔径的凝胶时，受阻滞的程度不同，小分子走在前面，大分子走在后面，各种蛋白质按分子大小顺序排列成相应的区带。

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）是蛋白分析中最经常使用的一种方法。

它是将蛋白样品同离子型去垢剂十二烷基硫酸钠（SDS）以及巯基乙醇一起加热，使蛋白变性，多肽链内部的和肽链之间的二硫键被还原，肽链被打开。

打开的肽链靠疏水作用与SDS结合而带负电荷，电泳时在电场作用下，肽链在凝胶中向正极迁移。

不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳三种效应

不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳三种效应1 什么是不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳？不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种常见的蛋白质电泳技术，通过将蛋白质样品加入到凝胶中，然后通过电场作用使蛋白质在凝胶中迁移并被分离。

与常规聚丙烯酰胺凝胶电泳不同的是，不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳有几个明显的特点，即凝胶有两个分离区域，并且凝胶中的聚丙烯酰胺浓度梯度是不连续的。

2 不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳的三种效应不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳存在着三种效应，分别为“聚集效应”、“前移量效应”和“带电荷效应”。

2.1 聚集效应聚集效应是不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳的独特现象之一。

由于凝胶中的聚丙烯酰胺浓度在两个分离区域是不同的，因此在蛋白质样品通过凝胶时，会发生一种聚集现象，使相对较小的蛋白质在凝胶中聚集成高峰。

这种现象在较长时间运行的不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳中尤为明显。

2.2 前移量效应前移量效应是由于磷酸盐在凝胶中存在的影响导致的。

磷酸盐在凝胶中的存在可以影响电泳的运行速度，从而导致前移量效应的出现。

这意味着相对较大的蛋白质会有可能向前移动，而相对较小的蛋白质会落后。

可以通过减少样品的负载量和调整样品pH值的方法来减轻前移量效应的影响。

2.3 带电荷效应带电荷效应是由于不连续聚丙烯酰胺凝胶的化学性质造成的。

不同于其他凝胶材料，不连续聚丙烯酰胺凝胶带有大量阴离子的化学官能团，这可以对相对较大的蛋白质产生更明显的阻滞效应。

带电荷效应的存在可以通过凝胶电泳缓冲液中加入含有相同的正离子的药物来降低。

3 结论不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种有着独特性质的分离技术，聚集效应、前移量效应和带电荷效应是这种技术的重要特征。

在使用这种技术时，需要注意这些效应的影响，并尽可能地减小其影响。

不同于传统聚丙烯酰胺凝胶电泳，不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳在蛋白质分离中具有更好的分辨率，对于分离复杂的样品有较大的优势。

聚丙烯凝胶电泳

聚丙烯酰胺凝胶电泳分类
按凝胶装置分为盘状电泳及板状电泳
盘状电泳通常是不连续系统，利用缓冲液离子成分、 pH、凝胶孔径进行电泳，带电颗粒电泳时具有电荷效应、分子筛效应、浓缩效应。
聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gel, PAG）的聚合反应：
以聚丙烯酰胺作为支持介质的一种电泳技术。凝胶是单体聚丙烯酰胺（Acr)和交联剂甲叉双丙烯酰胺(Bis)交联而成的，催化剂为过硫酸铵(AP)，加速剂为四甲基乙二胺TEMED, 形成三维网状凝胶。
ν /X 用U表示，称迁移率（mobility）
即单位电场强度时粒子运动的速度，取决于带电粒子的电荷量Q 、粒子大小γ和形状。 Q越多，V越大；r越小，V越大；球形分子> 纤维状
影响电泳速度的因素：
样品本身：带电量，分子大小，形状电场强度：电压电泳介质的pH和离子强度电渗作用
三大效应：浓缩效应
• 缓冲液离子成分、PH的不连续性：电极缓冲液通常为pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液，样品及凝胶中缓冲液为pH6.7 Tris-HCL缓冲液。电极缓冲液的 pH=8.3，甘氨酸的电离小，有效迁移率小，称为慢离子；浓缩胶中的氯离子完全电离，有效迁移率大，称为快离子；蛋白质在浓缩胶中介于二者之间。电泳开始后，氯离子跑得最快，留下一段低电导区，产生高电位梯度（电位与电导率成反比），使甘氨酸离子追赶氯离子，蛋白质夹在中间而被压缩。1cm厚样品层可以压缩0.25μm的厚度。
电荷效应：电荷量不同，迁移率不同。
实验步骤
1.制备PAGE胶柱画线，封口：在一端取7cm和7.5cm两处画线，此端管口插入橡皮垫。制备分离胶：配制好7.5%分离胶，缓慢注入玻璃管 7cm处，加水防止氧化，室温下聚合聚合20-30min。制备浓缩胶：配制好3%浓缩胶。将胶上层水倾倒出去，用滤纸吸干余水。加浓缩胶，封水。室温下聚合20-30min。

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

三、具体实验操作
9.凝胶板剥离与染色：电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶板做好标记后放在大培养皿内，加入染色液，染色1小时左右。 10.脱色：染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白质区带清晰。 ※剥胶时要小心,保持胶完好无损,染色要充分.
四、实验结果分析
绘制标准曲线：
按下式计算相对迁移率：
三、具体实验操作
3. 实验步骤
1.将玻璃板用蒸馏水洗净晾干, 准备2个干净的锥形瓶. 2.把玻璃板在灌胶支架上固定好. ※固定玻璃板时，两边用力一定要均匀，防止夹坏玻璃板. 3.按比例配好分离胶,用移液管快速加入,大约5厘米左右,之后加少许蒸馏水,静置40分钟. ※凝胶配制过程要迅速, 催化剂TEMED要在注胶前再加入,否则凝结无法注胶.注胶过程最好一次性完成,避免产生气泡.
三、具体实验操作
※水封的目的是为了使分离胶上延平直，并排除气泡 ※凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面. 4.倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干,按比例配好浓缩胶, 连续平稳加入浓缩胶至离边缘5mm处,迅速插入样梳,静置 40分钟. ※样梳需一次平稳插入,梳口处不得有气泡,梳底需水平. 5.拔出样梳后,在上槽内加入缓冲液,没过锯齿时可拆去底端的琼脂糖. ※要使锯齿孔内的气泡全部排出,否则会影响加样效果. 6、加样三个。（1）取10µ l标准蛋白溶解液于EP管内，再加入10µ 2倍样品缓冲液，上样量为20µl。 l
相对迁移率 =
蛋白样品距加样端迁移距离（cm）溴酚蓝区带中心距加样端距离（cm）
以每个蛋白标准的分子量对数对它的相对迁移率作图得标准曲线，量出未知蛋白的迁移率即可测出其分于量，这样的标难曲线只对同一块凝胶上的样品的分子量测定才具有可靠性。

电泳技术

• 嵌入染料：荧光染料溴化乙锭（EB）用于检测琼脂糖凝胶中的DNA，染料嵌入到堆积的碱基对间并拉长线状和带缺口的环状DNA,使其刚性更强,还会使线状迁移率降低15% 。
• 电泳温度：DNA在琼脂糖凝胶电泳中的电泳行为受电泳时的温度影响不明显，不同大小的DNA片段其相对迁移速率在4℃与30℃之间不发生明显改变，但浓度低于0.5%的凝胶或低熔点凝胶较为脆弱，最好在4℃条件下电泳
第十一小组
制作
最常用实验技术
“电泳技术”
组员：艾力特别尔陈南福陆岩冰马星星唐佳坤王琦阳明华
目录
➢电泳概述 ➢影响电泳的主要因素 ➢琼脂糖凝胶电泳 ➢常规聚丙烯酰胺凝胶电 ➢SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 ➢等电聚焦电泳 ➢毛细管电泳 ➢连续流动电泳
电泳技术
电泳是指带电粒子在电场的作用下，在一定介质（溶剂）中所发生的向异性电极定向移动的现象。
利用电泳现象对混合物进行分离、分析的技术叫做电泳技术。
电泳技术特点
➢ 几乎适用于所有带电物质的分离，并可进行定性或
定量分析；
➢ 样品用量极少； ➢ 设备简单 ➢ 可在常温进行 ➢ 操作简便省时 ➢ 分辨率高。
电泳的分类方法
区带电泳 1.根据有无支持物
纸电泳醋酸纤维素薄膜电泳琼脂糖凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳
点样：点样量随凝胶板的厚度以及加样孔宽度、染色方法的不同存在差异。
电泳条件：常在上样之前进行预电泳（冰浴，200v，10min），之后点样，进行电泳（冰浴，200v，3至5h）
电泳缓冲液：Tris-甘氨酸缓冲液（pH8.8）
不连续电泳
Tris-Hcl(pH8.8)缓冲液或1×TBE缓冲液连续电泳
琼脂糖由D-半乳糖和3,6-脱水-L-半乳糖组成。

蛋白质凝胶电泳

蛋白质凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE），是目前对蛋白质进行分离、纯度鉴定及分子量测定的主要方法之一。

十二烷基磺酸钠（SDS）是一种阴离子去污剂，可与蛋白质结合，使蛋白质变性并带上大量负电荷。

SDS-PAGE是最常用的凝胶电泳技术。

它通常采用不连续电泳系统，即用上层胶（成层胶）和下层胶（分离胶）两种不同浓度的凝胶灌制凝胶板，见图2.SDS-PAGE通过其电荷效应、浓缩效应和分子筛效应，达到蛋白质高分辨率的分离效果。

图2 SDS-PAGE凝胶分层示意图待分离蛋白质样品在电泳中的泳动速度，或相对迁移率（Mr）与蛋白质本身性质（如分子大小）、凝胶孔径和电泳条件（如电流、电压）等密切相关，蛋白质结合大量的SDS后，各组分之间的的形状和电荷差异被抵消，此时蛋白质在电场中泳动速度的快慢，仅与各自分子量的大小有关。

因此，可根据下列公式计算分子量大小:lgMW=lgK—bMr其中，MW为蛋白质的分子量，K为常数，Mr为相对迁移率，b为斜率。

将已知分子量的几种标准蛋白质在电泳中的相对迁移率对其分子量的对数做图，即可得到一条蛋白质分子量校正曲线。

根据待测样品的相对迁移率，可由校正曲线查到其分子量大小，蛋白质样品中加SDS煮沸后，蛋白质发生变性，为保护和还原二硫键，尚需加还原剂2-巯基乙醇（2-ME）或二硫苏糖醇（DTT）。

蛋白质变性使亚基聚合形式存在的蛋白质解聚成单个亚基。

因此，对于一个纯化蛋白质，可经SDS-PAGE确定其亚基种类、数目及大小。

上述蛋白质分子量测定更确切地说是蛋白质分子各亚基分子量的大小。

丙烯酰胺凝胶孔径对电泳速度及分离效果影响很大。

凝胶孔径的大小取决于丙烯酰胺（Aery）单体及N，N—亚甲基双丙烯酰胺（Bis）的含量及比例。

总胶浓度（T）可在3％～30％范围内变动，T为8％～15％的凝胶，适用于大多数蛋白质样品的分离。

交联度（C）是反映凝胶聚合情况的一个指标。

不连续凝胶电泳原理

不连续凝胶电泳（Discontinuous Gel Electrophoresis）是一种常用于分离蛋白质和核酸的生物技术方法。

其基本原理如下：
1. 样品加载：首先，将待分离的样品（如蛋白质或核酸）加载到凝胶电泳槽中，形成样品带。

2. 凝胶填充：在样品带上方填充凝胶，凝胶中的孔隙结构可以提供不同的电场分布，从而影响样品在凝胶中的迁移速度。

3. 电场设定：设定所需的电场强度和电泳时间，以使样品在凝胶中迁移到适当的位置。

电场强度通常根据样品的电荷量和凝胶孔隙的性质来设定。

4. 电泳结束：在设定的电泳时间结束后，停止电场，将凝胶从电泳槽中取出，并进行后续的染色和成像步骤。

5. 结果分析：通过显微镜或其他成像技术观察凝胶上的样品带，并根据样品在凝胶中的迁移距离和位置，对样品进行分离和分析。

不连续凝胶电泳的优点包括：可以在较短的时间内实现较宽范围内的样品分离；可以通过改变凝胶的组成和孔隙结构来实现对不同大小和电荷的样品的分离；可以结合其他生物技术方法（如SDS-PAGE、PAGE、Western blotting等）进行复合分析。

需要注意的是，在不连续凝胶电泳过程中，应严格控制电场强度、电泳时间和样品加载量等参数，以确保实验结果的准确性和重现性。

同时，还需要注意实验操作的规范性，避免样品交叉污染和凝胶结构破坏等问题。

不连续凝胶电泳示意图