氨基酸的薄层层析

生物化学实验报告

姓名：

学号：

专业年级：

组别：

生物化学与分子生物学实验教学中心

实验名称氨基酸的薄层层析

实验日期2018-11-7 实验地点

合作者指导老师

评分教师签名批改日期

一、实验目的

1、掌握薄层层析法的一般原理。

2、掌握氨基酸薄层层析法的制版、点样、层析和显色等基本操作技术。

3、掌握如何根据移动速率（Rf值）来鉴定被分离的物质（即本次实验中氨基酸混合液）。

二、实验原理

1、薄层层析原理（色谱分析技术的一种）：

一般是将固体吸附剂涂布在平板上形成薄层作为固定相。当液相（展开溶剂）在固定相上流动时，由于吸附剂对不同氨基酸的吸附力不一样，不同氨基酸在展开溶剂中的溶解度不一样，点在薄板上的混合氨基酸样品随着展开剂的移动速率也不同，因而可以彼此分开。（即通过吸附-解吸-再吸附-再解吸的反复进行，而将样品各组分分离开来）

2、氨基酸与茚三酮的显色反应：

茚三酮水化后生成水化茚三酮，它与氨基酸的羧基反应生成还原茚三酮、氨及醛，与此同时，还原茚三酮又与氨及茚三酮缩合生成紫红化合物而使氨基酸斑点显色。

3、以相对迁移率-Rf值来判定氨基酸的种类：

层析中，物质沿溶剂运动方向迁移的距离与溶液前沿的距离之比为Rf值。

Rf=原点到层析斑点中心的距离/原点到对应斑点前沿的距离

由于物质在一定溶剂中的分配系数是一定的，故移动速率（Rf值）也是恒定的，因此可以根据Rf值来鉴定被分离的物质。

三、材料与方法：

1、实验材料：

（1）实验试剂：氨基酸的异丙醇溶液：丙氨酸、精氨酸、甘氨酸

分析样品：混合氨基酸溶液

吸附剂：硅胶

粘合剂：0.5%的羧甲基纤维素钠

展开-显色剂（正丁醇、乙酸、茚三酮溶液）

（2）实验器材：天平、层析板、尺子、铅笔、烧杯、玻璃棒、量筒、毛细玻璃管、层析缸、药匙、烘箱

2、实验方法：

（1）实验流程：

（

2）实验步骤：

步骤操作

①制作硅胶层析板1、调浆称取硅胶3克，加0.5%的羧甲基纤维素钠8毫

升，调成均匀的糊状。

2、涂布取洁净的干燥玻璃板均匀涂层。

3、干燥将玻璃板水平放置，室温下自然凉干。

4、活化70℃烘干30分钟。切断电源，待玻璃板面温度

下降至不烫手时取出。

②在层析板上加氨基酸样品1、标记：用铅笔距底边2cm水平线上均匀确定4个点。每个样品间相距约1cm。

2、取样：用毛细管分别吸取氨基酸溶液，取样量为毛细

管柱高5cm。

3、点样：点样毛细管轻轻接触薄层表面点样。加样后原

点扩散直径不超过2mm。

③对氨基酸样品层析将薄层板点样端浸入展层-显色剂，展层-显色剂液面应低

于点样线。盖好层析缸盖，上行展层。当展层剂前沿离薄

板顶端2cm时，停止展层，取出薄板，用铅笔描出溶剂

前沿界线

④对氨基酸样品显色用热风吹干或在85℃下烘干，即可显出各层斑点。

3、注意事项：①吸附剂：薄层层析用的吸附剂硅胶的颗粒大小一般以通过200目左右

筛孔为宜

②点样：次数依照样品的溶液浓度而定，样品量太少有的成分不易显示；

样品量太多易造成斑点过大，相互交叉或拖尾。

③避免污染，切勿用手直接接触薄层板面，必要时戴上手套。

四、结果与讨论：

1、实验现象：

（1）制作层析板时，硅胶粉末加入羧甲基纤维素钠的乳酸后搅拌变为淡白色糊状。

（2）层析缸中的展层-显色剂无色透明但具有强烈刺激性气味，将薄层板置入其中氨基酸无显色。

（3）烘干后的层析板可见深浅不一的斑点精氨酸较深，丙氨酸次之，甘氨酸最浅。氨基酸混合液中出现了3个斑点。

2、图片展示：

3、数据记录：

从点样线到溶剂前沿线之间的距离为6.90cm

公式：Rf =原点到层析斑点中心的距离/原点到对应斑点前沿的距离

样品

斑点-原点 溶剂前缘-原点 Rf 值 Arg

0.50 6.30 0.08 Gly

1.80 5.10 0.35 Ala

2.70 4.20 0.64 混合点1

混合点2

混合点3 0.40 1.90 2.70 6.50 5.10 4.30 0.06 0.37 0.63

物质在一定的溶剂中的分配系数是一定的，故移动速率也是恒定的，因此可根据Rf 值来鉴定被分离的物质。混合氨基酸溶液的混合点1、2、3与丙氨酸、精氨酸和甘氨酸显点样线

溶剂前沿界线 2.70cm 4.20cm 0.5.cm

6.30cm 1.80cm

5.10cm

色反应所出现的位置及Rf值均相似，因此混合氨基酸的成分可能为丙氨酸、精氨酸和甘氨酸的混合物，本次实验结果有效。

6、误差分析：

（1）薄层板的平整度及硅胶分布的均匀程度均会影响实际试验结果。

（2）每个人测量时所取的中心点不同，测量的距离也会有所不同进而影响到实验结果。

（3）层析时间、点样的量以及用手直接接触薄层板面也会影响到结果。

7、思考题：

（1）硅胶的吸附力与含水量的问题：硅胶属于极性吸附剂含水量过多会导致单位体积硅胶颗粒的减少，从而降低硅胶的吸附力。硅胶的吸附力与含水量呈负相关，含水量越高，活度级数越高。

（2）实验中吸附剂的选择依据：

依据被吸附的吸附质和实验温度。如果被测成分极性大应选择吸附性较弱的吸附质，若具有亲脂性则选择吸附性强的吸附质。

（3）氨基酸纸层析，两者的区别：

层纸析不用铺板，固定相是水，吸附性较弱，展开剂的极性较强；薄层层析要用硅胶做层析板，固定相是硅胶，吸附性较纸层析强，展开剂的极性一般。