细菌总数的测定

细菌总数的测定

水与人类的生产活动和日常生活息息相关。经济建设的高速发展，往往会使生活用水的水源水受到水中有害有毒物质的污染；而生活污水、人、畜粪便会使甚或用水的水源水受到腐生性微生物的污染。被污染的水都不宜饮用。当水体中含大量的病原问生物是往往会引起传染病的发生，人体和动物体的肠道中大约有400多种细菌，虽然，其中的腐生菌进入水体不会引发人类的疾病，但随着粪便一起排除的致病菌，如霍乱弧菌、伤寒沙门氏菌、痢疾志贺氏菌、阿米巴虫、脊髓灰质炎病毒和传染性感染病毒等致病性微生物，则会引发人体的肠道传染病。为保护人体健康，防止因水源水污染而造成的疾病发生和流行，必须对生活用水及其水源水进行严格的水中细菌学检查。

测定水样是否合乎引用标准，一般包括：水中细菌总数测定和大肠菌群测定。本实验以自来水和天然水为水样进行细菌总数的测定

一、实验目的

（1）学习水样的采取和水样中细菌总数测定的方法

（2）了解和掌握平板菌落计数的原则

二、试验原理

水中的细菌数可反映出水体被有机物污染的程度。细菌总数越多，说明水中有机物的含量就越高，本试验应用平板菌落计数来测定水样中的细菌总数。由于水中细菌的种属不一，它们对营养成分和生长条件的要求差别很大，不可能设计出一种培养基在同一固定的条件下，能满足水中所有细菌的营养要求使其都能生长繁殖，形成菌落。然而，肠道中的绝大多数腐生性和致病性的细菌，可在营养丰富的牛肉膏蛋白胨培养基上进行生长，出现肉眼可见的菌落，虽然这样设计出来的水中细菌的总数实际上是一种近似值，但它基本上能代表水样中细菌的数量。故而水中的细菌总数的测定和计算是指：在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上，1ml水样，经37℃，24h培养后所生出来的总菌数（包括腐生和致病细菌），我国饮用水的

卫生学指标规定：在1ml自来水中细菌总数不得超过100个（1×102）。

三、试验材料和用具

（1）培养基牛肉膏蛋白胨琼脂培养基

（2）用具灭菌三角烧杯（体积为50ml或100ml），具玻塞的试剂瓶（体

积为250ml，需灭菌），灭菌培养基（Ф=9cm ），灭菌吸管或灭菌的

塑料吸嘴，稀释水样用无菌水（在Ф16mm×160mm试管中加9ml

蒸馏水，灭菌），酒精

四、试验方法

（1）以无菌操作、用10倍稀释法稀释水样。

（2）用平皿倾注制备待测水样平皿。

五、实验内容

1、水样的采取

（1）自来水先将自来水龙头用火焰（酒精灯火用长柄镊子夹酒精棉球）灼烧2-3min灭菌，再开启水龙头水水流出5min。以灭菌三角烧杯接取水样，待测（为节约用水，自来水龙头一次灭菌后，试验者依次采取水样）。

（2）池塘水、河水或湖水应取距水面10-15cm的深层水样。先将已灭菌具玻

璃的试剂瓶，瓶口向下浸入水中，在水中翻转式瓶口向上，开启瓶塞，待水盛满后，在水中将瓶塞盖好，再取出水面。取样后应立即进行试验。如不能马上进行试验，应于4℃冰箱保存。

2、细菌总数测定

（1）自来水（以下操作均需用无菌操作法进行）

○1用灭菌吸管或微量家养器吸取1ml水样，注入灭菌培养中，共做2个平皿。○2分别向平皿中倾注15-20ml熔化并冷却到45℃左右的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，制成平板，并立即轻轻摇匀（切忌溅到皿盖上），使水样于培养基充分混合。○3取另一平皿，只加培养基，不加水样，作为空白对照平板。

○4待培养基充分凝固后，倒置于37℃温箱内，培养24h，进行菌落计数。

○52个平板的平均菌落数即为1ml水样的细菌总数。

（2）池塘水、河水或湖水

○1水样稀释。取1ml水样水加入到第一支装有9nl无菌水的试管中，振荡均匀，水样被稀释10倍，稀释度为10-1，再从此管中吸取1ml稀释水样介入到第二支装有9ml无菌水的试管中，振荡均匀，水样被稀释100倍，稀释度

为10-2，如此稀释则水样被稀释1000倍，10000倍……稀释度分别为10-3、10-4、……。稀释倍数视水样污浊程度而定，中度污浊水样可稀释到10-3~10-4，中度污浊水样可稀释到10-4~10-5。

○2吸取稀释后水样

方法1：用无菌吸管或微量加以昂起分别从低稀释度向高稀释度吸取1ml水

样，即10-1（1ml）→10-2（1ml）→10-3（1ml），每一稀释度需用一支无菌吸

管或塑料吸嘴，不可用同一吸管连续吸取，不然，培养后出现的菌落数偏高，误差大。

方法2：用同一无菌吸管或微量加样器，可从高浓度向低浓度连续吸取1ml

水样，即10-3（1ml）→10-2（1ml）→10-1（1ml），由于高稀释度10-3比10-2

的菌数少，用同一吸管逐次连续吸取1ml，培养后的菌落数，偏差不大，此法快速，简便。

○3向每一个加油不同稀释度水样的平皿内，倾注15-20ml培养基，混匀，每个稀释度做2皿，计数时取2个拼版菌落数的平均数，作为该稀释度的菌落数。另作不加水样平板为空白对照。

○437℃温箱，倒置培养24h，进行菌落计数。

3、菌落计数方法

（1）计算相同稀释度的平均菌落数细菌的菌体是微小的颗粒，在水中呈悬浮状态而不像可溶性化学药品在水中均匀分布呈真溶液。由于细菌在水中分布不均一，故取时1ml菌悬液中菌数的随机性很大，在加上水样与培养基的混合不够充分，有是培养后平板中长出的菌落不单一，成片状菌苔，故部分成片状。技术是，若其中一个平板有较大片状菌苔生长时，弃之，不采用。

取另一无片状菌苔的平板菌落数作为该稀释度的平均菌落数。若片状菌苔仅占整个平板的1/2，而其余的菌落分布十分均匀，则可将菌落数乘以2代表

全平板的菌落数，然后，再按下述原则机端该稀释度的平均菌落数。

（2）首先选择平均菌落数在30-300之间稀释度的平板，当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，则以该平均菌落数乘以稀释倍数，作为该水样的细菌总数进行报告。如表一中例次1，10-2,稀释度平板的平均菌落数为164，而10-2为1365，10-3为20，均不在30-300范围内，故取10-2 稀释度164个菌落数为平均菌落数，以16400或1.6×10-4个/ml作为该水样的细菌总数。（3）若有两个稀释度的平均菌落数均在30-300之间，则按两个稀释度菌落总数的比值来决定取数。如比值小于2，应取两者的平均值，乘以稀释倍数进行报告，如表1中例次2，10-2,稀释度的平均菌落数为295，10-3为46，两者均在30-300的范围内，而菌落数比值为1.6（10-3为46，换算成10-2为

460，10-2为295，则460÷295=1.55≈1.6），取量稀释度菌落数的平均值为

37750（29500+46000）÷2=37750，以37750或3.8×104个/ml作为该水样的细菌总数。同法计算，表1中例次3的菌落数的值大于2，则取其较小的细菌总数271（10-2）进行报告。

（4）若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的品均菌落数乘以稀释倍数进行，见表1中的例次4。

（5）若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释配属进行报告。见表1中的例次5.

（6）若所有稀释度的平均菌落数均均不在30-300之间，则以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数进行报告，见下表中例次6。