利用离子液体_BMIM_2_CR_萃取牛血清蛋白的研究

Study on the BSA extraction by ionic liquid of ［BMIM］2 ［CR］
LOU Ben-zhuo
（ School of Physics and Telecommunication Engineering，Shaanxi University of Technology，Hanzhong 723003，China）
pH 为 4，5，6，7，8，9，10 的缓冲液中搅拌 30 min 后 静置分层，取上层液作定量完成反相萃取。
图 2 萃取剂浓度对萃取效率的影响 Fig． 2 The influence of concentration on extraction efficiency
1． 4． 4 离子强度对萃取效率的影响实验 将 1 mL 浓度为 10 mmol / L 的萃取相加入 pH = 4 与浓度为
上层液作定量分析。
1． 4． 3 pH 值对萃取效率的影响实验 将 1 mL 浓
度为 10 mmol / L 的萃取相分别加入 pH 为 2，3，4，5，
6，7，8，9，10 且浓度为 0． 03 mg / L 的 BSA 水溶液中
搅拌 30 min 后静置分层，取上层液作定量完成正相
萃取。取正相萃取完的离子液体层加入等体积的
图 3 搅拌时间对萃取效率的影响 Fig． 3 The influence of stirring time on extraction efficiency
2． 3 pH 值对萃取效率的影响 一般的亲和性染料中都含有磺酸根，而且磺酸
根的酸离解常数极低，所以在一般实验条件下，磺酸 根上的氢会游离使得亲和性染料带负电，便可与蛋 白质上的质子化位点相结合。有关研究指出蛋白质 与磺酸类亲和性染料之间的吸引力主要为库仑静电 力，为了进一步确认亲和性染料与蛋白质之间的作 用机制，在此通过改变缓冲溶液的 pH 值，以观察正 向与反向萃取 BSA 时其萃取效 率 的 变 化，结 果 见 图 4。
液相 /液相萃取是一种常用的化合物分离技术， 它是通过有机溶剂和水溶液形成互不相溶的两相， 再利用预分离化合物在两相中分布不同而实现分离 的［1-2］。然而传统有机溶剂常具有易燃、有毒及高挥 发性等缺点，不仅使得萃取实验存在危险性，还容易 造成环境污染［3-4］。因此，寻找能降低对环境污染的 安全分离溶剂是一项重要课题。
图 4 pH 值对萃取效率的影响 Fig． 4 The influence of pH value on extraction efficiency
由图 2 可知，当没有添加［BMIM］2［CR］萃取剂 时，仅约 35% 的 BSA 被萃取到离子液体层； 随着萃
0． 03 mg / L 的 BSA 水溶液中，搅拌 30 min 后静置分 层，取上层液作定量完成正相萃取。取正相萃取完 的离子液体层加入含 1． 0 mol / L 的 NaSCN 缓冲液搅
DRX-300 型核磁共振仪； ODS-3 型液相层析管 柱； Degasys DG 2410 型梯度泵浦； EBA20 型离心机； Q600 型热重分析仪； HP4890D 型圆二相色谱仪。 1． 2 离子液体的配制
将 0． 7 g CR 与 1． 6 g AgNO3 溶于 200 mL 去离
收稿日期： 2012-05-02 修改稿日期： 2012-06-11 基金项目： 国家自然科学基金（ 4110510） ； 陕西省自然科学基础研究计划基金（ 2012JM6016） ； 陕西省教育厅专项科研计划
Abstract： An environmental friendly ionic liquid ［BMIM］2［CR］with affinity is synthesized by ionic exchange and the bovine serum albumin （ BSA） is extracted by this new type of extracting agent． The results showed that the optimum conditions of BSA extraction are 10 mmol / L of ionic liquid concentration， 30 min of extraction time and in acidic solution，and the extraction efficiency can be above 90% ． This studied providing certain feasibility conditions for protein extraction application． Key words： room temperature ionic liquids； Congo red； bovine serum albumin； extra BSA 萃取实验的基本流程 Fig． 1 Experimental process of BSA extraction
1． 4． 1 萃取剂浓度对萃取效率的影响实验 将 取。
1 mL 浓 度 分 别 为 2． 5，5，7． 5，10，12． 5，15，17． 5， 20 mmol / L的 萃 取 相 分 别 加 入 等 体 积 且 浓 度 为 0． 03 mg / L 的 BSA 水溶液搅拌 30 min 后静置分层， 取上层液作定量分析。 1． 4． 2 萃取时间对萃取效率的影响实验 将 1 mL 浓度为 10 mmol / L 的萃取相加入 pH = 4 与浓度为
取剂［BMIM］2［CR］的添加及其浓度的增加，BSA 的 萃取效率迅速增大； 当浓度增加到 10 mmol / L 时， BSA 的萃取效率几乎达到 100% 且趋于恒定。这表
拌 30 min 后静置分层，取上层液作定量完成反相萃 明当选用含有 10 mmol / L 的［BMIM］2［CR］离子液
由图 4（ a） 可知，BSA 的正向萃取效率随 pH 值 的升高而降低，由于 BSA 的等电位点 pI = 4． 6，所以 当 pH 在 4 ～ 6 时，BSA 的萃取效率明显下降，若溶 液偏碱性，则正向萃取效率几乎为 0。由图 4（ b） 可 知，BSA 的反向萃取效率随缓冲溶液的 pH 值升高 而增加，最高可达 55% 左右。这说明在［BMIM］2 ［CR］/ IL 离子液体中 BSA 的萃取效率都会受到静 电吸引力的影响，刚果红是以负电荷形式与蛋白质 互相吸引而结合的，蛋白质基团所带电荷量随 pH 值变化而变化； 即在低 pH 值时，BSA 上所带正电荷 越多，可得最佳正向萃取效率，若在高 pH 值时，由 于静电排斥力的作用，蛋白质可脱离亲和性染料而 得到较好的回收效果，由此可以推测在本实验条件 下库仑力是一种亲和性染料刚果红与 BSA 的结合 作用力。
1． 3 盐类缓冲液的配制 将 浓 度 为 0． 05 mol / L 的 KCl 与 浓 度 为
0． 1 mol / L 的 HCl 混合，并将 pH 调至 1． 0 ～ 2． 2 即 可。 1． 4 实验方法
BSA 萃取实验大致分为正向萃取与反向萃取两 部分，其 基 本 流 程 见 图 1。 将 含 有 一 定 浓 度 的 ［BMIM］2［CR］离子液体加入到 BSA 水溶液中，以 磁石搅拌一段时间后静置 1 h，取上层溶液作正向萃 取定量测试。取一定量的正向萃取完的离子液体层 加入到盐类缓冲液中，以磁石搅拌一段时间后静置 1 h，取上层溶液作反向萃取定量测试。
2 结果与讨论
2． 1 萃取剂浓度对萃取效率的影响 当 pH = 4 时，利用不同浓度的［BMIM］2［CR］
离子液 体 萃 取 浓 度 为 0． 03 mg / L 的 BSA，结 果 见 图 2。
0． 03 mg / L 的 BSA 水溶液中，分别搅拌 0． 5，1，5，
10，15，20，25，30，35，40，45，50 min 后静置分层，取
取将 BSA 萃取到离子液体中，研究了萃取剂浓度、 萃取时间、pH 值与离子强度等对萃取效率的影响， 以期拓展离子液体在液相 / 液相萃取方面的应用，并 实现环保安全的目的。
1 实验部分
1． 1 试剂与仪器 CR、AgO3、［BMIM］［Cl］、HCl、KCl 均为保证试
剂； CH3 OH、CH3 COCH3 、乙腈均为色谱纯； 牛血清蛋 白（ BSA） ，分子量为 68KD，总蛋白含量≥95． 0% ，总 蛋白中 BSA 纯度≥98． 0% ，pH 为 6． 5 ～ 7． 1，硫酸铵 含量≤0． 1% 。
第8 期
娄本浊： 利用离子液体［BMIM］2［CR］萃取牛血清蛋白的研究
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体进行 BSA 萃取时可获得较高的稳定的萃取效率。 2． 2 萃取时间对萃取效率的影响
利用［BMIM］2［CR］离子液体萃取 BSA 时，搅 拌时间对萃取效率的影响，见图 3。当搅拌时间为 5 min 时，BSA 的萃取效率可达 85% 左右； 搅拌时间 上升到 20 min 时，BSA 的萃取效率可达到 80% 以 上； 继续增加搅拌时间至 30 min 时，BSA 的萃取效 率可达到 95% 以上，而且完全可使萃取达到平衡。 因此，将萃取搅拌时间定为 30 min。
项目资助课题（ 11JK0553） 作者简介： 娄本浊（ 1982 － ） ，男，山东济南人，陕西理工学院讲师，硕士，主要从事光学技术在生化领域的应用研究。电
话： 13488458836，E － mail： lunwen_8686@ 163． com
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应用化工
第 41 卷
子水中，在 室 温 下 持 续 搅 拌 24 h，将 所 得 溶 液 以 5 000 r / min 转 速 离 心 10 min 将 水 相 去 除，再 用 20 mL 冰水清洗沉淀物 3 次； 放入烘箱中在 50 ℃ 保 温 96 h 可得暗红色固体［Ag］2［CR］，将［Ag］2［CR］ 溶于 100 mL 乙腈中并加入［BMIM］［Cl］在 40 ℃ 下 持续搅拌 72 h； 最后将所得溶液以 5 000 r / min 转速 离心 10 min 去除 AgCl，再用旋转浓缩机去除乙腈即 可得到萃取剂［BMIM］2［CR］。将上述所得萃取剂 ［BMIM］2［CR］溶 于 一 定 量 的［BMIM］［PF6］中，加 入等体积去离子水并长时间搅拌，以便使萃取系统 充分水相平衡，然后去除水相，再加入等体积去离子 水即可。