ln-蛋白质的修饰与讲解
8蛋白质的化学修饰
应性的因素
基团之间的功能障碍
超反应性：蛋白质的某个侧链基团与个别试剂能发生非常 迅速的反应。
多数蛋白质的功能基与简单氨基酸中的同样基团相比，反应性
要差。但是，每个蛋白质分子中至少有一个基团对一定的试剂
显示出超反应性。
影响超反应性的因素：
木瓜蛋白酶中的19个酪氨酸残基， 只有一个能与修饰剂反应，修饰
（一）试剂的选择
选择试剂在很大程度上要依据修饰目的。
对氨基 的修饰
修饰所有氨基，而不修饰其它基团; 仅修饰α-氨基；
修饰暴露的或反应性高的氨基，以及 修饰有催化活性的氨基等。
修饰的部位和程度一般可用选择适当的试剂和反应条件 来控制。
如果修饰的目的是改变蛋白质的带电状况或溶解性， 必须选择能引入最大电荷量的试剂。
OH
HO O C
（三）静电效应
F
Br
OH
水杨酸
研究表明，不同蛋白质中的组氨酸残基的pk值是不同
的，原因是由于带电基团相互影响所致。
例如：碳酸酐酶和葡萄球菌核酸酶各有4个组氨酸残基，其pk 值是：
碳酸酐酶： 5.91； 6.04； 7.00； 7.23
葡萄球菌核酸酶： 5.37； 5.71； 5.74； 6.50
NO2
NO2 SO3H + NH2R pH﹥7
NO2
TNBS
NO2
NO2 NHR + SO3H+H+
NO2
（黄色）
（三）引入负电荷的修饰
1.乙酰化 此反应类似于醋酸酐与氨基的反应，但酸酐所带的负电 荷全部引入到侧链上。
O C CH2 pH﹥7
O
O
ENZ—NH2 + O C CH2
蛋白质的修饰和表达
蛋白质的修饰和表达是蛋白质工程的重要
研究内容和手段。将从蛋白质修饰的化学
途径、蛋白质改造的分子生物学途径和重
组蛋白质的表达进行讲解。
第一节 蛋白质修饰的化学途径
蛋白质的化学修饰：凡通过活性基团的引 入或去除，而使蛋白质的一级结构发生改 变的过程。 有些情况下，化学结构的改变并不影响蛋 白质的生物学活性，这些修饰称为非必需 部分的修饰。但多数情况下，蛋白质结构 的改变将导致生物活性的改变。
（二）定向进化 在实验室中模仿自然进化的关键步骤—突变、重 组和筛选，在较短的时间内完成漫长的自然进化 过程，有效的改造蛋白质，使之适于人类的需 要。，这种策略只针对特定蛋白质的特定性质， 因而被称为定向进化。 需要两项支撑技术，一是产生大量突变体为进一 步筛选提供丰富的素材；二是有合适的筛选系统， 可迅速从突变题库中筛选到符合目标的蛋白质。
蛋白质侧链的化学修饰是通过选择性试剂 或亲和标记试剂与蛋白质分子侧链上特定 的功能基团发生化学反应而实现的。
（一）巯基的化学修饰 由于巯基有很强的亲核性，巯基基团一般 是蛋白质分子中最容易反应的侧链基团。 烷基化试剂是一种重要的巯基修饰试剂， 特别是碘乙酸和碘乙酰胺。氨基酸测序前， 常用碘乙酸来使巯基基团羧甲基化，以防 止半胱氨酸的降解。 其他一些卤代酸、卤代酰胺也可以修饰巯 基。 N-乙基马来酰亚胺也是一种有效的巯基修 饰试剂，该反应具有较强的专一性并伴随 光吸收的变化。
5，5-二硫-2-硝基苯甲酸（DTNB）是目前 最常用的巯基修饰试剂之一，可与巯基反 应形成二硫键，使蛋白质分子上标记1个2硝基-5-硫苯甲酸（TNB），同时释放一个 有颜色的TNB阴离子，该离子在412nm有很 强的吸收，可以通过光吸收变化来检测反 应程度。
蛋白质的化学修饰
连四硫酸钠或钾 是一温和的氧化剂， 常用于-SH的可逆 保护剂。
2.1.4 芳香环取代反应
蛋白质AA残基的酚羟基在3和5位上易于发生亲 电取代的碘化和硝化反应。这类修饰反应的典 型例子为四硝基甲烷(TNM), 可以作用于Tyr的 酚羟基, 形成3-硝基Tyr衍生物。这种产物有特 殊光谱，可用于直接的定量测定。
-H2O
[H]
P-NH2 + RCHO +H2O P-N=CHR
P-NH-CH2R
2.3.2 电荷消失的修饰
这 不带类电试。剂可抑制Lys--NH2的质子化, 使形成的衍生物 1. 乙酰化：在微碱性pH下，氨基与乙酸酐反应生成 乙酰化衍生物。
2. 芳香化：三硝基苯磺酸与氨基作用, 生成的衍生物 为黄色，可定量测定-NH2。 (其它:DNFB\DNS)
2.1 特定的AA残基侧链 基团的反应试剂（4种）
2.1.1 酰化及其相关反应
这类化学修饰试剂如乙酰咪唑、酸酐磺酰氯、 硫代三氟乙酸乙酯和O-甲基异脲等，在室温 (20ºC~25ºC)，pH 4.5 ~9.0的条件下可与蛋白质某些 侧链基团如 -NH2、-OH、-SH及酚基等发生酰基化 反应。
2.1.2 烷基化反应
此类试剂 ( 如DNFB、碘代乙酸、碘代乙酰胺、苯 甲酰卤代物、碘甲烷等 ) 常带有活泼的卤素原子， 因其电负性而使烷基带部分正电荷，易于导致蛋 白质分子的亲核基团 ( 如-NH2、-SH、 -COOH、 -SCH3和咪唑基 ) 发生烷基化。
2.1.3 氧化和还原反应
H2O2、N-溴代琥珀酰亚胺等具有很强氧化性，能 将侧链基团( -SH\-SCH3\吲哚基\咪唑基和酚基)氧 化, 往往易使肽链断裂(故要控制好氧化条件); 光 敏剂存在下的光氧化是比较温和的氧化作用。
化学修饰蛋白质的方法与应用
化学修饰蛋白质的方法与应用蛋白质是生命体内重要的基础物质，分子量一般在5000以上，由氨基酸组成。
蛋白质的功能非常多样，有结构性、调节性、催化性等多种作用。
因此，对蛋白质的研究在生命科学和药物科学领域中具有非常重要的地位。
为了更好地探究蛋白质的结构和功能，化学修饰蛋白质的方法被广泛应用。
一、化学修饰蛋白质的方法化学修饰蛋白质的方法主要包括两个方面：一是针对蛋白质的功能模块进行改变；二是引入新的基团或修饰方式。
1、氨基酸侧链化学修饰氨基酸侧链化学修饰是利用一些化学试剂或反应，在特定位置上改变蛋白质分子中的氨基酸基团，从而改变蛋白质的物化性质和生物活性。
比较常见的氨基酸侧链修饰方法有酰化、烷基化、氧化、还原、磷酸化等。
2、蛋白质上添加化学基团由于蛋白质的生物活性和分子间的相互作用都是靠特定的侧链基团实现的，因此在蛋白质的结构上引入新的功能基团，可以增加其生物活性和特异性，从而实现新的应用。
比较适合作为蛋白质化学修饰的基团包括绿色荧光蛋白、生物素等。
3、非天然氨基酸引入非天然氨基酸的加入是一种比较常见的蛋白质化学修饰方法。
这些非天然氨基酸通常会被特定的遗传密码测序给出的密码子所识别，可以被插入到蛋白质中，参与构成蛋白质的构象和功能。
比较常见的非天然氨基酸有光敏氨基酸、荧光氨基酸、二氢-2-吡啶酮酸等。
二、化学修饰蛋白质的应用化学修饰蛋白质的方法具有广泛的应用前景，下面用几个应用进行简单描述。
1、抗肿瘤药物蛋白质化学修饰可以让药物的靶向性更加明确、准确。
举例说明，目前针对癌症治疗的药物通常使用抗体、寡肽等多肽分子，但因为基因重组技术的限制，其生产过程较为困难，造价愈显得高昂。
近年来基于化学修饰的肽药研究已经络绎不绝，通过这种方法可以使药物分子变得较为精确,效果明显。
2、蛋白质药物由于蛋白质药物的高效、低毒性被临床医生广泛认可，在药物研究领域中占据了举足轻重的地位。
然而，由于其复杂的化学结构、多肽组成等特点，蛋白质的制备和纯化过程非常复杂，且成本较高。
蛋白质的修饰
第二节 蛋白质的分子生物学改造
蛋白质主链结构的化学修饰 基因突变和基因融合
一、基因突变
定点诱变
定点诱变分为三类： （1）通过寡聚核苷酸介导的基因诱变； （2）盒式诱变或片段取代诱变； （3）利用聚合酶链式反应，以双链DNA 为模板进行的基因诱变。
1、通过寡聚核苷酸介导的基因诱变
通过添加、删除、置换DNA序列上的核苷酸， 特异地产生个别氨基酸的突变
部位，如酶的活性部位、膜蛋 白质上的激素结合部位等位点 的专一性——亲和标记
1、亲和标记
亲和标记：试剂对蛋白质分子中被修饰的部 位的专一性修饰，称为亲和标记或专一性的 不可逆抑制作用。
亲和标记试剂，不仅具有对被作用基团的 专一性，而且具有对被作用部位的专一性， 即试剂作用于被作用部位的某一基团，而不 与被作用部位以外的同类基团发生作用。这 类修饰试剂也被称为位点专一性抑制剂。
（5）双链M13DNA的富集，可用超离心、凝胶电泳等手 段。将上述反应混合物中的双链M13DNA部分纯化、富集。
（6）含突变基因的M13噬菌体的筛选。将合成的双链 DNA转化为大肠杆菌F+菌株。用上述诱变引物做成标记 探针，对转化产生的噬菌斑在不同温度下杂交，选出表 现阳性的噬菌斑克隆，它们可能含有所要求的诱变基因。
（5）光亲和标记的反应中间物应该是高活性。
（6）高反应活性的中间物能够和受体蛋白质 最终形成稳定的共价结合产物。
4、光亲和标记的优点：
（1）光亲和标记试剂在暗条件下呈化学惰性 物质。
（2）通过光照很容易控制其标记的程度、标 记速度。
（3）光反应产物的中间产物具有高活性，可 以标记在一般情况下反应活性很低的疏水残基 和亲核氨基酸残基。也就是说，蛋白质的所有 氨基酸残基极化都可以被标记。
ln蛋白质的修饰与讲解
cAMP激活 PKA影响糖代谢示意图
调节基因表达
调节细胞极性
PKA亦可通过磷酸化作用激活 离子通道，调节细胞膜电位。
PKC signaling
激素
EGFR介导的信号转导过程
催化蛋白质去磷酸化的蛋白磷酸酶
第二节 蛋白质的降解
细胞内的蛋白质分子处于一动态平衡过程中。 进行自我更新。
蛋白质降解途径： 泛素-蛋白酶体系统（ubiquitin-proteasome system,UPS） 自噬溶酶体（autophagy-lysosome）系统
蛋白质分子降解的生理功能： 1、清理不正常蛋白质的管家功能 2、破坏正常蛋白质的调节功能
第二章 蛋白质的修饰与降解
第一节 蛋白质的修饰
蛋白质的翻译后修饰指对蛋白质进行 共价加工的过程，可调节蛋白质的活性、 定位、折叠、以及蛋白蛋白相互作用。
磷酸化 脂基化 甲基化 乙酰化 糖基化 SUMO化 巴豆酰化
一、磷酸化
磷酸化 去磷酸化 催化磷酸化的蛋白激酶
蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶 PKA PKC PKG 蛋白质酪氨酸激酶 PTK
蛋白质SUMO化
E1活化酶、E2结合酶、E3连接酶 SUMO的C-端Gly残基和底物蛋白Lys的-
氨基间形成一个异肽键
SUMO的C-末端短肽切除，暴露出GlyGly模特序列，使其变成成熟的功能蛋 白
去SUMO化 Ulp
蛋白质SUMO化
Ulp Ulp
SUMO化修饰的生物学作用
底物多为转录调节因子或共调节因子 参与维持基因组的完整性及调节染色体
Transfection
蛋白质分子的化学修饰课件
催化去磷酸化反应的酶，将蛋白 质上的磷酸基团去除。
蛋白质磷酸化修饰 磷酸化修饰的种类
调节蛋白质活性
磷酸化修饰可改变蛋白质 的构象或活性位点，从而 调节其功能。
参与信号转导
磷酸化修饰在细胞信号转 导过程中起着关键作用， 可影响细胞生长、分化、 代谢等过程。
蛋白质稳定性
磷酸化修饰可影响蛋白质 的稳定性，通过调节蛋白 质降解途径来影响细胞内 蛋白质水平。
2023
PART 04
蛋白质甲基化修饰
REPORTING
甲基化修饰的种类
赖氨酸甲基化
赖氨酸残基的ε-氨基上加上甲基 基团，包括单甲基化、二甲基化
和三甲基化。
蛋氨酸甲基化
蛋氨酸残基的α-氨基上加上甲基基 团，通常为N-甲基化。
精氨酸甲基化
精氨酸残基的胍基上加上甲基基团 ，包括N-甲基化和N,N-二甲基化。
2023
PART 03
蛋白质糖基化修饰
REPORTING
糖基化修饰的种类
O-糖基化
糖基磷脂化
发生在蛋白质的丝氨酸或苏氨酸的羟 基上，由糖苷酶催化。
将糖基连接到脂质分子上，形成糖脂 。
N-糖基化
发生在蛋白质的氨基上，由糖苷酶催 化。
糖基化修饰的酶类
糖基转移酶
催化糖基从供体转移到受体上。
糖苷酶
催化糖苷键的断裂，释放出糖基 。
泛素化
泛素化是指将泛素分子加到蛋 白质的特定位点上，可以调节 蛋白质的降解和功能。
甲基化
甲基化是指将甲基基团加到蛋 白质的特定位点上，可以调节 蛋白质的构象和与其他蛋白质
的相互作用。
蛋白质分子化学修饰的功能
调节蛋白质活性
调节蛋白质稳定性
蛋白质的修饰和表达
2、共价结合法 是酶蛋白分子上功能团和固定支持物表面
上的反应基团之间形成化学共价键连接， 以固定酶的方法。 常用载体为：天然高分子（纤维素、琼脂 糖、淀粉等），合成高聚物（尼龙、多聚 氨基酸），无机支持物（多孔玻璃）
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影响因素：1）要求载体亲水，并且有一定 的机械强度和稳定性，同时具备在温和条 件下与酶结合的功能基团
活性很高的基团，是蛋白质或多肽分子比 较容易与修饰剂发生作用的位点。 常见的修饰剂有三硝基苯磺酸、烷基化试 剂、氰酸盐以及盐酸吡哆醛等。
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（三）羧基的化学修饰 谷氨酸、天冬氨酸 修饰方法很有限，产物一般是脂类或酰胺
类。
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（四）二硫键的化学修饰 一般用变性剂如巯基乙醇，将二硫键还原
四、蛋白质的化学交联和化学偶联
化学交联可以发生于分子内的亚基与亚基 之间，也可以发生与蛋白质分子与分子之 间，也可以发生于蛋白质分子与分子之间， 也可发生于多个分子之间，而形成网状交 联。交联剂为含有双功能基团的化学试剂。 如戊二醛
蛋白质的化学偶联是指将蛋白质分子偶联 到一个化学惰性的水不溶性载体上，形成 固定化蛋白质。
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（二）定向进化 在实验室中模仿自然进化的关键步骤—突变、重
组和筛选，在较短的时间内完成漫长的自然进化 过程，有效的改造蛋白质，使之适于人类的需 要。，这种策略只针对特定蛋白质的特定性质， 因而被称为定向进化。 需要两项支撑技术，一是产生大量突变体为进一 步筛选提供丰富的素材；二是有合适的筛选系统， 可迅速从突变题库中筛选到符合目标的蛋白质。
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2、快速定点突变 首先准备质粒：必须是从常规E.coli中经纯化试剂
盒(Miniprep)或者氯化铯纯化抽提的质粒。 然后，设计一对包含突变位点的引物（正、反
蛋白修饰分析报告
蛋白修饰分析报告1. 引言蛋白修饰是生物体内一种重要的生物化学过程，通过改变蛋白质的结构或功能来调节细胞内的信号传导、代谢活性和基因表达。
蛋白修饰可以发生在蛋白质的氨基酸残基上，常见的修饰类型包括磷酸化、甲基化、乙酰化等。
本文将介绍蛋白质修饰的分析方法和步骤。
2. 磷酸化分析磷酸化是蛋白质修饰中常见的一种类型，通过酶催化将磷酸基团添加到蛋白质的氨基酸残基上。
磷酸化的分析可以采用质谱法进行。
以下是磷酸化分析的步骤：•样品制备：将待分析的蛋白质样品提取出来并纯化，以得到高纯度的样品。
•消化降解：使用特定的酶对蛋白质进行消化降解，以获得适合质谱分析的肽段。
•液相色谱分离：将消化后的样品通过液相色谱进行分离，以分离出不同的肽段。
•质谱分析：将分离出的肽段通过质谱仪进行分析，其中包括质量/电荷比（m/z）的测定和碎片谱的记录。
•数据分析：对质谱数据进行分析，通过数据库查询和标准库匹配来鉴定磷酸化位点。
3. 甲基化分析甲基化是蛋白质修饰中另一种常见类型，通过酶催化将甲基基团添加到蛋白质的氨基酸残基上。
甲基化的分析同样可以采用质谱法进行。
以下是甲基化分析的步骤：•样品制备：将待分析的蛋白质样品提取出来并纯化，以得到高纯度的样品。
•消化降解：使用特定的酶对蛋白质进行消化降解，以获得适合质谱分析的肽段。
•液相色谱分离：将消化后的样品通过液相色谱进行分离，以分离出不同的肽段。
•质谱分析：将分离出的肽段通过质谱仪进行分析，包括质量/电荷比（m/z）的测定和碎片谱的记录。
•数据分析：对质谱数据进行分析，通过数据库查询和标准库匹配来鉴定甲基化位点。
4. 乙酰化分析乙酰化是蛋白质修饰中的另一种常见类型，通过酶催化将乙酰基团添加到蛋白质的氨基酸残基上。
乙酰化的分析同样可以采用质谱法进行。
以下是乙酰化分析的步骤：•样品制备：将待分析的蛋白质样品提取出来并纯化，以得到高纯度的样品。
•消化降解：使用特定的酶对蛋白质进行消化降解，以获得适合质谱分析的肽段。
蛋白质的修饰和表达
蛋白质的修饰和表达蛋白质修饰的化学途径虽然基因重组表达技术的应用对蛋白质结构功能的研究以及蛋白质分子的改造提供了一条非常有效的途径，然而用化学方法直接对蛋白质分子进行修饰有时仍然是很有用的方法，可以弥补正常生物表达体系的不足。
例如，利用化学法和酶法相结合，可以从猪胰岛素制备人胰岛素；通过区段特异性取代制备适合于肿瘤定位的抗体；对用重组方法得到的多肽进行C末端酰化以及制备各种类型的蛋白质嵌合体等。
因此化学法和重组方法的相互补充，使蛋白质工程的实施更有效。
蛋白质工程的化学方法通常是产生半合成的结构，在此结构中造(或化学修饰)的多肽相缔合。
产生这种缔合的方法主要有4种键、形成肽键以及产生非天然型的共价键连接。
一、功能基团的特异性修饰个天然的多肽与一个人非共价缔合、产生二硫在20种天然氨基酸的侧链中，大约有一半可以在足够温和的条件下产生化学取代而不使肽键受损，其中氨基、琉基和羧基特别容易产生有用的取代。
因为任何给定的氨基酸残基在蛋白质分子中可能出现不止一次，如果用化学的方法对氨基酸进行修饰时，正常情况下所有相关的氨基酸侧链都要被取代。
至于谈到氨基和羧基基团，尽管处在侧链上和末端基团的pK值有差别，但在化学上很难将肽链的o—氨基或。
—羧基基团与侧链上的氨基或羧基相区别。
众所周知，很多在临床上重要的肽其(：末端是被酰化的。
但当用重组的方法得到这些产物时，其C末端是自由羧基。
在自然界能进行这种酰化作用的氧化酶体系很难实用化。
寻找一种有效的方法，其能使C末端的谷氨酸和门冬氨酸酰胺化，而不作用于处在肽链中的谷氨酸和门冬氨酸仍是努力的方向。
1．多位点取代(1)常规的氨基保护氨基可用取代基进行修饰。
常用的取代基有两种：…—butyloxy—carbonyl(Boc)是典型的酸不稳定取代基，而Methanesulphonylethyloxycarbonyl(Msc)是典型的碱不稳定取代基。
这两种基团常用于对氨基进行临时保护，以防止其他反应试剂对氨基的作用。
详细版蛋白质的化学修饰.ppt
.精品课件.
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将分离胶混匀后立即灌注于玻板间隙 中，上层小心覆盖一层正丁醇。将胶 板垂直放于室温下，待分离胶聚合完 全后，倾去正丁醇并用滤纸吸干。
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灌胶时要注意
催化剂不能加多了，加完催化剂要充分混匀， 且立即灌胶，
灌胶时要保持小烧杯摇动，防止烧杯内的胶 聚合。
灌胶动作要快，吸一满管的凝胶后，立即沿 胶板的一角灌入，而且要防止气泡的产生。
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几种测定蛋白质分子量的方法比较
方法
机理
分子量计算
关键技术
特点
电泳 分子表面电荷 电泳条带(mR)
SDS包裹
单链分子
层析 分子质量
层析峰的位置
介质交联度 球形分子
质谱 质荷比
质谱峰直接标识 样品质子化 整体分子
核磁 核磁共振波谱 核磁谱线计算
磁场能量
整体分子
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蛋白质的化学修饰
这种迁移率的不同，就蛋白质分子本身 而言，主要与其所带净电荷以及分子量和形 状有关。
.精品课件.
7
当电泳体系中含有一定浓度的十二烷基硫 酸钠（SDS）时，则得电泳迁移率的大小只
取决于蛋白质的分子量，从而可推测蛋白 质的分子量。
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8
SDS的作用原理
SDS是一种阴离子去污剂，能够与蛋白 质结合，破坏蛋白质分子之间以及与其它物 质分子之间的非共价键，使蛋白质变性而改 变原有的空间构象。
.精品课件.
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概念
从广义上说：凡通过化学基团的引入或除去， 而使蛋白质共价结构发生改变，都可以称为蛋白 质的化学修饰。
包括两个方面：（1）侧链基团的改变；(2） 主链结构的改变，前者属于化学修饰的范畴，而 后者则属于基因重组和定点突变的方法。
蛋白质的修饰和表达
Phage display method 2
Phage display method 2: contd.
核糖体展示技术和mRNA展示技术在体外无 细胞翻译体系中进行,用mRNA的可复制性, 使靶基因得到有效富集,不受细胞转化效率 的限制.大大提高了筛选通量.
二、基因融合和基因剪接
基本原则：将第一个蛋白基因的终止密码 子删除,再接上带有终止密码子的第二个蛋 白质或多肽基因,即可实现两个基因的融合 表达.
因为任何给定的氨基酸残基在蛋白质分子中可能出现不止 一次,如果用化学的方法对氨基酸进行修饰时,正常情况下 所有相关的氨基酸侧链都要被取代.至于谈到氨基和羧基基 团,尽管处在侧链上和末端基团的pK值有差别,但在化学上 很难将肽链的-氨基或-羧基基团与侧链上的氨基或羧基 相区别.
蛋白质侧链的化学修饰是通过选择性试剂 或亲和标记试剂与蛋白质分子侧链上特定 的功能基团发生化学反应而实现的.
另一类是Kcat型的不可逆抑制剂,是根据酶 催化过程设计的.这类抑制剂具有和底物类 似的结构,具有被酶催化和结合的性质.此外 还有一个潜伏反应基团,在酶对它进行催化 反应时,这个潜伏基团被酶催化而活化,对活 性部位起不可逆抑制作用.这类抑制剂的专 一性很高,被称为自杀性底物.
二光亲和标记
这类试剂在结构上除了有一般亲和试剂的 特点外,还具有一个光反应基团.
一亲和标记
亲和标记是一类位点专一性的化学修饰,试 剂可以专一性标记于酶的活性部位上,使酶 不可逆的失活,因此又称为专一性的不可逆 抑制作用.
这类抑制剂可分为两类：
一类是Ks型的不可逆抑制剂,它是根据底物 的结构设计的,它具有和底物结构相似的结 合集团,同时还具有和活性部位氨基酸残基 的侧链基团反应的活性基团.
蛋白质的化学修饰
泛素腺苷酸复合物被转移到E2结合酶上。
连接
E3连接酶将活化的泛素分子连接到蛋白质的赖氨酸残基上。
泛素化修饰在生物学中的作用
调控蛋白质的稳定性
01
通过标记需要降解的蛋白质，泛素化修饰可以调控蛋白质的稳
定性。
参与信号转导
02
泛素化修饰可以影响蛋白质的功能，从而参与信号转导过程。
参与细胞周期和DNA修复
磷酸酶
催化蛋白质去磷酸化反应 的酶，将蛋白质上的磷酸 基团去除。
甲基化修饰
将甲基基团添加到蛋白质 的特定氨基酸残基上，调 节蛋白质的活性和功能。
磷酸化修饰在生物学中的作用
信号转导
磷酸化修饰参与细胞内的信号转导过程，调节细 胞反应和功能。
细胞周期和增殖
磷酸化修饰与细胞周期调控和细胞增殖密切相关 ，影响细胞生长和分裂。
04
泛素化修饰的种类
单泛素化
一个泛素分子与蛋白质的特定赖 氨酸残基结合，形成单泛素化修
饰。
多泛素化
多个泛素分子与蛋白质的特定赖氨 酸残基结合，形成多泛素化修饰。
链式泛素化
一个泛素分子的羧基端与另一个泛 素分子的氨基端结合，形成链式泛 素化修饰。
泛素化修饰的酶学机制
活化
泛素分子首先被E1活化酶激活，生成泛素腺苷酸复合物。
重要性
蛋白质化学修饰是生物体内一种重要的调控机制，可以快速 响应生物环境变化，调节蛋白质的活性、定位和稳定性，从 而影响细胞代谢、信号转导、细胞生长和分化等生物学过程 。
蛋白质化学修饰的类型
01
磷酸化
磷酸化是指在蛋白质的丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基上添加磷酸基团，
通常由蛋白激酶催化。磷酸化可以改变蛋白质的电荷性质和构象，从而
蛋白质修饰及其生物学意义
蛋白质修饰及其生物学意义蛋白质是生物体内重要的基础性分子，它在结构和功能上均具有多样性。
除了基本的氨基酸序列之外，蛋白质分子还包含一些非常重要的化学修饰，这些修饰对蛋白质的生物学功能和稳定性起着关键性的作用。
蛋白质的化学修饰可以发生在不同的位置和程度上，包括磷酸化、糖基化、酰化等多种类型。
这些修饰可以改变蛋白质的空间构象、激活或抑制蛋白质的功能、改变其表观特性等，进而影响细胞的生理功能并调节生物体的代谢和生命活动。
磷酸化是蛋白质常见的修饰方式之一，其作用是通过向特定氨基酸残基中添加磷酸基团来调控蛋白质的生物学功能。
磷酸化修饰可被多种酶进行催化，它可以改变蛋白质的电荷状态，影响其与其他分子的相互作用。
磷酸化还可以调节蛋白质的酶活性、稳定性和溶解性等，并影响蛋白质的折叠和降解过程。
许多信号转导通路、细胞周期调控等生命活动的调控机制，都依赖于磷酸化的作用发挥。
另一种常见的修饰方式是糖基化。
这种修饰方式也是向蛋白质分子中添加糖基，通过糖的不同组合和连结方式来改变蛋白质的功能。
糖基化可以改变蛋白质的溶解度、抗原性、蛋白质-蛋白质或蛋白质-分子相互作用等，因此在生理和病理状态下都有着重要的作用。
如在肝病发生和发展中，蛋白质的糖基化产物会导致肝细胞肿瘤和癌变，成为了很重要的一个研究领域。
除了上述两种常见的修饰方式之外，蛋白质也可以进行其他类型的修饰。
例如，酰化修饰通过向蛋白质分子中添加酯基来增加蛋白质的亲脂性和改变其功能；氧化修饰是将氧化剂作用于蛋白质，使其蛋白质的二级结构和三级结构发生变化。
所有这些修饰方式都可以通过改变蛋白质的生物学功能来调节细胞的代谢和生命活动。
蛋白质修饰具有广泛的生物学意义。
由于修饰方式的多样化和复杂性，蛋白质的修饰是许多细胞过程和生理功能的关键调控方式。
例如，在免疫系统中，蛋白质的磷酸化和酯化修饰可以调节细胞凋亡和细胞增殖的平衡，从而影响免疫细胞的数量和功能。
在神经系统中，糖基化修饰可以影响神经元通讯信号的传递，并影响大脑的认知和行为。
第三章 蛋白质修饰表达
HO
P P
Tyr\His\Trp
R N HO N
P
2．戊二醛法
O R NH2 O
+
HC(CH 2)3CH
+ H2N
P P
RN CH(CH 2)3CH N
PP
反应条件：
• 4～40℃
• pH 6.0～8.0 酶标抗体的制备
3．过碘酸盐氧化法
• 辣根过氧化物酶（HRP）的标记
4．混合酸酐法
O RCOH O
Bare gold
GOxm fusion enzyme on Gold surface: AFM images
a
b
cda源自bcda
a b b c d
c
d
a
b
The immobilization of GOxm and GOxw on the silanized glass surface and the statistic analysis: a: GOxm; b: GOxw
-
+ H
+
412 nm
5, 5’-二硫-2-硝基苯甲酸（DTNB）
（二）氨基的化学修饰
三硝基苯磺酸（TNBS）能够与赖氨酸残基的 ε-氨基发生反应形成一种三硝基苯基化的氨基磺酸 复合物，该复合物呈黄色，在420 nm下有最大吸 收峰。
O 2N O 2N
P
NH2
+
pH ＞ 7
HO3S
O 2N NO 2
• 应用： a.了解胰岛素的结 构功能。
• 图为 某种胰岛素的 结构
• /z huyei/shengwu/index02.htm (蛋白质结构)
一、蛋白质侧链基团的化学修饰
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O
泛素
C O- + HS-E1
O 泛素 C S E1
ATP
AMP+PPi
O
泛素
HS-E1 泛素 HS-E2 O 泛素 O
C S E1
HS-E2
C S E2
泛素
被降解 O 蛋白质 C S E2
E3
C NH 被降解蛋白质
E1：泛素活化酶 E2：泛素携带蛋白 E3：N-去稳定残基识别蛋白
泛素化过程
细胞内成分的主要降解途径
1、蛋白酶体途径：降解细胞内短寿(short-lived)、多聚 泛素化(ubiquitination)的蛋白质。 原核生物：通过19S的蛋白酶体能识别靶蛋白的特定氨 基酸序列并将其降解。
真核生物：则是通过26S的蛋白酶体降解蛋白质。
2、内吞途径：将跨膜蛋白运送到溶酶体降解。 3、细胞自噬途径：而长寿蛋白(long-lived protein)、蛋白聚 集物及膜包被的细胞器是通过细胞自噬的方式在溶酶体降解。
Atg9/mAtg9
Atg9是迄今发现的唯一一个编码跨膜蛋白的 Atg基因, 能通过影响膜泡运输对自噬发生起调 控作用。营养物质缺乏 时, Atg9与Atg23、 Atg27结合, 将它们运 输至PAS;
自噬进程
1、自噬的诱导激活 2、自噬体的成核和延伸 3、自噬体与溶酶体融合 4、内容物降解
第一步：自噬的诱导
一系列自噬相关基因（autophagy-related gene， Atg）组成的复合体参与调控自噬体的形成。主要是 Atg1/ULK1 复合体，包括Atg1、Atg13、Atg17, mTORC1 磷酸化Atg1/ULK1和Atg13抑制自噬的起始。
Autophagy
Control
Starvation
Autophagy is a cellular degradation system in which cytoplasmic components, including organelles, long-life protein are sequestered by double-membrane structures called autophagosomes and the sequestered materials are degraded by lysosomal hydrolases
① 自噬的诱导 ②自噬体的成核 和延伸 ③ 自噬溶酶体 的形成 ④内容物的降解
自噬的调节
1、mTOR活性调节 2、胰岛素（激活mtor；抑制FoxO3）
自噬调控的中心分子TOR(target of rapamycin)
雷帕霉素作用的靶位点( T aget of rapamycin, TOR ) 是氨 基酸、A T P和激素的感受器, 它 在调节细胞生长和自噬的发生过 程有重要作用。 TOR(target of rapamycin) 能感受细胞的多种变化信号, 加强 或降低自噬的发生水平。细胞内 ATP水平、缺氧等细胞信号都可 直接或间接通过TOR将其整合, 从而改变细胞的自噬发生, 应对不 同的外界环境刺激。
Transfection
Mol Cancer Res. 2008 Jan;6(1):127-38.
稳定残基:半胱、丙、丝、苏、甘、 缬、蛋 肽链内部的保守序列：PEST使蛋白质 分子短命----UPS 识别信号 去泛素化酶（deubiquitinating enzyme，DUB）
•体内蛋白质降解参与多种生理、病理 调节作用
AMPK(AMP-activated protein kinase)
AMPK是细胞中感受能量状态调节代谢的一个蛋白激酶, 在自噬 发生的调控中也发挥着重要的作用。低ATP水平状态下(如饥饿或 缺氧)AMPK能感受AMP的水平变化而激活, 从而磷酸化结节性硬化 复合体TSC2(tuberous sclerosis protein) 加强TSC1/2对Rheb的 抑制, 最终使mTOR的活性被抑制, 诱导细胞发生自噬。
Atg7 -Atg3-
第三步：自噬体与溶酶体的融合，被运送到溶酶体，两者的 生物膜融合，变成一个自噬溶酶体(atuolysosome)。 形态特点：多呈圆形或椭圆形。由于自噬体内膜很快被降解， 在透射电镜下自噬溶酶体常不易与其他形式的溶酶体区别。
第四步：自噬溶酶体内的酸性水解酶降解囊泡中的内容物， 成为降解性自噬体(degradative autophagic vacuole)。
自噬体的半衰期 8 min左右，是细胞对于环 境变化的有效反应。
细胞自噬的分类
——根据细胞物质运到溶酶体内的途径不同 1、巨型细胞自噬 (macroautophagy)，又称为大自噬， 是指细胞内新生的球状脂质双层包裹胞浆蛋白和细胞 器，并运送到溶酶体降解的自噬行为。
2、微型细胞自噬 (microautophagy)，又称为小自噬， 是指通过溶酶体膜的内陷、突起和/或分隔，直接吞 入细胞浆的自噬行为。 3、分子伴侣介导的细胞自噬(chaperone mediated autophagy，CMA)，是指由分子伴侣将靶蛋白转送至溶 酶体内的自噬行为。这只见于哺乳类动物细胞。
Atg1/ULK1蛋白激酶复合体
Atg1是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶, 哺乳动物中同源蛋白ULK1, ULK1以复合 物的形式存在, 除了ULK1本身, 还包括 mAtg13、FIP200(一种与黏着斑激酶FAK 相互作用的蛋白)和Atg101。 当营养足够时 , 哺乳动物雷帕霉 素靶蛋白复合物 1( mTORC1)与 Atg1/ULK1 复合物与结合 ,通过磷酸 化Atg1/ULK1 和ATG13 从而抑制自 噬 的 起 始 从 而 抑 制 自 噬 。 在饥饿的条件下, mTORC1 从 Atg1/ULK1 复合物上分离, 从而诱导 自噬体的成核(Nucleation)和延伸 (Elongation)。
基础自噬和诱导自噬
基础自噬：是一种在大多数细胞中持续发生而水平相 对较低的细胞自噬过程, 对细胞内物质的更新及细胞内 环境稳态的维持具有不可或缺的作用。
诱导自噬：是细胞应对外界刺激的一种保护反应。缺 少营养物质或能量、受到氧胁迫等情况下, 细胞的自噬 水平在短时间内剧烈升高的细胞自噬过程。
如哺乳动物出生后初期, 由于母体不再提供营养来源, 幼体的细 胞自噬非常活跃, 这为维持其生命活动起了非常重要的作用。
mTORC1失活
ULK1 去磷酸化
自噬激活
induction
Atg7 -Atg3-
第二步：自噬体的成核，细胞在接受自噬诱导信号后，在胞 浆中形成一个小的膜样结构:分离膜(isolation membrane， IM)，然后不断向两边延伸，成扁平状，被称为前自噬体(preautophagosome PAS) ，是自噬发生的标志之一。需要Atg6 （Beclin1）-ClassⅢ PI3K 复合体以及Atg12-Atg5-Atg16L 复合体. 形态特点：自噬前体多呈新月形或半环形，为游离双层膜结 构，两层膜之间有腔。随着自噬前体增大和包裹内容物，内 腔变得不明显。多种ATG 蛋白参与自噬前体的组装。 组分来源：来源于独立形成的特殊膜结构或线粒体、内质 网或高尔基复合体等膜结构。
第二章
蛋白质的修饰与降解
第一节 蛋白质的修饰 蛋白质的翻译后修饰指对蛋白质进行 共价加工的过程，可调节蛋白质的活性、 定位、折叠、以及蛋白蛋白相互作用。
磷酸化 脂基化 甲基化 乙酰化 糖基化 SUMO化 巴豆酰化
一、磷酸化
磷酸化 去磷酸化 催化磷酸化的蛋白激酶
蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶 PKA PKC PKG 蛋白质酪氨酸激酶 PTK 非受体型Src 受体型EGFR IGFR PDGFR 双专一性蛋白激酶 DSPK Weel ERK1 EKR2
细胞信号转导过程中存在多种蛋白翻译 后修饰 一种蛋白质可以有一种以上的翻译后修 饰
八、研究策略
放射性跟踪 修饰性抗体技术 质谱技术
第二节
蛋白质的降解
细胞内的蛋白质分子处于一动态平衡过程中。 进行自我更新。 蛋白质降解途径： 泛素-蛋白酶体系统（ubiquitin-proteasome system,UPS） 自噬溶酶体（autophagy-lysosome）系统 蛋白质分子降解的生理功能： 1、清理不正常蛋白质的管家功能 2、破坏正常蛋白质的调节功能
乙酰基 乙酰基转移酶 主要Lys 组蛋白的乙酰化调控基因转录 调控自噬 调节代谢酶的活性
五、类泛素化--SUMO化(small ubiquitin related modifier)
小泛素相关修饰物，分子结构类似泛素
蛋白质SUMO化
E1活化酶、E2结合酶、E3连接酶 SUMO的C-端Gly残基和底物蛋白Lys的氨基间形成一个异肽键 SUMO的C-末端短肽切除，暴露出GlyGly模特序列，使其变成成熟的功能蛋 白 去SUMO化 Ulp
带有成串泛素分子的底物蛋白再被26S 蛋白酶复合体识别 蛋白酶复合体分子量极其巨大 在蛋白酶复合体腔中，蛋白质被水解
Example
The oncoprotein SS18-SSX1 promotes p53 ubiquitination and degradation by enhancing HDM2 stability.
如周期蛋白，基因表达、细胞增殖、 炎症反应、诱发癌瘤（促进抑癌蛋白P53 降解）
蛋白浓度的周期性降低正是泛素介导的蛋 白酶复合体作用的结果。
二、自噬溶酶体系统
什么是自噬？
自噬（autophagy）是真核生物进化过程 中高度保守一类降解途径，通过形成双层膜 的自噬体，将蛋白质等生物大分子或细胞器 （线粒体等）回收至溶酶体将其降解为氨基 酸、单糖等小分子，实现循环再利用。 自噬性细胞死亡, 是凋亡和坏死之外的第 三种程序性细胞死亡方式.