色褐链霉菌磷脂酶D基因pld的克隆与表达
17_磷脂酶D的细胞信号转导作用
451
综 述 Review
磷脂酶D的细胞信号转导作用
钟秀丽 1，崔德才 2*，李玉中 1
( 1 中国农业科学院农业环境与可持续发展研究所，北京 1 0 0 0 8 1 ；2 山东农业大学生命科学学院，泰安 2 7 1 0 1 8 )
2 PLD 作用的直接产物 PA 及其下游事件
2.1 PA 的代谢与转化 不同 PLD 特异性地水解各种磷脂，直接产生
PA。PA 本身就是信使物质，能够激活靶物使它 将信号向下游传导。同时 PA 还可以进一步代谢生 成其它信使物质(图 2)。如在磷脂磷酸酶的作用下 脱磷酸化形成二酯酰甘油(DAG)，还可以在 PA 激 酶的作用下磷酸化形成焦磷酸DAG(DGPP)(Munnik 等 2000)，也可以在 PLAs 的作用下去酰基形成 FFA 和溶血磷脂酸(LysoPA)(Meijer 等 2001)。同样， DAG 也可以在 DAG 激酶的作用下磷酸化形成 PA (van der Luit 等 2000; den Hartog 等 2001; Munnik 等
亚油酸和亚麻酸的激活程度差一些，而饱和脂肪 酸如硬脂酸和棕榈酸则没有激活作用(Katagiri 等 2001)。另一方面，实验中还发现溶血磷脂酰乙醇 胺(LysoPE)(Ryu 等 1997)和 N- 酰基乙醇胺(NAE) (Austin-Brown 和 Chapman 2002)是 PLDα 的负调节 因子。
值得注意的是，这些 PLD 的调节因子(Ca2+、 PIP2、游离脂肪酸、溶血磷脂等)大多还是 PLA2 和 PLC 的底物、产物或下游靶物。PLC 的功能之 一是产生三磷酸肌醇(IP3)，它能引起细胞质中的 Ca2+ 水平的增加(Staxen 等 1999)。PIP2 是一种含量 很低的植物脂类，是 PLC 的底物。游离脂肪酸和 溶血磷脂则是 PLA2 的产物。PLDα 的负调节因子 NAE 则是 PLDβ 或 PLDγ 水解 N- 酰基磷脂酰乙醇胺 (NAPE)的产物。另一方面，PLC 的底物 PIP2 的合 成也受 PLD 的影响，在动物体系中发现，PLD 催 化反应的产物磷脂酸(phosphatidic acid, PA)能够激 活 PI-5 激酶(Jenkins 等 1994)，它是 PIP2 合成的关 键酶。因此有学者提出动物细胞 PLD 和 PIP-5 激 酶的激活形成一个正反馈作用环，使 PA 和 PIP2 迅 速产生，这种作用进而增强 PLC 的活性与功能。 在植物中，PA能够与植物 PI-4激酶结合(Stevenson 等 1998)，但是 PLD 在植物的多磷酸肌醇形成中的 作用目前还不清楚。另外，PLD 的产物 PA 能够
磷脂酶D 信号转导与植物耐盐研究进度
磷脂酶D 信号转导与植物耐盐研究进度本文从网络收集而来，上传到平台为了帮到更多的人，如果您需要使用本文档，请点击下载按钮下载本文档（有偿下载），另外祝您生活愉快，工作顺利，万事如意！植物细胞膜较早感受、传导外界各种胁迫信号。
磷脂是细胞膜的骨架成分，其水解产物参与生理生化、细胞信号转导以及环境刺激引起的细胞应答等多个过程。
磷脂酶是代谢磷脂的关键酶，根据其水解位点不同分磷脂酶A1(Phospholipase A1，PLA1)、磷脂酶A2(Phospholipase A2，PLA2)、磷脂酶C(Phospholipase C，PLC)和磷脂酶D(PhospholipaseD，PLD)。
PLD 是植物中最早被发现和克隆的磷脂酶基因，广泛分布于根、茎、叶、花、果实和种子等各个组织。
根据基因序列和结构域的不同，拟南芥12 个PLD 基因分为6 类：PLDα(1-3)，PLDβ(1，2)，PLDγ(1-3)，PLDδ，PLDε 和PLDζ(1，2)。
除了PLDζ，植物PLD 基因都包括N 端的C2 结构域，属于结合磷脂的折叠域，与Ca2+ 的结合有关，是植物PLD 特有的结构;两个重复的HKD 区域是所有真核PLD 基因共有的结构域，对PLD 活性非常重要。
PLDζ 除了含有HKDs 结构域，还有两个N 端特殊结构域PX(Phox homology)和PH(Pleckstrinhomology)，PX 富含脯氨酸残基，可以与磷酸肌醇结合，而PH 可以与磷脂酰肌醇结合。
PLD 基因除了结构上的共性以外，还有一些特殊性，如PLDβ1 拥有一个PIP2 结合区，可以被PIP2 和Ca2+ 协同激活;PLDα1 在两个HKDs 结构域中间包含DRY 基序，此结构域可以和异三聚体G 蛋白亚基α(Gα)结合，从而增强Gα 的GTP 酶活性，共同调节气孔运动与水分散失。
在第一个HKD 结构域后，PLDδ 包含一个油酸结合区域。
磷脂酶D的重组表达及其在磷脂酰丝氨酸合成中的应用
磷脂酶D的重组表达及其在磷脂酰丝氨酸合成中的应用磷脂酶D（EC 3.1.4.4）可以磷脂酰胆碱为底物转化合成磷脂化合物,在医药和食品领域具有良好的应用价值。
磷脂酶D产生菌的传统获取方式为土壤筛选,但是野生菌来源的磷脂酶D因酶活水平偏低,发酵周期长而限制了其广泛应用。
随着分子生物学和基因工程技术的快速发展,通过分子改造策略获得高表达量和高酶活的磷脂酶D迫在眉睫。
本研究首先考察了磷脂酶D在不同宿主体系中的表达,筛选获得最优表达宿主,进而开展一系列基因工程改造以期提升磷脂酶D的表达水平并对磷脂酶D制备磷脂酰丝氨酸的工艺进行探究。
本论文的主要研究内容如下:（1）以实验室前期获得的具有良好磷脂酰基转化能力的磷脂酶D sspld序列为目的基因,分别构建了重组菌株Bacillus subtilis/pMA5-pld,Pichia pastoris/pPIC3.5K-pld和Corynebacterium glutamicum/pDXW-pld,实现了磷脂酶D在枯草芽孢杆菌,毕赤酵母和谷氨酸棒杆菌中的异源表达,重组菌酶活分别为8.4 U/mL,13.2 U/mL和15.0 U/mL。
为此将谷氨酸棒杆菌作为后续改造的表达宿主。
（2）为降低下游纯化成本和缓解胞内酶蛋白积累对宿主菌生长的影响,本研究利用信号肽在谷氨酸棒杆菌体系中构建了6种分泌型重组表达菌株,成功实现了磷脂酶D的分泌表达。
其中,在WapA信号肽的作用下,磷脂酶D胞外酶活最高,为54.6 U/mL。
核糖体结合位点决定蛋白质合成的速度,通过文献调研和位点分析发现,在信号肽编码基因前添加一段15 bp的核糖体结合位点序列AGAAGGAGATATACC,可将重组酶的酶活进一步提高至63.6 U/mL。
启动子可通过与转录因子结合而控制基因活动,为继续提升该重组磷脂酶D的表达水平和应用潜力,本研究进行了启动子适配性改造,将原质粒上的启动子分别替换为其他12种启动子,其中p WapA 启动子适配性改造重组菌的酶活水平最高,达到78.0 U/mL。
反复分批式反应提高磷脂酰丝氨酸的生产能力
CHEMICAL INDUSTRY AND ENGINEERING PROGRESS 2016年第35卷第4期·1180·化工进展反复分批式反应提高磷脂酰丝氨酸的生产能力封娟娟1，朱南南1，邓杨敏1，韩晓玲2，张小里1，赵彬侠1（1西北大学化工学院，陕西西安 710069；2西安力邦制药有限公司，陕西西安 710075）摘要：磷脂酶D（PLD）催化大豆磷脂合成磷脂酰丝氨酸（PS）反应是在油-水两相体系中进行的，大豆磷脂（PC）溶于有机相中，L-丝氨酸溶于水相中，但反应过程中产生副产物——胆碱，抑制酶的催化反应速率，需及时移除胆碱。
本文主要采用反复分批式反应来解决这一问题。
并考察了增大底物PC的浓度，PS的收率大大降低。
低底物PC浓度下，添加不同浓度胆碱，转酯速率及PS收率都降低；高底物PC浓度下，采用反复分批式反应去除胆碱，转酯反应速率提高38%，PS收率达67%。
研究表明反复分批式操作是一种生产磷脂的新型工艺，其中PS的生产能力明显提高，而且重复10次反应后，固定化酶活力仍保持58%，纳米SiO2固定化磷脂酶D较好地适用于反复分批式反应。
关键词：磷脂酰丝氨酸；固定化磷脂酶D ；反复分批式反应；胆碱中图分类号：TQ 463 文献标志码：A 文章编号：1000–6613（2016）04–1180–04DOI：10.16085/j.issn.1000-6613.2016.04.034Increasing productivity of phosphatidyserine by repeated batch reaction FENG Juanjuan1，ZHU Nannan1，DENG Yangmin1，HAN Xiaoling2，ZHANG Xiaoli1，ZHAO Binxia1（1College of Chemical Engineering，Northwest University，Xi’an 710069，Shaanxi，China; 2Xi’an LIBANGPharmaceutical Company Limited，Xi’an 710075，Shaanxi，China）Abstract：The synthetic reaction of phosphatidyserine from soybean lecithin catalyzed by immobilized phospholipase D was carried out in oil-water two phase system，with PC and L-serine rich in oil and water phase，respectively. However，the by-product choline restrains the enzyme-catalyzed reaction rate and should be removed in time. In order to solve this problem，we adopted the repeated batch reaction.Increasing the substrate (PC) concentration decreased the yield of PS greatly. When various concentrations of choline chloride were added into the reaction mixture at low PC concentrations，there was a significant decrease in transphosphatidylation rate and the yield of PS. The using of repeated batch reaction was examined at high PC concentration to remove choline，the transphosphatidylation rate increased by 38%，and PS yield was 67%. The paper reported that the repeated batch operation is a novel technology for the synthesis of phosphlipid and increased the productivity of PS significantly.And the immobilized enzyme activity remained 58% after ten batches and nano-SiO2-immobilized-PLD was suitable for repeated batch reaction.Key words：phosphatidyserine; immobilized phospholipase D; repeated batch reaction; choline磷脂酰丝氨酸（phosphatidyiserine，简称PS)是一种稀有磷脂，虽然在人体内数量极其稀少但功能显著，具有提高大脑机能、集中注意力、改善记忆力、缓解压力、促进用脑疲劳的恢复、平衡情绪、修复大脑损伤等功效[1]。
磷脂酰丝氨酸制备的研究进展
磷脂酰丝氨酸制备的研究进展孙明波;刘天薇;王继文;张怡轩【摘要】Phosphatidyleerine (PS) possesses the effects to improve human memory and cognition ability, to prevent and to treat the senile dementia, depression, and to alleviate spiritual pressure. It is widely applied abroad in nutra-ceutical as a kind of nutritious additive. Preparation methods of PS stressed on two aspects as extraction and enzymatic synthesis methods were summarized in this paper, prospects were also made through investigation of current situation of PS consumption both home and abroad and its application in food, medicine, and nutiaceutical.%磷脂酰丝氨酸具有改善记忆和认知能力、防治老年痴呆症、抑郁症及缓解精神头力等作用,目前在国外被用作营养补克剂广泛应用于保健食品中.着重从提取法和酶转化法2个方面综述了磷脂酰丝氨酸的制备方法,同时通过对国内外磷脂酰丝氨酸消费现状的调查,对其在食品、药品、保健品方面的应用前景进行了展望.【期刊名称】《微生物学杂志》【年(卷),期】2012(032)003【总页数】6页(P80-85)【关键词】磷脂酰丝氨酸;制备;提取;磷脂酰丝氨酸合成酶【作者】孙明波;刘天薇;王继文;张怡轩【作者单位】沈阳药科大学生物制药教研室,辽宁沈阳110016;沈阳药科大学生物制药教研室,辽宁沈阳110016;沈阳天峰生物制药有限公司,辽宁沈阳110003;沈阳药科大学生物制药教研室,辽宁沈阳110016【正文语种】中文【中图分类】Q939.97磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine，PS)又称丝氨酸磷脂或二酰甘油酰磷酸丝氨酸，是一种天然磷脂，1942年由Jordi［1］首次提取并命名。
实时定量 PCR 鉴定转基因作物纯合体
实时定量 PCR 鉴定转基因作物纯合体张丽;刘丽丽;梁晓声;王海英【摘要】Rice endogenous reference gene phospholipase D gene ( PLD) and genetically modified ( GM) rice TT51-1 event-specific flanking sequence were used as PCR detection targets.And the homozygosis of GM rice TT51-1 plants originated from single plant seeds were analyzed through real-time PCR assays, which analyzed the Ct value of the endogenous reference gene and the flanking sequences.The reliability of this method was verified by calculation of GM copy number ratio based on the standard curves.It was concluded that the method was simple and accurate to identify the homozygosis of GM crops.%以水稻内标准基因磷脂酶D基因（ phospholipase D， PLD）和转基因水稻TT51－1特异性旁侧序列为检测靶标，对单株转基因水稻的种子播种后长出的单株进行了荧光定量PCR，以其内标准基因和旁侧序列Ct值的差值判断了植株的纯合体，并用标准曲线计算了转基因含量，证实了此法的可靠性，说明此法用于鉴定植株的纯合体简便准确。
【期刊名称】《中南民族大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2015(000)001【总页数】4页(P43-46)【关键词】转基因作物;纯合体;内标准基因;旁侧序列;实时荧光定量PCR【作者】张丽;刘丽丽;梁晓声;王海英【作者单位】中南民族大学生命科学学院武陵山区特色资源植物种质保护与利用湖北省重点实验室，武汉430074;中南民族大学生命科学学院武陵山区特色资源植物种质保护与利用湖北省重点实验室，武汉430074;中南民族大学生命科学学院武陵山区特色资源植物种质保护与利用湖北省重点实验室，武汉430074;中南民族大学生命科学学院武陵山区特色资源植物种质保护与利用湖北省重点实验室，武汉430074【正文语种】中文【中图分类】Q788纯合的转基因植株不仅可用于育种研究，还可用于制备转基因检测的标准物质[1].在研制转基因作物标准物质时，需要大量的候选物，并对其纯合度进行鉴定，候选物的纯合度直接影响了标准物质的量值[2]，故建立一种简单、有效的纯度鉴定方法具有重要意义.目前主要用定性PCR和荧光定量PCR对转基因作物的纯合体进行鉴定.定性PCR 法是利用4个引物的多重PCR 反应，根据PCR扩增条带数和条带的大小来鉴定转基因植株的纯合体，它要求在遗传转化过程中未发生重组，并且需要有详细的外源基因插入位点信息[3].荧光定量PCR是将盲样的Ct值代入所绘制的标准曲线，计算外源基因和内标准基因的拷贝数，转基因含量GM(%)=外源基因拷贝数/内标准基因拷贝数×100%.转基因含量约100%为纯合，约50%的为杂合，约0%的为非转基因.以上方法中，定量PCR法要求其标准曲线的绘制较为繁琐，且一般标准样品与分析样品在同一PCR板上，也限制了每次分析的样品量[4].本文以转基因水稻为研究对象，以单株转基因水稻的种子为起始材料，将种子播种后长出的单株为转基因标准物质研制的候选物，并对其纯合度进行研究和鉴定，建立了一种快速的转基因纯合度分析方法.1.1 仪器和材料Bio-Rad CFX96 Real-time PCR Detection System (Hercules, USA)，转基因水稻TT51-1种子和纯阳性转基因水稻TT51-1 DNA标准品由华中农业大学提供，DNA小量提取试剂盒DNA easy Plant Mini Kit(QIANGEN公司)，荧光定量PCR试剂盒TaqMan® Universal PCR Master Mix(ABI公司)，PCR引物和探针(上海生工生物工程技术服务有限公司)，Taqman探针5’荧光基团用FAM标记，3’荧光淬灭基团用TAMRA标记，引物探针序列如表1所示[5].1.2 转基因水稻TT51-1植株的繁殖将来自同一穗的转基因水稻种子于约37℃下水泡萌发，转移到温室中种植，待其长出一定叶片后，收取部分子叶用于基因组DNA提取和PCR扩增鉴定.1.3 基因组DNA 的提取参考操作说明书提取植物基因组DNA.采用Picogreen法测定DNA浓度，用紫外分光光度法测定OD260/280检测质量和纯度.1.4 荧光定量PCR反应体系和反应条件荧光定量PCR反应荧光信号通过CFX manager software program进行信号收集和分析.水稻内标准基因PLD和TT51-1转化体事件特异性旁侧序列的反应体系为：1×Taq Man Universal PCR Master Mix，400 nM正向引物，400 nM反向引物，200 nM探针，1.5 μL模板DNA，加ddH2O至20 μL.反应条件为：50℃ UNG酶处理2 min，94℃预变性10 min，再94℃ 15 s，60℃ 1 min，45个循环.2.1 样品的定量PCR扩增和纯合体鉴定本文随机选取16个单株，对这16个单株提取基因组DNA后进行荧光定量PCR，水稻内标准基因PLD和TT51-1转化体事件特异性旁侧序列的Ct值结果如表2所示. 由于每个模板的Ct值与其拷贝数的对数成线性关系，起始模板拷贝数越多，Ct值越小，则外源基因与内标准基因的Ct值之差越小.根据遗传学定律，经过繁殖后的单株中只存在非转基因、转基因杂合、转基因纯合3种情况.通过分析表2中的外源基因和内标准基因的Ct差值，可将16棵植株分为3类(图1)：第一类外源基因和内标准基因的Ct值之差较大，这是由于该基因组DNA中无外源基因扩增，Ct值显示无扩增或超过38个循环的非特异扩增，10、12、16号植株为非转基因水稻；第二类和第三类的转基因水稻的外源基因和内标准基因的Ct值之差分别约为1.8和0.8，第二类的转基因水稻的起始模板拷贝数较第三类少，故第二类转基因水稻为杂合，6、8、13、15号植株为杂合转基因水稻；1、2、3、4、5、7、9、11、14号植株为纯合转基因水稻.此外，纯合转基因植物与杂合转基因植物相比，在荧光定量PCR反应中也表现出两者△Ct值约为1，与理论上两者转基因含量为2倍之差相符.2.2 标准曲线的绘制在转基因含量的分析研究中，常采用标准曲线法，将含量为100%的转基因水稻TT51-1基因组DNA 5 倍梯度稀释至100000，20000，4000，800，160，32 copies/μL，以稀释后的6个浓度梯度DNA为模板进行荧光定量PCR，绘制内标准基因和旁侧序列的标准曲线，反应设置4个平行.反应所得Ct值如表3所示，扩增曲线如图2所示.内标准基因标准曲线的斜率为-3.5087，线性决定系数为0.992. 旁侧序列标准曲线的斜率为-3.4417，线性决定系数为0.998. 根据欧盟转基因网络实验室(European Network of GMO Laboratories，ENGL)对转基因检测方法中的要求，标准曲线的斜率应在-3.1～-3.6之间，代表PCR扩增效率在90%到110%之间，线性决定系数应大于0.98，说明实验结果可靠、有效[6].本次试验绘制的标准曲线均满足相关要求，可用于转基因含量的定量分析.2.3 样品转基因含量分析在标准曲线绘制的同时，对表2中的16个单株抽取6份单株(分别为11～16号样品)进行荧光定量PCR分析，并采用拷贝数百分比的方式计算转基因含量，结果见表4.通过表4中外源基因与内标准基因的拷贝数的比值大致可将6棵植株分为3类：第一类拷贝数之比为0，说明这类水稻植株的基因组中未插入外源基因，第12、16号植株为非转基因水稻；第二类拷贝数之比接近0.5，说明这类水稻的二倍体基因组中只有一条DNA双链中插入了外源基因，而处于等位基因上的另外一条DNA双链中未插入外源基因，即杂合体，故第13、15号植株为杂合转基因水稻；第三类拷贝数之比接近1.0，说明这类水稻的等位基因上一对双链DNA中均插入了外源基因，即等位基因上双链DNA的旁侧序列相同，故第11、14号植株为纯合转基因水稻.此法判断结果与通过Ct值差值法的纯合体鉴定结果一致，证明可以用Ct值差值法取代传统的转基因拷贝数百分比法来分析转基因纯合度.在转基因检测标准物质的研制过程中，标准物质候选物是指可用于制备标准物质的材料，如转基因植物和对应的非转基因植物的籽粒、叶片等.在标准物质的研制过程中，需要大量的标准物质候选物.欧盟联合研究中心下属的标准物质与测量研究所(Institute for Reference Materials and Measurements，IRMM)在研制转基因玉米98140基体标准物质(编号BF427)时，以非转基因玉米种子和转基因玉米种子为起始材料[7].美国的油脂化学家学会(American Oil Chemists’Society，AOCS)在生产转基因玉米T25基因组DNA标准物质(编号AOCS 0306-C)时，以2 mg非转基因玉米和转基因玉米T25的叶片DNA为起始材料[8].这些起始材料在生产的过程中均需要对纯合度进行鉴定[9].常规的纯合度鉴定是采用荧光定量PCR分析作物内标准基因和旁侧序列的拷贝数来计算转基因含量.由于计算含量时需要绘制标准曲线，一次分析的样品量有限，大大限制了标准物质候选物的纯合度分析效率.本文以标准物质候选物的繁殖为基础，以来自单株转基因材料的种子为起始材料，根据遗传分离定律，生长出来的植株只有非转基因、转基因杂合、转基因纯合3种情况.作物内标准基因的拷贝数恒定不变，外源基因的拷贝数可根据植株转基因纯合状态分为3组[3].在荧光定量PCR分析中，用外源基因的Ct值减去内标准基因的Ct值，将样品DNA浓度均一化.外源基因和内标准基因Ct值差值较大，说明外源基因拷贝数较少.故根据植株的3种情况，将△Ct值分为3组：若外源基因无扩增或Ct值超过38则为非转基因；△Ct值较小的即为转基因纯合，△Ct值较大即为转基因杂合，且转基因杂合与转基因纯合△Ct值差值约为1.本方法快速、简便、准确、可靠，大大提高了转基因标准物质候选物的分析效率，为转基因作物纯合度研究提供了理论和技术基础.[1] Trapmann S,Schimmel H,Kramer G N,et al.Production of certified reference materials for the detection of genetically modified organisms[J].J AOAC,2002,85 (3): 775-779.[2] Broothaerts W,Contreras M,Corbisier P,et al.Certification of reference materials of soya seed powder with different mass fractions of genetically modified 305423 soya,ERM®-BF426[R].Luxembourg: Office for Official Publications of the European Communities,2007.[3] 刘楠,陈化榜.转基因玉米目标基因纯合体快速准确的PCR鉴定方法[J].分子植物育种,2009,7(3): 619-623.[4] Burns M,Valdivia H.A procedural approach for the identification of sources of uncertainty associated with GM quantification and real-time quantitative PCR measurements[J].Eur Food Res Technol,2007,226 (1): 7-18.[5] Wu G,Wu Y,Nie S,et al.Real-time PCR method for detection of the transgenic rice event TT51-1[J].Food Chem,2010,119 (1): 417-422.[6] ENGL.Verification of analytical methods for GMO testing when implementing inter-laboratory validated methods[R].Luxembourg: Publications Office of the European Union,2011.[7] Gancberg D,Corbisier P,Andrade Silva E de,et al.Certification of reference materials of maize seed powder with different mass fractions of genetically modified 98140 maize,ERM®-BF427[R].Luxembourg: Office for Official Publications of the European Communities,2009.[8] AOCS.The certification of conventional and liberty LinkTM (T25) corn leaf DNA reference materials[R].South Dakota: Brookings,2006.[9] 张丽,吴刚,武玉花,等.转基因产品检测标准物质的定值和不确定度研究进展[J].农业生物技术学报,2014,22 (3): 362-371.。
一种在链霉菌中高效表达磷脂酶D的方法及重组链霉菌[发明专利]
![一种在链霉菌中高效表达磷脂酶D的方法及重组链霉菌[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/628a5e33a7c30c22590102020740be1e650ecc9b.png)
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202011640261.1(22)申请日 2020.12.31(71)申请人 河南省商业科学研究所有限责任公司地址 450000 河南省郑州市金水区文化路87号申请人 河南省科学院(72)发明人 朱海华 王鋆坦 王小瑞 平洋 谭静 张亚勋 周莉 王慧 (74)专利代理机构 成都弘毅天承知识产权代理有限公司 51230代理人 李颖(51)Int.Cl.C12N 15/76(2006.01)C12N 1/21(2006.01)C12N 9/16(2006.01)C12R 1/465(2006.01)C12R 1/48(2006.01) (54)发明名称一种在链霉菌中高效表达磷脂酶D的方法及重组链霉菌(57)摘要本发明属于基因工程领域，涉及一种在链霉菌中高效表达磷脂酶D的方法，步骤一，选择磷脂酶D的异源高效表达宿主，步骤二，筛选磷脂酶D合成基因的最佳来源，步骤三，获取链霉菌来源的磷脂酶D基因片段，步骤四，连接目的基因形成磷脂酶D重组质粒，步骤五，重组质粒接合转移至宿主菌，步骤六，重组菌株的发酵培养及磷脂酶D酶活检测，进而得到高效表达磷脂酶D的重组链霉菌。
选用链霉菌来源的磷脂酶D进行重组蛋白异源表达，具有天然优势，对磷脂酶D合成基因进行了密码子优化，选取变铅青链霉菌SBT5作为异源表达宿主，优异的异源表达效果加上良好的胞外活性分泌表达效果，使得该重组菌株具有极高的创新性和实用性。
权利要求书1页 说明书6页序列表3页CN 112575023 A 2021.03.30C N 112575023A1.一种在链霉菌中高效表达磷脂酶D的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一，选择磷脂酶D的异源高效表达宿主，选用链霉菌作为宿主，同时选用链霉菌来源的磷脂酶D基因作为目的基因作为基因工程的改造对象；步骤二，筛选磷脂酶D合成基因的最佳来源，通过酶活测定进行对比实验，选用S.antibioticus抗菌素链霉菌和S.chromofuscus色褐链霉菌作为获得目的基因的目标菌株；步骤三，获取链霉菌来源的磷脂酶D基因片段，通过PCR扩增技术得到抗菌素链霉菌来源的磷脂酶D基因和色褐链霉菌来源的磷脂酶D基因；步骤四，连接目的基因形成磷脂酶D重组质粒，将抗菌素链霉菌来源的磷脂酶D基因分别连接链霉菌常用表达载体和链霉菌高效表达载体，形成第一重组质粒和第三重组质粒，再将色褐链霉菌来源的磷脂酶D基因分别连接链霉菌常用表达载体和链霉菌高效表达载体，形成第二重组质粒和第四重组质粒；步骤五，重组质粒接合转移至宿主菌，通过接合转移手段，进而得到与第一重组质粒、第二重组质粒、第三重组质粒、第四重组质粒依次对应的第一重组菌株、第二重组菌株、第三重组菌株、第四重组菌株；步骤六，重组菌株的发酵培养及磷脂酶D酶活检测，通过对原始菌株和重组菌株的酶活检测，进而找到表达效果最好的菌株，其中原始菌株为S.lividans变铅青链霉菌、S.antibioticus抗菌素链霉菌以及S.chromofuscus色褐链霉菌；而重组菌株为步骤五所得的第一重组菌株、第二重组菌株、第三重组菌株、第四重组菌株。
褐藻胶裂解酶的基因克隆及表达条件优化
Ｇｕ ｌ ｆ Ｍａ ｒ ｉ ｎ ｅ Ｒ ｅ ｓ ｅ ａ ｒ ｃ ｈ Ｃ ｅ ｎ ｔ ｒ ｅ ， Ｎ ａ ｎ ｎ ｎｇ５ ｉ ３ ０ ０ ０ ７ ， Ｃ ｈ ｎａ ｉ ； ． Ｇｕ ａ ｎ ｇ ｘ ｉ Ｖ ｏ ｃ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ａ ｌ ｎｄ ａ Ｔ ｅ ｃ ｈ ｎ ｉ ｃ ａ ｌ Ｃ ｏ ｌ ｌ ｅ ｇ ｅ ， Ｎ ａ ｎ ｎ ｉ ｎ ｇ５ ３ ０ ２ ２ ￣Ｃ ｈ ｎａ ｉ ）
１ ６ ｈ ， 诱 导剂 Ｉ Ｐ Ｔ Ｇ 浓 度０ ． ８ ｍ ｍｏ ｌ ／ Ｌ 。
关键 词 ： 褐藻 胶裂 解 酶 ； 基因； 克隆 ； 条件 优化 ； 表 达
中图分 类号 ： Ｑ ８ １ ４
文 章编 号 ： ０ ２ ５ ４ — ５ ｏ ７ １ （ ２ ０ １ ７ ） １ ２ — ０ １ ２ ０ — ０ ６
摘 要： 采 用大 肠 杆菌 （ Ｅ ｓ ｃ ｈ ｅ ｒ ｉ ｃ ｈ ｉ ａ ｃ ｏ ｌ ｄ 表 达海 洋 弧菌 （ Ｖ ｉ ｂ ｒ ｉ ｏ ｓ ｐ ． ） Ｘ ５ １ １ 的褐 藻 胶裂 解 酶基 因 ， 以 实现对 该 酶 的人 量制 备 及 酶学 性 质
研 究 。通 过序 列分 析 ， 预 测 该酶 的前２ ０ 个氨 基 酸为信 号肽 ， 去 除信 号肽 后 的蛋 白质 分子质 量约 为 ３ ０ ２ ５ ４ ． ２ ８ Ｄ ａ ， 等 电点８ ． ７ ５ ， 分 子式 为 Ｃ ， Ｈ ｏ ｏ Ｎ， ６ ４ ０ ， Ｓ ， 对应 的基 因序列 命 名为 ａ ｌ ｇ １ ９ ８ ７ 。 按 如 下方 案构 建蕈 组菌 ： 设计 特异 性核 酸 引物 ， Ｐ ｃ Ｒ 扩 增得 到ａ １ ９ ８ ７ ； 将重 组质 粒 ｐ Ｅ Ｔ 一 ３ ０ （ ａ ） 一 ａ ｌ ｇ １ ９ ８ ７ 导入 大肠 杆 菌 Ｔ ｒ ａ ｎ ｓ ５ ｃ ￣ 进行测序； 提取 阳性ｐ Ｅ Ｔ 一 ３ ０ （ ａ ） 一 ａ ｌ ｇ Ｊ ９ ８ ７ 质 粒 导入 大 肠杆 菌Ｂ Ｌ ２ １ ， 利 用 异丙 基一 Ｊ Ｂ 一 ／ ９ － 硫 代 半 乳 糖苷 （ Ｉ Ｐ Ｔ Ｇ ） 诱 导表 达 。 十二烷 基硫 酸钠 聚 丙烯酰 胺 凝胶 电泳 （ Ｓ Ｄ Ｓ — Ｐ Ａ Ｇ Ｅ ） 检测 诱 导后 的重 组菌 胞液 上清 ， 发现 异源 表 达的 褐藻 胶裂 解 酶分 子质 量大 小 与预测 值 相近 。对 重组 菌 中的褐 藻 胶裂 解 酶进 行表 达条 件 优化 ， 结果 显示 ， 最 适参 数 为诱 导温 度 １ ６ ０ Ｃ ， 诱 导 时间
磷脂酶D的重组表达及其在磷脂酰丝氨酸合成中的应用
磷脂酶D的重组表达及其在磷脂酰丝氨酸合成中的应用侯海娟;史劲松;龚劲松;翟珅;徐敏;周文斌;陈杰鹏;段丽丽;张晓梅;许正宏【摘要】对磷脂酶D(phospholipase D,PLD)进行重组表达,并探究其在生物催化合成磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine,PS)中的应用.以大肠杆菌E.coli BL21 (DE3)作为PLD的异源表达宿主,构建重组菌E.coli BL21(DE3)/pET-28a(+)-sspld,通过蛋白分析确定其分子量,并对培养条件进行优化,进一步探究重组菌的酶学性质.在有机相-水相双相反应体系中进行PS的制备,并对制备工艺进行系统优化.成功构建了重组菌株E.coli BL21(DE3)/pET-28a(+)-sspld,通过蛋白分析确定其分子质量约为60 kDa.重组菌通过诱导条件优化,酶活最高可达38.58 U/mL,是优化前的2.26倍.PLD粗酶液的最适pH值为7.5,最适反应温度为60℃.制备工艺优化结果表明40℃条件下,在8 mL的乙酸乙酯中溶解64 mg的卵磷脂,在4 mL酶液中溶解160 mg的L-丝氨酸,得到的PS转化率最高,可达28％,产量为1.34 g/L.该PLD 粗酶液催化性能良好,为酶法制备磷脂酰丝氨酸奠定了基础.【期刊名称】《食品与发酵工业》【年(卷),期】2019(045)013【总页数】6页(P9-14)【关键词】磷脂酶D;磷脂酰丝氨酸;异源表达;酶学性质;催化条件【作者】侯海娟;史劲松;龚劲松;翟珅;徐敏;周文斌;陈杰鹏;段丽丽;张晓梅;许正宏【作者单位】江南大学药学院,糖化学与生物技术教育部重点实验室,江苏无锡,214122;江南大学药学院,糖化学与生物技术教育部重点实验室,江苏无锡,214122;江南大学药学院,糖化学与生物技术教育部重点实验室,江苏无锡,214122;江南大学药学院,糖化学与生物技术教育部重点实验室,江苏无锡,214122;江南大学药学院,糖化学与生物技术教育部重点实验室,江苏无锡,214122;江南大学药学院,糖化学与生物技术教育部重点实验室,江苏无锡,214122;广东双骏生物科技有限公司,广东汕头,515071;广东双骏生物科技有限公司,广东汕头,515071;江南大学药学院,糖化学与生物技术教育部重点实验室,江苏无锡,214122;江南大学药学院,糖化学与生物技术教育部重点实验室,江苏无锡,214122;江南大学生物工程学院,粮食发酵工艺与技术国家工程实验室,江苏无锡,214122【正文语种】中文磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine，PS)于1942年由JORDI FLOCH首次从牛脑中提取出来，随后对其进行了分子结构的定性分析[1]。
磷脂酶D特性及其在功能性磷脂生产中的应用
收稿日期：2020-06-15 基金项目：天津农学院大学生创新创业训练计划项目（201810061215） 作者简介：陈景（1996—），女，本科在读，研究方向：生物工程。E-mail：2417336926@。 通信作者：吴海清（1982—），女，实验师，硕士，研究方向：农产品加工、发酵微生物。E-mail：haiqing_w@。
Abstract: Phospholipase D (PLD) is a kind of enzyme which catalyzes the hydrolysis and base exchange of phosphodiesters. Functional phospholipids are prepared by transesterification of PLD. This paper introduced the molecular structure, catalytic mechanism and function of phospholipase. The production methods of phosphatidylserine (PS), phosphatidylglycerol (PG), phosphatidylethanolamine (PE) and phosphatidylinositol (PI) were mainly introduced, including physical extraction, chemical synthesis and enzymatic synthesis. Enzymatic synthesis is the most important method to prepare functional phospholipids. In addition, this paper prospected the future research on functional phospholipids. It is expected that the catalytic performance of PLD can be improved by improving the technical conditions and process system, which will provide theoretical and technical support for the industrial production of rare phospholipids. Key words: phospholipase D; characteristic; functional phospholipid; preparation method; application
小麦磷脂酶Dδ基因的克隆及表达分析
小麦磷脂酶Dδ基因的克隆及表达分析的报告，600字
小麦磷脂酶Dδ基因的克隆及表达分析报告
本报告旨在探讨小麦磷脂酶Dδ基因的克隆和表达分析情况。
小麦磷脂酶Dδ是一种海洋微生物所含的三氨基甲酸酶，主要
分布于磷脂膜中。
研究显示，该基因可能被利用作为用于识别脂质的基因标记。
小麦磷脂酶Dδ基因的克隆包括将基因从细胞株中提取并在宿
主上表达的研究过程。
首先，使用PCR技术将小麦磷脂酶Dδ
基因从小麦基因库中克隆出来。
然后，将克隆的基因插入表达载体中，结合宿主细胞以便基因的表达。
最后，从宿主细胞中分离表达小麦磷脂酶Dδ基因的材料，用于后续分析。
小麦磷脂酶Dδ基因的表达分析涉及通过实验来评估小麦磷脂
酶Dδ基因的表达情况的研究过程。
首先，使用实时定量PCR
技术确定小麦磷脂酶Dδ基因在宿主细胞中的表达水平。
然后，使用蛋白质印迹技术检测小麦磷脂酶Dδ基因对应的蛋白质在
宿主细胞中的表达情况。
最后，使用质谱技术检测小麦磷脂酶Dδ基因的结构和特性。
总而言之，本报告探讨了小麦磷脂酶Dδ基因的克隆和表达分
析情况。
克隆研究表明，成功地克隆出了小麦磷脂酶Dδ基因，并将其插入表达载体中，进一步确定小麦磷脂酶Dδ基因在宿
主细胞中的表达水平。
表达分析研究进一步确定了小麦磷脂酶Dδ基因对应的蛋白质在细胞中的表达情况，以及相关基因的
结构和特性。
磷脂酶D及其催化机制的研究进展
磷脂酶D及其催化机制的研究进展杨学利;马沁沁;袁向华;王一丁【摘要】磷脂酶D是一类具有水解作用和磷酰基转移作用的酶,故其在磷脂改性方面发挥重要作用.主要对磷脂酶D及其催化机制研究现状进行介绍,包括磷脂酶D 的来源与制备、催化合成磷脂质、磷脂酶D的分子结构、分子催化机制与分子改造.最后对磷脂酶D的发展进行了展望.【期刊名称】《中国油脂》【年(卷),期】2016(041)003【总页数】5页(P80-84)【关键词】磷脂酶D;磷脂质;催化合成;催化机制;分子改造【作者】杨学利;马沁沁;袁向华;王一丁【作者单位】四川师范大学生命科学学院,成都 610000;四川师范大学生命科学学院,成都 610000;四川师范大学生命科学学院,成都 610000;四川师范大学生命科学学院,成都 610000【正文语种】中文【中图分类】Q55;TQ426综合利用磷脂酶D(Phospholipase D，PLD)是一类能水解磷脂质生成磷脂酸和羟基化合物的酶，其催化部位为磷脂质的磷酸二酯键。
除了水解活性外，PLD还通过磷酰基转移作用催化磷脂质的极性头部基团的转移。
PLD的磷酰基转移作用尤为重要，它可以将大量磷脂酰胆碱(Phosphatidylcholine, PC)催化合成为自然界稀有的磷脂质，如磷脂酰乙醇胺(Phosphatidylethanolamine, PE)[1]、磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine, PS)、磷脂酰甘油(Phosphatidylglycerol, PG)。
合成的磷脂质在食品、化妆品、药品中有重要作用。
传统的PLD提取自动植物，后来研究者相继从微生物中发现并提取了PLD。
近年PLD的克隆表达成为研究热点，如基因的原核高效表达[2]及真核酵母表面展示[3]、定点突变[4]等。
本文主要从PLD的来源及制备、催化合成磷脂质、催化机制及分子改造等方面介绍PLD的最新研究进展。
1.1 PLD的来源1947年 Hanahan 和 Chaikoff首次在胡萝卜和白菜叶子中发现了PLD，随后人们相继从各种植物的根、叶子和种子等器官中发现并提取了PLD。
生物酶法制备磷脂酰丝氨酸的研究进展
生物酶法制备磷脂酰丝氨酸的研究进展胡飞;段章群;王淮;王瑛瑶;栾霞;姚日生【摘要】Recently research showed that phosphatidylserine had beneficial effects on preventing Alzheimer's dementia and improving memory. However, its natural form was less, its extraction process was complicated and the product safety was doubted. Enzymatic method for preparing phosphatidylserine exhibited many advantages, such as mild reaction conditions,environment -friend and high product quality. The advance in the enzyme and the reaction system of enzymatic synthesis of phosphatidylserine were reviewed at home and abroad, and exploiting high efficient, stable enzyme and seeking green, safe process were suggested to promote enzymatic production of phosphatidylserine in industrial scale.%近年来的研究表明,磷脂酰丝氨酸具有预防老年痴呆症、改善记忆力等功能.但是天然存在的磷脂酰丝氨酸很少,提取工艺繁杂,并且产品安全性受到人们质疑.生物酶法制备磷脂酰丝氨酸具有反应条件温和、环境友好、产品质量好等优点,近年来受到越来越多的关注.从用于生物酶法制备磷脂酰丝氨酸的酶和反应体系等方面综述了国内外生物酶法制备磷脂酰丝氨酸的相关研究进展,并指出开发稳定高效的酶制剂和探寻绿色安全的新工艺等措施有助于促进生物酶法工业化生产磷脂酰丝氨酸.【期刊名称】《中国油脂》【年(卷),期】2012(037)006【总页数】5页(P54-58)【关键词】磷脂酰丝氨酸;磷脂酶D;反应体系【作者】胡飞;段章群;王淮;王瑛瑶;栾霞;姚日生【作者单位】合肥工业大学医学工程学院,合肥230009;国家粮食局科学研究院,北京100037;国家粮食局科学研究院,北京100037;合肥工业大学医学工程学院,合肥230009;国家粮食局科学研究院,北京100037;国家粮食局科学研究院,北京100037;合肥工业大学医学工程学院,合肥230009【正文语种】中文【中图分类】TS229;TQ645Abstract:Recently research showed that phosphatidylserine had beneficial effects on preventing Alzheimer's dementia and improvingmemory.However，its natural form was less，its extraction process was complicated and the product safety was doubted.Enzymatic method for preparing phosphatidylserine exhibited many advantages，such as mild reaction conditions，environment－friend and high product quality.The advance in the enzyme and the reaction system of enzymatic synthesis of phosphatidylserine were reviewed at home and abroad，and exploiting high efficient，stable enzyme and seeking green，safe process were suggested to promote enzymatic production of phosphatidylserine in industrial scale.Key words:phosphatidylserine;phospholipase D;reaction system磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine)是一种稀少磷脂，虽然在人体中含量极少(总量约60 g)，但其功能独特。
磷脂酶D 信号转导与植物耐盐研究进度
磷脂酶D 信号转导与植物耐盐研究进度本文从网络收集而来，上传到平台为了帮到更多的人，如果您需要使用本文档，请点击下载按钮下载本文档（有偿下载），另外祝您生活愉快，工作顺利，万事如意！植物细胞膜较早感受、传导外界各种胁迫信号。
磷脂是细胞膜的骨架成分，其水解产物参与生理生化、细胞信号转导以及环境刺激引起的细胞应答等多个过程。
磷脂酶是代谢磷脂的关键酶，根据其水解位点不同分磷脂酶A1(Phospholipase A1，PLA1)、磷脂酶A2(Phospholipase A2，PLA2)、磷脂酶C(Phospholipase C，PLC)和磷脂酶D(PhospholipaseD，PLD)。
PLD 是植物中最早被发现和克隆的磷脂酶基因，广泛分布于根、茎、叶、花、果实和种子等各个组织。
根据基因序列和结构域的不同，拟南芥12 个PLD 基因分为6 类：PLDα(1-3)，PLDβ(1，2)，PLDγ(1-3)，PLDδ，PLDε 和PLDζ(1，2)。
除了PLDζ，植物PLD 基因都包括N 端的C2 结构域，属于结合磷脂的折叠域，与Ca2+ 的结合有关，是植物PLD 特有的结构;两个重复的HKD 区域是所有真核PLD 基因共有的结构域，对PLD 活性非常重要。
PLDζ 除了含有HKDs 结构域，还有两个N 端特殊结构域PX(Phox homology)和PH(Pleckstrinhomology)，PX 富含脯氨酸残基，可以与磷酸肌醇结合，而PH 可以与磷脂酰肌醇结合。
PLD 基因除了结构上的共性以外，还有一些特殊性，如PLDβ1 拥有一个PIP2 结合区，可以被PIP2 和Ca2+ 协同激活;PLDα1 在两个HKDs 结构域中间包含DRY 基序，此结构域可以和异三聚体G 蛋白亚基α(Gα)结合，从而增强Gα 的GTP 酶活性，共同调节气孔运动与水分散失。
在第一个HKD 结构域后，PLDδ 包含一个油酸结合区域。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
的重组磷脂 酶 Ｄ 作 用 于底 物 卵磷 脂 和丝 氨 酸定 向合
成磷 脂酰 丝氨酸 ， 为 实 现工业 化酶 法合 成 磷 脂酰 丝 拟
氨酸奠定基 础 。
３（ 下划线 部分 为加 入 的 Ｂ ｍＨ ａ Ｉ酶切 位 点 ） 下 游序 ，
目前大规 模生产磷 脂酰丝 氨酸 的重要性 不仅仅 在 于其 生物学及 工业化 应用潜力 ， 同时也 与其 在保健 、 营 养 品方面 的逐 渐应 用 有关口 ］ 。 。然 而无 论 从 自然 界 分 离提 取或化学 合成 法生 产磷 脂 酰 丝氨 酸 都 十分 复 杂 ， 且化学 法合成 也仅 限于实验 室 ｊ 。 目前研究 人员正 寻求利用 酶特别 是不 同来源 的磷 脂酶 Ｄ进行酶 法转 化 来定 向合成 磷 脂 酰丝 氨 酸ｌ 。 ２ ］ 磷脂酶 Ｄ Ｐ ｏ ｐ ｏｉａｅＤ， Ｉ Ｅ ． ． ． ） （ ｈ ｓ ｈ ｌ ｓ Ｐ Ｃ ３ １４ ４ 首先发 ｐ Ｄ； 现于植 物 中 （ 卷心 菜 、 生 等作 物 ） 之 后 在微 生 如 花 ， 物 （ ］链霉 菌 、 肠 杆 菌 、 门 氏菌 等 ） 哺 乳 动 物 细 大 沙 和 胞＿ 中均 有发现 。它不但 可 以水解 卵磷 脂生成磷 脂 酸 ７ 和胆碱 ， 通过 打断其磷 酸酯键 完成反应 ， ］ 而且 当有 分 子作 为亲核供 体时 ， 脂 酶 Ｄ能催 化 转酯 反应 ＿ 。同 磷 ｇ ］ 时 ， 自微生 物界 的磷 脂酶 Ｄ相 对 于来 自植 物界 的有 来 更强 大的转酯 能力 ， 物特 异性 低 。其 中又 以源 自链 底 霉菌属 的磷 脂 酶 Ｄ 的转酯 能 力 尤 为 突 出 。但 由 于链 霉菌磷脂 酶 Ｄ产 量 低且 菌 生长 周 期长 （ ７ｄ ＿ ］ 近 ）ｌ ， “
所； 大肠 杆 菌 Ｊ Ｏ Ｍｌ ９和 Ｂ ２ （ Ｅ ） 别 为 克 隆 和表 Ｌ １Ｄ ３分 达 的宿主 菌 ， 由本 实 验 室 保 藏 ； 隆和 表 达 载 体 为 均 克
ｐ ＥＴ一 ２ （ ） ２ｂ ＋ 。
１ ２ 主 要 试 剂 ．
Ｂ ｍＨ ＨｉｄⅢ限 制性 内切 酶 、 Ａ Ｔ ｑＤＮＡ ａ Ｉ、 ｎ Ｌ ａ
组磷 脂酶 Ｄ 活 力 达到 ３ ・（ ９Ｕ ｍｇ蛋 白） 。
关键 词 ：色褐 链 霉 菌 ； 脂 酶 Ｄ； 因表 达 ； 酯反 应 磷 基 转
中 图分 类 号 ： ４ ． Ｑ ９６ ５ 文献标识码 ： Ａ 文 章 编 号 ： ６ ２ ５ ２ （ ０ ７ ０ — ０ ４ 一Ｏ １ ７ — ４ ５ ２０ ）５ ０ ８ ４
维普资讯
困
２７ｏ ４ｏ 亿 亏与生物 互程 ０，Ｉ ． ０Ｖ． Ｎ５ ２
Ｃｈ ｍｉｔｙ ＆ Ｂｉｅ ｇｎ ｅ ｉｇ ｅ ｓｒ ｏ ｎ ｉｅ ｒ ｎ
色褐 链霉 菌磷 脂 酶 Ｄ基 因 ｐｄ的克 隆与表 达 ｌ
李 斌 。 福平 ， 文玉 。 路 史 杜连祥 （ 天津科技 大 学天 ０ ２ ２
给实 际应用带来 了很 多困难 。 作 者利用 表达质粒 ｐ Ｔ ２ ｂ（ ） 将来 自色褐链 Ｅ 一２ ＋ ，
色 褐 链 霉 菌 （ ｔｅ ｔｍｙｅ ｈ ｏ ｆ ｓｕ Ａ Ｓ ｒｐｏ ｃｓ ｃｒｍｏ ｕｃｓ Ｓ
４ ３ １ 为磷 脂 酶 Ｄ 基 因 的供 体 菌 ， 自中科 院 北 微 ．３ ） 购
然后利 用镍 亲 和纯化 柱进 行 纯化 回收 ， 再利 用 纯 化后
１４ Ｐ Ｒ扩增及 重组质 粒构建 ． Ｃ
参 照 Ｇｅ Ｂ ｎ （ ５ ３ ２ ． ） 道 的 色褐 链 霉 菌 ｎ ａ ｋ ＡＦ ２ ８ ３ １ 报 磷脂 酶 Ｄ基因 （ ｌ 序列 设 计 引 物 ， 游 引 物 Ｐ ： ， ｐ ｄ） 上 １ ５＿
公 司 。镍 亲 和纯化柱 ， ｖ ｇ ｎ Ｎｏ ａ ｅ 。
１３ 培 养 基 ．
酵母麦芽 提取物 培养 基 ： 芽 浸粉 １ 麦 ０ ｇ・Ｉ ， 葡
萄糖 ４ ｇ・Ｌ ， 酵母 提取 物 ４ｇ・Ｉ ， Ｈ 值 ７ ３ ｐ ． ～
７ ．５。
Ｉ Ｂ液体 培养基 ： 蛋 白胨 １ 胰 ０ｇ・Ｌ ， 母 提取 酵
聚合酶 、 ＮＡ Ｍａｋ ｒＴ Ｋａ ａ 司 ； 白质 Ｍａｋ ｒ Ｄ ｒｅ， ａ Ｒ 公 蛋 ｒｅ 、
丝氨 酸 ， 上海 生 工 ； 豆 卵磷 脂 （ ｈ ｓ ｈ ｔ ｙｃ ｏｉｅ 大 Ｐ ｏ ｐ ａｉ ｌ ｌ ， ｄ ｈ ｎ Ｐ ） 磷 脂 酰 丝 氨 酸 （ ｈ ｓ ｈ ｔ ｙｓｒｎ ， Ｓ ， ｉｍａ Ｃ、 Ｐ ｏｐ ａｉ ｌｅｉｅ Ｐ ） Ｓｇ ｄ
摘
要 ： 用表 达 栽 体 ｐ Ｔ ２ ｂ ＋ ） 实 现 了色褐 链 霉 菌磷 脂 酶 Ｄ 基 因在 大 肠 杆 菌 Ｂ ２ （ Ｅ ） 的 高效 表 达 。利 利 Ｅ 一２ （ ， Ｌ １Ｄ ３ 中
用 镍 亲 和 柱对 表 达 产 物进 行 纯化 ， 纯化 后 的 重 组 磷 脂 酶 Ｄ 作 用 于 底 物 卵磷 脂 和 丝 氨 酸 定 向 合 成 磷 脂 酰 丝 氨 酸 ， 用 将 并 ＨＰ Ｉ Ｃ法 检 测 酶 活 力 。结 果 表 明 ， 目的 蛋 白 可在 短 时 间 内进 行 大 量表 达 。转 酯 反 应 ６ｈ后 卵磷 脂 的 转化 率 达 到 ３ ， １ 重
物 ５ｇ・Ｌ 。Ｎａ １ ０ｇ・ ＿ ， Ｈ 值 ７ ０ 灭 菌后待 液 ＿ ， Ｃ Ｌ 。ｐ １ ．，
体 培 养 基 冷 却 至 ５ ℃后 ， 入 ＡＭＰ 液 体 至 终 浓 度 ０ 加
ｉ ０ ／ｇ ・ｍ Ｌ ０ ｉ 。
霉菌 的磷 脂酶 Ｄ 基 因 （ ｌ 在 大 肠杆 菌 中大 量 表达 ， ｐｄ）