腈水合酶研究进展

腈水合酶研究进展摘要从腈水合酶的结构、分布、酶学性质及其基因克隆和生产中的利用形式等方面简要阐述了腈水合酶的研究进展。

关键词腈水合酶；酶学性质；基因克隆腈水合酶（Nitrile hydratase，EC4.2.1.84）是一类可以催化腈类物质转化成相应酰胺类物质的酶[1]，其最初是由日本学者Asano发现并命名的。

微生物的腈水合酶作为生物催化剂应用在有机物合成的工艺上具有巨大的潜力，它的反应条件温和、产率高、副产物少、产物的自聚损失少，具有区域选择性、立体选择性和光激活性，可广泛应用于氨基酸、酰胺、羧酸及其衍生物的合成。

更重要的是，它环境污染小、成本低、符合绿色化工发展理念，有着化学方法无法替代的优越性，从而促进了精细化工产品、可降解塑料和手性药物以及维生素等方面的研制和开发。

因此，20多年来一直受国内外研究者的广泛关注。

1腈水合酶的产生菌及其结构无论是腈类物质还是酰胺类物质对人体来说都是极其有毒的[2]，然而有些微生物却能利用它们作为自身生长的碳源和氮源。

原因就在于这些微生物能够自身合成降解腈类物质的酶—腈水合酶（NHase），腈水合酶是某些微生物在进行肟或尿代谢过程中所产生的一种蛋白[3]。

目前已知可产腈水合酶的菌株有红球菌、诺卡氏菌、假诺卡氏菌、棒状杆菌、假单胞菌、产碱杆菌、短杆菌等。

可见产腈水合酶的菌的分布相当广泛[4]。

不同菌株的腈水合酶在结构上存在着一定的差异，但是也存在来自不同菌株的腈水合酶在结构上的相同。

尽管不同菌株的腈水合酶在氨基酸序列上存在差异，但是它们仍然存在着一个共同点，那就是在酶的活性部位都含有螯合的金属离子作为辅助因子。

根据所含辅助因子的不同，腈水合酶可分为2类，一类为高分子量腈水合酶（H-NHase），其所含金属离子为钴；另一类为低分子量腈水合酶（L-NHase），其所含金属离子为铁。

尽管铁型和钴型腈水合酶在氨基酸序列上具有极大的同源性，但这2种酶在生物转化活性和底物特异性上还是有着很大的差异。

Tsujimura[5]等通过X-ray以及傅立叶变换离子回旋共振质谱分析证明，腈水合酶由αβ亚基以二聚体（αβ）2的形式存在，每个亚基的分子量大约为23KDa，酶的光学活性催化中心上的非铁血红素与3个半胱氨酸残基（αCys109，αCys112和αCys114）上的硫原子、主链αSer113和αCys114上的2个酰胺氮原子配位。

3个半胱氨酸残基中，αC ys112、αCys114在转录后分别被修饰成Cys-SO2H、Cys-SOH，Cys112被Nagashima等通过质谱得到明确证明，这种修饰是腈水合酶发挥活性所必不可少的。

而对αCys114的修饰可能由于自身的不稳定，在晶体结构上不易检测。

αCys112、αCys114作为酶的活性中心与金属离子（Fe或Co）[6]形成稳定的八面体结构。

Piersma等进一步的定点突变研究表明，来自红球菌N-771的铁型腈水合酶β亚基上的56位以及141位的精氨酸参与了修饰后的半胱胺酸残基的定位，调整活性中心铁的电子态以适于催化。

2腈水合酶的酶活及产酶条件优化研究最早提出使用微生物法生产酰胺的是法国研究者Galzy及其研究组，他们发现了一组催化腈水解的微生物Brevibacterium R312，当时酶活较低。

随后日本学者对产腈水合酶菌做了大量研究工作。

1982年，京都大学山田秀明研究组发现了Pseudomonas Chloraphis B32，经过对其驯化使其酶活达到1 260个单位。

1988年，山田秀明等又发现了一种性能更好的腈水合酶产生菌Rhodococcusrhodococcus J-1，其酶活可达1 630个单位，一度成为日本酰胺生产的工程菌。

我国1984年开始该技术的研究工作，经过10余年的不懈努力，上海生物工程中心培养的菌种产酶活达到了2 837个单位，与日本1991年用于工业生产的J1菌种处于同一水平[7]。

底物或产物浓度达到一定量时会对腈水合酶产生菌带来一定毒性，因而其高产菌株大都是通过重复继代培养，不断提高其耐受性并不断优化产酶条件而获得的。

目前国内在菌株的驯化方面做得比较成熟。

从不同菌株出发，几乎得到了相同的产酶优化条件：葡萄糖浓度为20g/L，诱导剂脲添加量为0.06g/L，钴加入量为0.3g/L，温度为30℃，培养基初始pH值为7.0[8]。

腈水合酶是一种可溶性的诱导酶，诱导剂在腈水合酶的合成过程中具有决定性的作用，只有在培养体系中加入特定的诱导剂后，腈水合酶的活力才能显著提高。

与其他诱导酶不同，腈水合酶常会受到其催化产物的诱导而非底物。

3腈水合酶基因的克隆目前生产腈代谢酶系的野生菌在应用中存在酶稳定性差、对底物和产物的耐受性不强及间歇生产、产品质量不稳定等问题，更为突出的是大多数腈水合酶产生菌的同时也会产酰胺酶，酰胺酶会使腈水合酶催化的产物酰胺转化为相应的酸，从而在一定程度上降低酰胺的产量。

为了解决这些问题，从20世纪80年代末期以来，各国研究者纷纷采用了基因克隆的手段。

基因工程菌表达腈代谢酶系有很多野生菌不可替代的优点，如腈水合酶基因可单独克隆，不会相互干扰，不会因产酸降低了发酵液的pH值而抑制腈水合酶的活性，基因工程菌背景清晰，有利于对基因表达调控机理进行深入研究，同时它的适应性强，发酵周期短，有利于实现大规模培养和工业化生产，从而有着更广阔的应用前景。

腈水合酶以基因簇的形式存在，即编码不同蛋白的多个基因片断按照一定的顺序首尾相连地排列在一起，由1个启动子启动它们的表达，表达的蛋白大多能相互调控、相互协作完成一系列代谢功能。

早在1991年Nishiyama[9]就在绿阵假单胞菌中发现，腈类化合物代谢基因的核苷酸序列中含有编码5种蛋白的开放阅读框，分别为酰胺酶基因、腈水合酶α亚基基因、腈水合酶β亚基基因、p47k 基因和orfE基因，在不同菌株的腈水合酶基因簇中，这5个开放阅读框的排列可能会有所差异，它们的方向及位置关系表明，这些基因是由一条mRNA共同转录的。

克隆腈水合酶时，首先要得到野生菌株的尽可能多的基因信息，一般都是以标准的方法提取野生菌的全部基因组DNA，然后进行测序或通过查阅多种基因文库确定该菌株中的腈水合酶基因序列，根据两端的序列设计探针，并以PCR的方法扩增得到的克隆片断，反应条件由探针的长度和性质决定。

然后将商用质粒和扩增片断通过酶切后连接在一起，构建新型质粒，再转入宿主菌中表达。

虽然已经克隆并测序了多种编码腈水合酶的α和β亚基的基因，但在大肠杆菌作为宿主的体系中，由于基因在新的机制下启动和调控受到一定的限制，表达出的蛋白又易聚集而形成包含体，所以蛋白的过量表达和活性表达都遇到了相当大的困难，在过去的10多年中进展缓慢[10]。

毕赤酵母也是一种用于外源蛋白表达的理想宿主菌，近年来它的应用越来越广泛。

Wu等用基因工程毕赤酵母通过共表达3个同源蛋白成功地表达了具有立体异构选择性的腈水合酶。

同时还由于基因被整合到毕赤酵母的染色体上从而稳定遗传，因而解决了因质粒的不稳定性所带来的诸多问题。

另外，枯草芽孢杆菌表达体系可以将外源蛋白分泌到胞外或细胞周质中，减少形成包含体的可能，这为重组腈水合酶的活性表达又提供了一条新途径。

除此，各国研究者对强化腈水合酶的活性表达提出了各种思路，包括同时克隆基因表达所必需的上下序列[11]、强化翻译后修饰作用[12]、新型宿主载体系统[13]以及基因突变[14]等。

4腈水合酶的利用形式包埋法即利用线状或网状的高分子聚合物将细胞截留在网格空间内，使其成为一种既保持本身催化活性又在生物催化反应后可以回收和重复使用的生物催化剂。

主要包埋载体有海藻酸钠和PAM。

用海藻酸钠包埋，原料易得，无毒性，操作简单安全，但存在机械强度低、通透性差、细胞易流失、产品质量不高等缺点。

用PAM包埋可在较大范围内改变固定化细胞的机械性能和凝胶孔的大小。

凝胶颗粒柱微生物分解性强，机械强度高，化学性能稳定；缺点是固定化细胞成型性和可控性不好。

制备过程中常出现细胞会受化学试剂生理毒性和其他因素的影响，导致固定化细胞酶活力损失很大。

游离细胞法即将游离细胞悬浮于底物溶液中，使底物和反应产物较易通过细胞膜，从而提高了反应速率。

此法操作工艺简单，腈水合酶的催化效率很高；但存在以下缺点：设备投资大，操作费用高，膜污染等。

目前国内主要采用此法完成细胞分离和洗涤过程，然后将游离细胞投入生物反应器反应，再将得到的水合反应液用截留分子量为60KDa左右的超滤膜进行过滤。

目前国外所采用的生物反应器形式多种多样，有搅拌罐式的、填充床式的、流化床式的等。

各种反应器各有利弊，需权衡得失进行选择。

反应器是腈水合酶利用形式的发展方向。

5结语随着世界各国对化工原料丙烯酰胺需求的不断增加以及它所具有的光学活性在制药领域的应用，人们对于腈水合酶的研究必定会更加深入。

对于腈水合酶产生菌的筛选育也是一件十分有意义的工作，目前国内外有不少实验室已筛选到了酰胺酶缺陷型菌株，但其腈水合酶的活性并不理想，希望不久的将来研究人员能够在这方面有所突破。

为了使微生物法生产丙稀酰胺得到更加广泛应用，研究者还需对高产腈水合酶野生菌进行深入细致地研究，包括这些菌株的全部基因组序列和结构的特征。

在丙烯酰胺的实际生产中，酶活的不稳定性成为阻碍连续生产的关键，最本质的解决方法需要从基因工程的角度，找到基因序列的改变对于氨基酸序列、肽键的折叠方式以及亚基空间构象的影响，构建使酶能够稳定活性表达的突变菌株，不仅使微生物法生产丙烯酰胺的工艺得到进一步发展，又为我国水处理、造纸等传统工业的发展注入新的活力。

伴随着一些新兴学科——生物信息学、蛋白质组学等的不断成熟，再结合基因工程技术，产腈水合酶的重组体在生产中也会大有作为。

6参考文献[1] W NOWAK，Y OHTSUKA，J HASEGAWA，et al.Density functional study on geometry and electronic structure of nitrile hydratase active site model[J].International Journal of Quantum Chemistry，2002，90（3）：1174-1187.[2] 李志东，宋旭鹭，张洪林，等.微生物法生产丙烯酰胺的研究进展[J].长春理工大学学报，2006，29（3）：91-95.[3] 蔡军.腈水合酶催化剂应用技术研究进展[J].河南化工，2005（22）：7-9.[4] 马武生，马同森，杨生玉.腈水合酶及其在丙烯酰胺生产中应用的研究进展[J].化学研究，2004，15（1）：75-76.[5] M TSUJIMURA，N DOHMAE，M ODAKA，et al.Structure of the photoreaction iron center of nitril hudratase from Rhodococcus sp.N-771[J].Evidence of a noval post-translational modification in the cysteine ligand J Biol Chem，1997，272（47）：29454-29459.[6] H KOMEDA，M KOBAYASHI，S SHIMIZU.Characterization of the gene cluster of high－molecular-mase nitrile hydratase induced by its（下转第195页）（上接第190页）reaction product in Rhodococcus[J].Proc Natl Acacl Sci USA，1996，93（9）：4267-4272.[7] 李志东，宋旭鹭，张洪林.微生物法生产丙烯酰胺的研究进展[J].长春理工大学学报，2006，29（3）：91-95.[8] 赵霞，王纯利，娄恺.腈水合酶产生菌发酵条件的优化及其酶学性质研究[J].新疆农业大学学报，2006，29（1）：40-43.[9] S KIM，P ORIEL.Cloning and expression of the nitrile hydratase and amidase genes from Bacillus sp BR449 into Escherichia coli[J].Enzyme microb.technol，2000，27（7）：492-501.[10] 史悦，孙旭东，于慧敏，等.有效增强重组腈代谢酶系表达活性的策略[J].现代化工，2003，23（9）：23-27.[11] M NOJIRI，M ODAKA.Functional expression of nitrile hydratase in Escherichia coli；Requirement of a nitrile hydratase activator and post-translational modification of a ligand cysteine[J].J Biochem，1999，125（4）：696-704.[12] I ENDO，M ODAKA.What evidences were ducidated about photoreactive nitrile hydratase[J].Journal of Molecular Catalysis B Enzymatic，2000，10（1）：81-86.[13] R DURAN.New shuttle vectors for Rhodococcus sp.R312，a nitrile hydratase producing strain[J].Journal of Basic Microbiology，1999，38（2）：101-106.[14] S PIERSMA，M NOIJRI，M TSUJIMURA，et al.Arginine 56 mutation inthe beta subunit of nitrile hydratase，importance of hydrogen bonding to the non-heme iron center[J].Journal of Inorganic Biochemistry，2000，80（3）：283-288.。