实训二细菌性疾病的实验室诊断
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实训二
细菌病的实验室诊断
实验内容
病理剖检 细菌分离培养、涂片染色镜检 培养物鉴定
• 涂片染色镜检 • 纯化培养、鉴别培养 • 生化试验
一、目的
• 掌握×细菌病的实验室诊断方法。 掌握×
二、器材 二、器材
• 动物：病死鸭 • 器材：搪瓷盘、手术刀、手术剪、镊子、玻片、革兰 氏染液、电吹风、酒精棉、酒精灯、接种环、普通琼 脂、麦康凯琼脂、鲜血琼脂平板、显微镜、擦镜纸、 香柏油、生化培养管
根据试验结果判定所分离细菌为何种细菌。
生化试验结果
反应类型 葡萄糖 乳糖 靛基质 M.R V-P H2S 反应结果 大肠 三糖铁
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斜面黄色，底层变 黄有气泡，不产H 黄有气泡，不产H2S
沙门
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斜面红色，底层变
黄有气泡，部分菌株产H 黄有气泡，部分菌株产H2S 巴氏 鸭疫 + + + 底层产酸，斜面产酸
• 硫化氢试验：含醋酸铅的培养基。用接种针蘸取细菌的纯 硫化氢试验：含醋酸铅的培养基。用接种针蘸取细菌的纯 培养物，沿管壁穿刺接种，培养1 2d， 培养物，沿管壁穿刺接种，培养1-2d，穿刺线周围变黑色 者为阳性，不变为阴性。 尿素酶试验：可购买尿素发酵管，操作方法同糖发酵试验， • 尿素酶试验：可购买尿素发酵管，操作方法同糖发酵试验， 由黄变红的为阳性，不变的为阴性。 黄变红的为阳性，不变的为阴性。 • 柠檬酸盐斜面：为绿色，表面划线。阳性：变兰；阴性： 柠檬酸盐斜面：为绿色，表面划线。阳性：变兰；阴性： 不变。 • 三糖铁斜面：为红色，先表面划线，再穿刺接种至管底。 三糖铁斜面：为红色，先表面划线，再穿刺接种至管底。 在斜面生长，产酸，培养基变黄；穿刺生长产酸产气，底 部变黄，出现空隙；产硫化氢底部变黑。
取出上次的病料
• 用火焰灼烧手术刀片，烫肝脏（心脏、脾脏等器官）表 面，并迅速划小口 • 用无菌接种环钩取组织，划线于血琼脂平板，置37℃ 用无菌接种环钩取组织，划线于血琼脂平板，置37℃ CO2培养箱或烛缸中培养48-72h观察。 培养箱或烛缸中培养48-72h观察。
3、生化试验
• 糖发酵试验：葡萄糖（红）、乳糖（黄）、麦芽糖（蓝）、 糖发酵试验：葡萄糖（红）、乳糖（黄）、麦芽糖（蓝）、 蔗糖（黑）、甘露醇（白） 靛基质试验（吲哚试验）：1%蛋白胨水培养基；靛基质试剂。 • 靛基质试验（吲哚试验）：1%蛋白胨水培养基；靛基质试剂。 培养24-48h，沿管壁加入吲哚试剂2ml，变红色为阳性，不 培养24-48h，沿管壁加入吲哚试剂2ml，变红色为阳性，不 变为阴性。 • MR试验：培养基：蛋白胨水；甲基红试剂。培养2-7d，加入 MR试验：培养基：蛋白胨水；甲基红试剂。培养2 7d，加入 几滴甲基红试剂，变红者为阳性，不变的为阴性。 几滴甲基红试剂，变红者为阳性，不变的为阴性。 • V-P试验：培养基：蛋白胨水； V-P试剂甲和试剂乙。培养 试验： 试剂甲和试剂乙。培养 2-7d，按每毫升培养基加入0.5ml6%a-萘酚酒精，再加入 7d，按每毫升培养基加入0.5ml6%a-萘酚酒精，再加入 0.2ml40%KOH，混合均匀，静置观察2 4h。5min内变粉红色 0.2ml40%KOH，混合均匀，静置观察2-4h。5min内变粉红色 者为强阳性，数小时内变粉红色者为阳性，隔夜后仍不变色 为阴性。
如有多个样品同时需要制成抹片，只要染色方法相同，亦 可在同一张玻片上有秩序地排好，做多点涂抹，或者先用 蜡笔在玻片上划分成若干小方格，每方格涂抹一种样品。
（2）染色：染色步骤为： 染色：染色步骤为：
• 在已干燥、固wenku.baidu.com好的抹片上，滴加草酸铵结晶紫溶液，经1— 在已干燥、固定好的抹片上，滴加草酸铵结晶紫溶液，经1 2min，水洗。 2min，水洗。 • 加革兰氏碘溶液于抹片上媒染，作用1—3min，水洗。 革兰氏碘溶液于抹片上媒染，作用1 3min，水洗。 • 加95％酒精于抹片上脱色，约0．5～1min，水洗。 95％酒精于抹片上脱色，约0 1min，水洗。 • 加稀释的石炭酸复红(或沙黄水溶液)复染10～30s，水洗。 加稀释的石炭酸复红(或沙黄水溶液)复染10～30s，水洗。 • 吸干或自然干燥。
一、病理剖检 一、病理剖检
• 记录病理变化
二、细菌分离培养和抹片、染色、镜检 二、细菌分离培养和抹片、染色、镜检
• 1、细菌分离培养 • （1）用火焰灼烧手术刀片，烫肝脏（心脏、脾脏等 器官）表面，并迅速划小口 • （2）用无菌接种环钩取组织，划线于普通琼脂、麦 康凯琼脂，在37℃温箱培养24h观察。 康凯琼脂，在37℃温箱培养24h观察。
2、抹片、染色、镜检
• （1）抹片：用镊子夹取病变组织肝、脾等，然后以 抹片：用镊子夹取病变组织肝、脾等，然后以 灭菌剪刀剪取小块，将其新鲜切面在玻片上压印或抹 灭菌剪刀剪取小块，将其新鲜切面在玻片上压印或抹 涂成薄层，自然干燥。将干燥好的抹片，涂抹面向上， 涂成薄层，自然干燥。将干燥好的抹片，涂抹面向上， 以其背面在酒精火焰上来回通过几次，略做加热固定。
（3）镜检： 镜检：
三、培养物鉴定
1、涂片、染色、镜检 • 先用灭菌接种环取少量生理盐水或蒸馏水，置于玻片 中央，然后再用灭菌接种环取少量材料，在液滴中混 合；均匀涂布成适当大小的薄层，干燥、固定。染色， 镜检。
大肠杆菌革兰氏染色
2、纯化培养、鉴别培养
• 从单个菌落调取部分培养物，划线接种于麦康凯培养基， 从单个菌落调取部分培养物，划线接种于麦康凯培养基， 置37℃培养箱培养24h观察。 37℃培养箱培养24h观察。
细菌病的实验室诊断
实验内容
病理剖检 细菌分离培养、涂片染色镜检 培养物鉴定
• 涂片染色镜检 • 纯化培养、鉴别培养 • 生化试验
一、目的
• 掌握×细菌病的实验室诊断方法。 掌握×
二、器材 二、器材
• 动物：病死鸭 • 器材：搪瓷盘、手术刀、手术剪、镊子、玻片、革兰 氏染液、电吹风、酒精棉、酒精灯、接种环、普通琼 脂、麦康凯琼脂、鲜血琼脂平板、显微镜、擦镜纸、 香柏油、生化培养管
根据试验结果判定所分离细菌为何种细菌。
生化试验结果
反应类型 葡萄糖 乳糖 靛基质 M.R V-P H2S 反应结果 大肠 三糖铁
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斜面黄色，底层变 黄有气泡，不产H 黄有气泡，不产H2S
沙门
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斜面红色，底层变
黄有气泡，部分菌株产H 黄有气泡，部分菌株产H2S 巴氏 鸭疫 + + + 底层产酸，斜面产酸
• 硫化氢试验：含醋酸铅的培养基。用接种针蘸取细菌的纯 硫化氢试验：含醋酸铅的培养基。用接种针蘸取细菌的纯 培养物，沿管壁穿刺接种，培养1 2d， 培养物，沿管壁穿刺接种，培养1-2d，穿刺线周围变黑色 者为阳性，不变为阴性。 尿素酶试验：可购买尿素发酵管，操作方法同糖发酵试验， • 尿素酶试验：可购买尿素发酵管，操作方法同糖发酵试验， 由黄变红的为阳性，不变的为阴性。 黄变红的为阳性，不变的为阴性。 • 柠檬酸盐斜面：为绿色，表面划线。阳性：变兰；阴性： 柠檬酸盐斜面：为绿色，表面划线。阳性：变兰；阴性： 不变。 • 三糖铁斜面：为红色，先表面划线，再穿刺接种至管底。 三糖铁斜面：为红色，先表面划线，再穿刺接种至管底。 在斜面生长，产酸，培养基变黄；穿刺生长产酸产气，底 部变黄，出现空隙；产硫化氢底部变黑。
取出上次的病料
• 用火焰灼烧手术刀片，烫肝脏（心脏、脾脏等器官）表 面，并迅速划小口 • 用无菌接种环钩取组织，划线于血琼脂平板，置37℃ 用无菌接种环钩取组织，划线于血琼脂平板，置37℃ CO2培养箱或烛缸中培养48-72h观察。 培养箱或烛缸中培养48-72h观察。
3、生化试验
• 糖发酵试验：葡萄糖（红）、乳糖（黄）、麦芽糖（蓝）、 糖发酵试验：葡萄糖（红）、乳糖（黄）、麦芽糖（蓝）、 蔗糖（黑）、甘露醇（白） 靛基质试验（吲哚试验）：1%蛋白胨水培养基；靛基质试剂。 • 靛基质试验（吲哚试验）：1%蛋白胨水培养基；靛基质试剂。 培养24-48h，沿管壁加入吲哚试剂2ml，变红色为阳性，不 培养24-48h，沿管壁加入吲哚试剂2ml，变红色为阳性，不 变为阴性。 • MR试验：培养基：蛋白胨水；甲基红试剂。培养2-7d，加入 MR试验：培养基：蛋白胨水；甲基红试剂。培养2 7d，加入 几滴甲基红试剂，变红者为阳性，不变的为阴性。 几滴甲基红试剂，变红者为阳性，不变的为阴性。 • V-P试验：培养基：蛋白胨水； V-P试剂甲和试剂乙。培养 试验： 试剂甲和试剂乙。培养 2-7d，按每毫升培养基加入0.5ml6%a-萘酚酒精，再加入 7d，按每毫升培养基加入0.5ml6%a-萘酚酒精，再加入 0.2ml40%KOH，混合均匀，静置观察2 4h。5min内变粉红色 0.2ml40%KOH，混合均匀，静置观察2-4h。5min内变粉红色 者为强阳性，数小时内变粉红色者为阳性，隔夜后仍不变色 为阴性。
如有多个样品同时需要制成抹片，只要染色方法相同，亦 可在同一张玻片上有秩序地排好，做多点涂抹，或者先用 蜡笔在玻片上划分成若干小方格，每方格涂抹一种样品。
（2）染色：染色步骤为： 染色：染色步骤为：
• 在已干燥、固wenku.baidu.com好的抹片上，滴加草酸铵结晶紫溶液，经1— 在已干燥、固定好的抹片上，滴加草酸铵结晶紫溶液，经1 2min，水洗。 2min，水洗。 • 加革兰氏碘溶液于抹片上媒染，作用1—3min，水洗。 革兰氏碘溶液于抹片上媒染，作用1 3min，水洗。 • 加95％酒精于抹片上脱色，约0．5～1min，水洗。 95％酒精于抹片上脱色，约0 1min，水洗。 • 加稀释的石炭酸复红(或沙黄水溶液)复染10～30s，水洗。 加稀释的石炭酸复红(或沙黄水溶液)复染10～30s，水洗。 • 吸干或自然干燥。
一、病理剖检 一、病理剖检
• 记录病理变化
二、细菌分离培养和抹片、染色、镜检 二、细菌分离培养和抹片、染色、镜检
• 1、细菌分离培养 • （1）用火焰灼烧手术刀片，烫肝脏（心脏、脾脏等 器官）表面，并迅速划小口 • （2）用无菌接种环钩取组织，划线于普通琼脂、麦 康凯琼脂，在37℃温箱培养24h观察。 康凯琼脂，在37℃温箱培养24h观察。
2、抹片、染色、镜检
• （1）抹片：用镊子夹取病变组织肝、脾等，然后以 抹片：用镊子夹取病变组织肝、脾等，然后以 灭菌剪刀剪取小块，将其新鲜切面在玻片上压印或抹 灭菌剪刀剪取小块，将其新鲜切面在玻片上压印或抹 涂成薄层，自然干燥。将干燥好的抹片，涂抹面向上， 涂成薄层，自然干燥。将干燥好的抹片，涂抹面向上， 以其背面在酒精火焰上来回通过几次，略做加热固定。
（3）镜检： 镜检：
三、培养物鉴定
1、涂片、染色、镜检 • 先用灭菌接种环取少量生理盐水或蒸馏水，置于玻片 中央，然后再用灭菌接种环取少量材料，在液滴中混 合；均匀涂布成适当大小的薄层，干燥、固定。染色， 镜检。
大肠杆菌革兰氏染色
2、纯化培养、鉴别培养
• 从单个菌落调取部分培养物，划线接种于麦康凯培养基， 从单个菌落调取部分培养物，划线接种于麦康凯培养基， 置37℃培养箱培养24h观察。 37℃培养箱培养24h观察。