乳酸菌菌种的培养筛选方法
乳酸菌的筛选
乳酸菌的筛选（初筛）一、实验目的对采集的仔猪粪便进行梯度稀释和平板涂布，对猪粪中的肠源菌进行初步的筛选。
二、实验材料PBS、2mL离心管、MRS肉汤、琼脂、冰袋、保温盒、封口膜、200μL 枪头等。
三、实验步骤1、实验前准备：用MRS肉汤配置MRS固体培养基（内含有1.5%琼脂，1%CaCO3），121℃灭菌15min后倒平板，备后面涂布使用，2mL 离心管中加入1mLPBS备后面实验使用。
2、采样：使用已灭菌的200μL枪头挑取仔猪猪粪适量，放入事先准备好的2mL加有PBS的离心管中，取样标准为每窝仔猪取5个样品，采完样品后，用封口膜将离心管口封住，并放入准备好的装有冰袋的保温盒中保存。
3、涂布：将采好的样品用螺旋振荡器混匀，取100μL样品混匀液，加入900mL的离心管中进行梯度稀释，取10-4、10-5梯度菌液进行平板涂布。
4、培养：将涂布好的平板依次标好时间、稀释浓度和样品编号后，置于厌氧培养箱中37℃培养24h。
5、培养完成后，对所涂布的平板进行拍照留底。
乳酸菌的筛选一、实验目的利用平板划线的原理，对涂布出的单菌落进行划线纯化。
二、实验原理平板划线法是指把杂菌样品通过在平板表面划线稀释而获得单菌落的方法。
一般是将混杂在一起的不同种微生物或同种微生物群体中的不同细胞，通过在分区的平板表面上作多次划线稀释，形成较多的独立分布的单个细胞，经培养而繁殖成相互独立的多个单菌落。
通常认为这种单菌落就是某微生物的“纯种”。
实际上同种微生物数个细胞在一起通过繁殖也可形成一个单菌落，故在科学研究中，特别是在菌种鉴定等工作中，必须对实验菌种的单菌落进行多次划线分离，才可获得可靠的纯种。
四、实验步骤1、MRS培养基的配置：用MRS肉汤按每升48g计算配置，向其中加入1.5%的比例加入琼脂，按1%的比例加入CaCO3后，121℃灭菌15min。
2、倒平板：培养皿灭菌，烘干后，取灭菌的MRS固体培养基倒平板（每个平板倒10mL左右），放入4℃冰箱备用。
产胞外多糖的乳酸菌的简便筛选与鉴定
取１ｍＬ稀释样品，分别浇注于ＭＲＳ培养基、Ｅｌｌｉｋｅｒ培养基和Ｍ１７培养基，在适宜条件下培养，用于样品中乳酸菌的分离［１１．２．２分离菌株的分离和保存将１．２．１得到的菌落在相应的平板培养基上划线纯化得到纯培养物，进行革兰氏染色，接触酶实验。
纯化菌株在ＭＲＳ斜面上４℃短期保存，置于３０％（Ｗ／Ｗ）无菌甘油中在一７０℃超低温冰箱中长期保存‘１１．２．３利用茵落拉丝法初步筛选产胞外多糖的乳酸菌将分离纯化菌株在ＭＲｓ筛选培养基上进行划线分离，在２５℃厌氧培养４８ｈ，观察并记录菌落特征。
用无菌牙签接触菌落，轻轻地向外拉，然后在２ｓ内垂直离开以在培养基表面形成连续的拉丝，重复操作５—６个菌落，每个菌落平行做２次，测量菌落拉丝的最大长度（伽ｎ），结果以“平均值士标准方差”表示。
１．２．４乳酸茵胞外多糖的提取将１．２．３得到的菌株接种于筛选ＭＲＳ液体培养基中，３０℃发酵２４ｈ，取１０ｍＬ培养物，沸水浴１０ｍｉｎ，冷却至室温，加质量分数为８０％的三氯乙酸至终浓度为４％，４℃静置过夜，１２ｏｏｏｇ离心２０ｍｉｎ，轻倾上清液于透析袋中，对流水透析２４ｈ，再对双蒸水透析３６ｈ，４次换水，定容，待用。
１．２．５硫酸－苯酚法测定乳酸茵胞外多糖（ＥＰＳ）的含量将１．２．４得到的胞外多糖样品用Ｄｕｂｏｉｓ推荐的硫酸一苯酚法［１５］测定，用葡萄糖做标准曲线（如图１），从曲线上求得ＥＰＳ的含量。
以空白培养基为对照，扣除背景干扰。
’１．２。
６·显微镜观察产胞外多糖乳酸茵细茵形态对分离菌株进行革兰氏染色，用ＭｏｔｉｃＰＭＢ５—２２３２—５摄影显微镜观察细胞形态。
１．２．７产胞外多糖乳酸茵的鉴定产胞外多糖乳酸菌的鉴定采用法国梅里埃公司鲁奎、蠢棺益图１硫酸一苯酚法测定胞外多糖含量的标准曲线的ＡＰＩ细菌鉴定系统进行，将纯菌株在ＭＲＳ琼脂培养基上３７℃微厌氧培养４８ｈ，用无菌棉拭子收集细菌，在ＡＰＩ５０ＣＨ试剂条凹槽中加ＡＰＩ５０ＣＨＬ培养基并接种，用石蜡油封好，３７℃培养２４～２８ｈ，记录菌株对碳水化合物的发酵结果，将其输入梅里埃公司的鉴定软件ＡＰＩＬＡＢＰｌｕｓ进行鉴定。
乳酸菌菌种的分离筛选办法
乳酸菌菌种的分离筛选方法乳酸细菌是一类能利用发酵糖产生大量乳酸的细菌通称;为兼性厌氧菌,杆状或球状,革兰氏阳性菌,无芽孢,不运动;营养要求高,需要提供丰富的肽类氨基酸维生素;在琼脂表面或内层形成较小的白色或淡黄色的菌落;通常用作为有益微生物的菌种有乳酸乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、粪肠球菌、乳酸片球菌、双歧杆菌、屎肠球菌、戊糖片球菌等;乳杆菌常用MRS琼脂作半选择培养基;当乳杆菌仅是复杂区系中的部分菌类时,SL培养基常用作为选择性培养基;对于芽孢乳杆菌常用GYP培养基,链球菌有TYC培养基、MS 培养基;M17培养基被用作乳球菌的分离培养基;嗜酸乳杆菌属于乳杆菌属的一个种;其特性为：杆菌,两端圆,不运动,无鞭毛;粪肠球菌为革兰氏阳性,圆形或椭圆形;乳酸片球菌细胞呈球状,直径0.6~1.0μm,在直角两个平面交替形成四联状,一般细胞成对生,单生者罕见,不成链状排列;革兰氏阳性,不运动,兼性厌氧;在MRS培养基上菌落小,呈白色;沿洋菜穿刺线的生长物呈丝状;乳酸菌在一般琼脂培养基上形成微小菌落,不易观察,所以分离时先富集培养并选择合适的培养基;分离培养基一般添加西红柿、酵母膏、吐温-80等物质,也常常加入醋酸盐,因醋酸盐能抑制部分细菌生长,对乳酸菌无害;培养基中添加碳酸钙,乳酸溶解培养基中的碳酸钙形成透明圈,作为分离鉴别的依据,通过对生成的乳酸量进行性能鉴定;乳酸菌生长繁殖时需要多种氨基酸,维生素及微氧,一般菌落比较小;分离培养基一般可添加西红柿酵母膏油酸吐温等物质,均具有促进生长作用;也常常添加醋酸盐抑制有些细菌的生长,对乳酸菌无害;一.筛选方法：1.溶钙圈法：利用一些产酸类细菌在含CaCO3的培养基上产生CaCO3溶解圈,从而筛选出这些产酸类细菌,可用于乳酸菌的筛选;其中培养基中加入CaCO3的作用是：①鉴别能产生酸的细菌；②中和产生的酸,以维持培养基的PH;筛选过程：样品预处理→梯度稀释至10-6→选择合适的稀释度涂布→37℃培养48h→挑选产生溶钙圈的菌落反复在MRS培养基上划线→挑起单菌落染色,经镜检确认为纯种→挑选革兰氏阳性单菌落→试管穿刺4℃冰箱保存;2.溴甲酚绿指示剂法：培养基：MRS培养基含溴甲酚绿酒精溶液筛选过程：同上,不同之处是稀释涂布后长出菌落,挑取使溴甲酚绿变色的菌落;二.菌种的分离筛选1.培养基：★1.1麦芽汁碳酸钙培养基：麦芽汁10BX1L预先灭菌碳酸钙5-10g/LPH自然分离用★★1.2牛肉膏10g/L蛋白胨10g/L酵母膏10g/L番茄汁200g/L葡萄糖10g/L吐温0.05%CaCO315-20g/L溴甲酚绿0.01%PH6.0-6.5分离用★1.3番茄汁碳酸钙培养基：酵母膏7.5g/L葡萄糖10g/L番茄汁100mL蛋白胨7.5g/LKH2PO42.0 g/L吐温0.5mLPH6.0-6.5分离用1.4葡萄糖20g/L酵母膏10g/LPH6.0-6.51.5蛋白胨8-10g/L酵母膏3-5g/L葡萄糖13-15g/LKH2PO41.5-2.0g/LMgSO40.3-0.5g/LMnSO40.2-0.25g/LNaAC3.0-5.0g/LPH5.5-6.51.6蛋白胨0.8-1.0g/L糖蜜3.0-5.0g/L酵母膏3-5g/L玉米浆0.5-1.0g/LKH2PO40.1-0.3g/LMgSO40.3-0.5g/LNaC13-5g/L葡萄糖8-10g/LPH5.5-6.5发酵或种子培养基★★1.7MRS培养基分离培养计数用蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、酵母膏5.0g、柠檬酸氢二铵2.0g、葡萄糖20.0g、吐温801.0mL、乙酸钠5.0g、磷酸氢二钾2.0g、硫酸镁0.58g、硫酸锰0.25g、琼脂18.0g、蒸馏水1L,pH6.5;分离培养基,当MRS培养基冷却至45～50℃时,加入已灭菌的碳酸钙,充分混匀,倒平板;1.8BCP培养基溴甲酚紫培养基乳糖5.0g蛋白胨5.0g酵母膏3.0g0.5℅溴甲酚紫10ml自来水1000ml pH6.5-7.0分离用1.9BCG牛乳营养琼脂：脱脂奶粉10g,溶于50ml水中,加入1.6℅溴甲酚绿酒精溶液0.07ml,0.075Mpa20min;另取琼脂2.0g,溶于50ml水中,加酵母膏1.0g溶解后调pH6.5-6.8,0.1Mpa20min.趁热在无菌操作下两者混合均匀,倒平板,37℃培养24h,检查是否有杂菌;2.分离筛选：2.1富集培养：取1.0g1.0ml于无菌细口瓶中,加入无菌麦芽汁液体培养液于瓶口处,密闭,25-32℃培养48h;若培养基表内出现绢丝波纹物,镜检杆状,革兰氏阳性,初步定为乳酸菌;以同样方法转接2-3次,接种量3-5℅.2.2菌种分离纯化：溶钙圈法：富集菌液或样品适当稀释至10-7,混菌法分离,先加入10-12ml MRS培养基或麦芽汁培养基,凝固后再注入4-5ml水琼脂培养基,制成厌氧环境,30℃或37℃培养2-3天温度低时间稍长,可出现针头状或圆形稍扁菌落,周围形成透明圈;挑取透明圈大,培养基变黄的菌落,反复划线纯化2-3次,所得单菌落编号,经镜检后,疑似乳酸菌落接种于MRS培养基培养后保存备用;或接入液体培养基中,25-32℃培养24-48h,然后穿刺于MRS培养基或麦芽汁碳酸钙半固体培养基中,25-32℃培养48h 保存备用;2.3性能测定：乳酸菌定性试验：不同条件下的产酸速率试验：将分离菌种接种于MRS液体培养基中25℃37℃温度下培养测不同菌株不同温度的pH;方法1.吸取发酵液10ml,注入空试管中,加入10℅硫酸1.0ml,在加入2.0℅高锰酸钾约1.0ml,此时乳酸转化成乙醛;取滤纸一条,在含氨的硝酸银溶液中浸湿,横搭在试管口上,将试管徐徐加热至沸腾,使乙醛挥发,若管口滤纸变黑,证明有乳酸生成;方法2.纸层析法：展开剂为正丁醇：甲醇：水=80：15：5,毛细血管吸取发酵液,多次点样于新华滤纸上,1.5℅标准乳酸为对照,平衡2小时后进行层析,3℅溴甲酚蓝显色计算Rf值;产酸量测定：5.0ml发酵液于150ml三角瓶中,加中性蒸馏水10-20ml,酚酞指示剂2滴,用0.1mol/l 氢氧化钠滴定至微红色;醋酸量g/100mL=氢氧化钠摩尔浓度.Vx90.08x10-3/样品毫升数x100同时,进行单因素试验,分别考察醋酸速度,耐高温,耐酒精度,耐低酸度等主要生产性能,选择优势菌株;3.菌株鉴定：3.1菌落形态：3.2菌体形态：革兰氏染色观察染色镜检：杆状阳性;3.3乳酸菌运动性检测：半固体穿刺法3.4生理生化：乳酸菌产酸能力曲线：将筛选的乳酸菌接种于MRS液体培养基中,25-32℃培养48h,间隔4-6h测定发酵液pH;食盐对乳酸菌的影响：在MRS液体培养基中,添加0.0℅2.0℅4.0℅6.0℅氯化钠,菌种分别接种于培养基中,32℃培养48h,测定OD值;溴甲酚绿指示剂法：原理：溴甲酚绿指示剂在酸性环境中呈黄色,碱性环境呈蓝色,分离培养基配制后PH为6.8,加入溴甲酚绿指示剂呈蓝绿色,产酸后菌落周围变成黄色,较容易鉴别;培养基：BCG牛乳营养琼脂初筛：将样品富集液梯度稀释,适温培养,平板上出现扁平的黄色菌落及周围培养基也为黄色初定为乳酸菌;复筛：将典型菌落转接脱脂乳发酵管,若凝固,无气泡,呈酸性,镜检细胞杆状或链球状,革兰氏染色阳性,连续传代若干次培养,挑选出3-4h能凝固的乳管保存备用;注：1.乳酸菌筛选常在几种培养基同时进行：分别在麦芽汁碳酸钙培养基,番茄汁碳酸钙培养基,BCP培养基溴甲酚紫培养基同时进行混菌划线或涂布培养放厌氧袋,分别25℃37℃培养48h;菌落观察：平板表面形成浅色黄色或白色小菌落;麦芽汁碳酸钙培养基表面,菌落周围形成透明圈,BCP培养基溴甲酚紫培养基周围使紫色的培养基形成黄色包围圈;触酶反应：厌氧菌一般无触酶过氧化氢酶,用滴管滴加3.0℅过氧化氢于菌落上,若无气泡产生,证明该菌为触酶阴性;将各种特征菌落分别接入斜面,培养后保存,进一步生理生化试验,以鉴定分别何种乳酸菌;2.菌落鉴定：半固体或双平板琼脂利于乳酸菌的生长,菌落出现早;2.1菌落形态观察：乳白色边缘不整齐,稍呈半球状凸起,实心菌落;个体形态：半透明细杆状链状排列,大量时呈发丝状堆积;初步认为乳杆菌;2.2生化鉴定：在吲哚试验中,加入菌种试管无任何变化,为阴性反应;说明该菌不具有分解色氨酸产生吲哚的能力;明胶液化淀粉水解氢氧化钾试验均为阴性,说明此菌为乳酸菌;过氧化氢酶还原硝酸盐糖发酵试验：发酵果糖半乳糖葡萄糖乳糖产酸为阳性反应,其余麦芽糖蔗糖棉子糖鼠李糖产酸为阴性反应;根据手册第九版判断此种乳酸菌为德氏乳杆菌保加利亚亚种;纤维二糖甘露醇山梨醇七叶苷水杨苷2.3乳酸菌生长曲线pH-t测定结果：三.几种乳酸菌筛选举例1.嗜热链球菌：样品来源：市售酸奶培养基：M17改良培养基,培养温度：42℃,需氧情况：兼性厌氧,筛选方法：常规的稀释涂布和划线分离2.保加利亚乳杆菌：样品来源：市售酸奶,培养基：牛肉浸膏1.5％,酵母浸膏0.5％,葡萄糖3.0％,柠檬酸三铵0.2％,七水硫酸镁0.02％,琼脂1.5％,pH5.1;培养温度：42℃,需氧情况：兼性厌氧,筛选方法：常规的稀释涂布和划线分离法;3.双歧杆菌：样品来源：婴儿新鲜粪便,培养基：MRS培养基、NPNL培养基、TYP培养基、PTYG培养基,培养温度：37℃,需氧情况：严格厌氧,筛选方法：常规的稀释涂布和划线分离法;。
高产胞外多糖能力的乳酸菌筛选及其培养条件的优化
第３４卷第３期２０２０年５月兰州文理学院学报(自然科学版)J o u r n a l o fL a n z h o uU n i v e r s i t y ofA r t s a n dS c i e n c e (N a t u r a l S c i e n c e s )V o l ．３４N o ．３M a y ２０２０收稿日期:２０２０Ｇ０３Ｇ１９基金项目:宿州学院科研平台开放课题(２０１９yk f ２９)作者简介:孔德卉(１９９３Ｇ),女,安徽宿州人,助理实验师,研究方向:食品生物技术．E Ｇm a i l :s z x y y pl ＠１６３．c o m．㊀㊀文章编号:２０９５Ｇ６９９１(２０２０)０３Ｇ００５３Ｇ０７高产胞外多糖能力的乳酸菌筛选及其培养条件的优化孔德卉,蒋家璇(宿州学院生物与食品工程学院,安徽宿州２３４０００)摘要:以本实验室保藏的４３株乳酸菌为筛选源,测定它们的产胞外多糖的能力,得到植物乳杆菌２Ｇ２产胞外多糖能力最强,产量为１０１２．６μg /m L ,以此菌为供试菌,采用响应面法优化其产胞外多糖的条件．通过单因素试验,考察菌种接种量㊁培养温度㊁不同碳源及浓度对胞外多糖产量的影响,在此基础上,采用响应面法进一步优化该菌产胞外多糖的条件．结果表明,影响植物乳杆菌２Ｇ２的胞外多糖产量的因素主次顺序为乳糖浓度＞菌种接种量＞培养温度,最佳优化条件为乳糖４５g /L ㊁接种量为３．５％㊁培养温度为３９ħ,在此条件下胞外多糖的产量为１４９８．９１μg /m L ,是优化前的１．４８倍．关键词:乳酸菌;胞外多糖;响应面法中图分类号:T S ２０１．３㊀㊀㊀文献标志码:A0㊀引言乳酸菌(l a c t i ca c i db a c t e r i a ,L A B )作为一种重要的益生菌,可以净化肠内环境,调节人体胃肠道健康及微生态环境平衡[１Ｇ２],并可抑制致病菌的生长,对乳糖不耐症㊁消化不良及过敏刺激反应等均有一定的治疗功效[３Ｇ４]．此外,在一定程度上可以激活机体体液免疫机制,降低肿瘤的发生率[５]．近几年随着对乳酸菌的深入研究,其在农业㊁食品㊁生物㊁医学等领域的应用价值更益突显．乳酸菌胞外多糖(E x o p o l ys a c c h a r i d e ,E P S )是乳酸菌在生长代谢过程中发酵产生并分泌到细胞壁外的次级代谢物的总称[６],一般为黏液或荚膜多糖等水溶性多糖,是一种天然高分子聚合物[７]．作为一种安全的功能性产物,乳酸菌胞外多糖因其双重理化功能,越来越广泛地被应用于食品工业及医疗领域中[８]．在生理功能上,胞外多糖具有良好的抗肿瘤㊁保护机体组织细胞㊁增强免疫抵抗力和降低胆固醇等活性[９]．在物化特性上,作为一种新型天然食品添加剂,E P S 对于酸乳及豆制品的流变性㊁乳化性㊁黏着性都有显著影响,极大地提高了其质构㊁凝胶和流变性能,缓解了乳清分离㊁结构脆弱等问题,使其变得更加细腻,鲜嫩爽滑,从而大大增加酸乳及豆制品的口感,提高风味,乳酸菌E P S 有广阔的工业应用价值[１０Ｇ１１]．目前用于发酵生产酸乳的大部分菌株稳定性差,产糖能力弱,E P S 在工业生产中规模性应用受到极大限制．因此乳酸菌E P S 产量的提高是目前急需解决的难题．要想解决这一难题,就必须筛选高产菌株并就其培养条件进行优化．本研究以实验室菌种库保藏的４３株乳酸菌为筛选源,测定它们的产胞外多糖的能力,获取产胞外多糖能力最强的目标菌株,再通过单因素试验设计㊁B o x ＧB e h n k e n 试验设计,以胞外多糖含量作为响应值,对影响因素进行优化分析,以求得培养条件的最优组合．1㊀材料与方法1.1㊀材料与试剂乳酸菌来源:本实验室菌种库保藏的４３株乳酸菌．M R S 培养基,胞外多糖筛选培养基．主要试剂:三氯乙酸㊁硫酸㊁乙酸乙酯㊁蒽酮等,均为国产分析纯试剂,购买于国药集团．1.2㊀仪器与设备S H P Ｇ２５０型生化培养箱(上海三发科学仪器有限公司);１Ｇ１５P K 离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司);B B S ＧS D C ＧA 超净工作台(博科生物公司);７２２型可见光分光光度计(上海仪电分析仪器有限公司)．1.3㊀实验方法１．３．１㊀葡萄糖标准曲线的绘制㊀精密移取葡萄糖标准液０．０m L㊁２．０m L㊁４．０m L㊁６．０m L㊁８．０m L㊁１０．０m L于试管中,加蒸馏水稀释１００倍,并从中取１．０m L稀释液于２５m L的具塞试管中,再各加６％苯酚溶液１．５m L振荡摇匀,沿着玻璃棒缓慢加入５m L浓硫酸,摇匀,静置１０m i n．再放于水浴锅沸水加热２０m i n,拿出冷却放置至室温,在４９０n m处,对照测定标准液的吸光度[１２]．葡萄糖的标准曲线如图１所示．图１㊀葡萄糖的标准曲线１．３．２㊀胞外多糖的提取㊀将供试乳酸菌活化后接种到胞外多糖M R S液体筛选培养基中,３０ħ静置培养４８h,取１０m L培养液于试管中,并加入２m L８０％的三氯乙酸,置冰浴中搅拌振荡３０m i n后于４ħ㊁６０００g下离心３０m i n,吸取上清液于灭菌过的５０m L的离心管中,再加入３倍体积的冰冻无水乙醇,放置在４ħ冰箱中冷藏．第２天取出,最终可以观测到多糖呈乳白色絮状沉淀析出,再于４ħ㊁６０００g下离心３０m i n,用１０m L 蒸馏水溶解沉淀,可得胞外多糖提取液[１３]．１．３．３㊀胞外多糖的测定㊀用移液枪吸取１m L 胞外多糖粗提取液于试管中．稀释到合适倍数,吸取１m L稀释液于２０m L的具塞试管中．另取１m L蒸馏水作为试剂空白参比,然后分别添加０．５m L的蒽酮试剂．随后沿璃棒缓缓加入５m L浓硫酸,盖上塞子后,充分摇匀,再沸水浴１０m i n,冷却至室温后,在波长６２０n m下测定提取液O D 值,并根据葡萄糖标准曲线回归方程计算胞外多糖的含量．１．３．４㊀培养条件的优化(１)接种量对菌株产E P S的影响将筛选的菌株活化后,调节M R S液体培养基初始p H为６．２,然后以２％㊁３％㊁４％㊁５％㊁６％５个水平的接种量分别接种到培养基中,３７ħ恒温培养４８h,测定培养液中E P S含量．不同的接种量重复３次实验,取其平均值．(２)不同碳源对菌株产E P S的影响改变M R S培养基中的碳源,将碳源分别更改为葡萄糖㊁乳糖㊁蔗糖㊁果糖和麦芽糖,并调节培养基初始p H至６．２,以３％接种量接至改良的M R S培养基中,３７ħ下恒温培养４８h,测定培养液中E P S含量．每个水平重复３次实验,取其平均值．(３)碳源浓度对菌株产E P S的影响改变M R S培养基中的乳糖浓度,将浓度分别设定为１０㊁２０㊁３０㊁４０㊁５０g/L,并调节培养基初始p H至６．２,以３％接种量接至改良的MR S培养基中,３７ħ下恒温培养４８h,测定培养液中E P S含量．每个水平重复３次实验,取其平均值．(４)发酵温度对菌株产E P S的影响将MR S培养基的碳源更换为乳糖,浓度设置为４０g/L,并调节初始p H至６．２,活化菌株后以３％接种量接至改良过的M R S液体培养基中,分别置于２３㊁３０㊁３７㊁４４㊁５１ħ的培养箱中,恒温培养４８h,测定培养液中E P S含量．每个培养温度重复３次实验,取其平均值[１４Ｇ１５]．2㊀结果与讨论2.1㊀高产胞外多糖菌株的筛选以实验室保藏的４３株乳酸菌为筛选源,测定其产胞外多糖的能力,结果如表２所列．由表２易知,在４３株乳酸菌中,菌株２Ｇ２产E P S的能力最强,胞外多糖产量高达１０１２．６μg/ m L,该菌株经鉴定为植物乳杆菌,故以此菌为供试菌,优化其产胞外多糖的条件．2.2㊀乳酸菌产EPS培养条件的优化２．２．１㊀接种量对产E P S结果影响㊀为探究不同接种量对乳酸菌株产E P S能力的影响,本次试验设定２％㊁３％㊁４％㊁５％㊁６％不同水平的５个接种量,利用蒽酮Ｇ硫酸法测定活化后植物乳杆菌２Ｇ２产多糖溶液的吸光度值,并代入葡萄糖标准曲线回归方程中计算E P S的产量,所得结果如图２所示．由图２可知,接种量在２％~３％时,植物乳杆菌２Ｇ２产E P S的能力呈上升趋势,这是因为当接种量适当增加时,植物乳杆菌２Ｇ２生长增殖周４５㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀兰州文理学院学报(自然科学版)㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第３４卷表２㊀乳酸菌株产E P S 的能力菌株来源O D 值胞外多糖含量/(μg /m L )菌株来源O D 值胞外多糖含量/(μg /m L )植伊利牛奶０．２１０６１８．５３５Ｇ２腌空心菜０．１８２５３６．１８A Ｇ１酸菜０．１７８５２４．４２５Ｇ３腌空心菜０．２６１７６８．５３B 腌泡椒０．１３４３９５．００５Ｇ４腌空心菜０．１５７４６２．６５C 酱瓜０．３１８９３６．１８６君乐宝纯享０．２２３６５６．７６D酸辣白菜０．１６４４８３．２４６Ｇ２萝卜１０．２２４６５９．７D Ｇ１酸辣白菜０．１９６５７７．３５６Ｇ３萝卜１０．２９６８７１．４７J Ｇ１黄豆０．１９０５５９．７０６Ｇ４萝卜１０．１７８５２３．５３Q ３蒜头汁０．１４６４３０．２９７Ｇ１萝卜２０．２２４６５９．７１Q ４蒜头汁０．１９５５７４．４１７Ｇ２萝卜２０．１４９４３９．１２P T Ｇ１酸菜汁０．１７６５１８．５３８白伊利牛奶０．１６６４８９．１２P T Ｇ２酸菜汁０．１６４４８３．２４９蓝君乐宝０．１７７５２１．４７１Ｇ１豆腐乳０．２６３７７４．４２１０Ｇ１泡菜０．２１５６３３．２４２蓝蒙牛优益C ０．１６６４８９．１２１１Ｇ２泡菜０．１４８４３６．１８２Ｇ１腌豆角０．１６３４８０．２９１１Ｇ３泡菜０．１４８４３６．１８２Ｇ２腌豆角０．３４４１０１２．６１２Ｇ１泡菜０．１７０５００．８８３蒙牛优益C ０．２７８８１８．５３１２Ｇ４泡菜０．１４２４１８．５３３Ｇ１腌雪菜０．１２９３８０．２９１３Ｇ２泡菜０．１９０５５９．７１３Ｇ３腌雪菜０．２１６６３６．１８１４Ｇ１泡菜０．１７３５０９．７１４黄养乐多０．２４８７３０．２９１４Ｇ２泡菜０．１８７５５０．８８４Ｇ４腌辣椒０．１８８５５３．８２１５Ｇ２菌粉０．１７３５０９．７１５蒙牛冠益乳０．２３１６８０．２９１７Ｇ１菌粉０．２２６６６５．５９５Ｇ１腌空心菜０．１７８５２４．４１图２㊀不同接种量下的E P S 产量期相应缩短,菌液浓度增大,从而使发酵液中的E P S 产量提高,当接种量为３％时,其产胞外多糖的含量最多,高达４２７μg /m L ;当接种量位于３％~６％时,植物乳杆菌２Ｇ２产E P S 的能力呈下降趋势,这是因为当接种量持续增加时,过高的菌液浓度会争夺培养基中的营养物质,尤其在增殖培养后期会有一部分菌体因培养基中养分不足而不断死亡,从而影响菌株产胞外多糖的能力;当接种量为６％时,其产胞外多糖的含量最少,为２２２．５μg /m L ．因此,植物乳杆菌２Ｇ２产胞外多糖的最佳接种量为３％．２．２．２㊀不同碳源对产E P S 结果影响㊀碳源是微生物培养基必须成分,培养基中碳源的不同会导致乳酸菌产胞外多糖量的差异[１６Ｇ１７]．目前微生物可利用的碳源主要为木糖㊁葡萄糖㊁半乳糖㊁果糖㊁麦芽糖㊁乳糖㊁蔗糖等,本次优化碳源试验中,将碳源设置为葡萄糖㊁乳糖㊁蔗糖㊁果糖和麦芽糖,分别探究其对植物乳杆菌２Ｇ２产E P S 的影响．利用蒽酮Ｇ硫酸法测定活化后的植物乳杆菌２Ｇ２产多糖溶液的吸光度值,并代入葡萄糖标准曲线回归方程中计算E P S 的产量,所得结果如图３所示．由图３易知,当碳源为乳糖时,菌株２Ｇ２产E P S 的能力最大,产量为５８１．３２μg/m L ,显著高于其他碳源产E P S 浓度．然而对于从多宝鱼肠道分离的菌株L a c t o b a c i l l u s pl a n t a r u m Ｇ１２[１５],当碳源为蔗糖时胞外多糖合成量最高;对于菌株L ．k e f i r a n o f a c i e n s [１６],当乳糖为碳源时,其产胞外多糖的能力最好;而对于植物乳杆菌YM Ｇ２[１７],当碳５５第３期孔德卉等:高产胞外多糖能力的乳酸菌筛选及其培养条件的优化图３㊀不同碳源下的E P S产量源为葡萄糖时,菌株代谢产E P S的量最多．从这些文献可以看出,不同的菌株,其最佳碳源也会不同,碳源的利用具有菌株差异性．根据本次实验研究,获知植物乳杆菌２Ｇ２产E P S的最优碳源为乳糖．２．２．３㊀不同乳糖浓度对产E P S结果影响㊀为探究不同乳糖浓度对植物乳杆菌２Ｇ２产E P S能力的影响,本次试验设定１０㊁２０㊁３０㊁４０㊁５０g/L５个不同水平的浓度,利用蒽酮Ｇ硫酸法测定活化后的植物乳杆菌２Ｇ２产多糖溶液的吸光度值,并代入葡萄糖标准曲线回归方程中计算E P S的产量,所得结果如图４所示．图４㊀不同乳糖浓度下的E P S产量由图４可知,乳糖浓度在１０~４０g/L时,植物乳杆菌２Ｇ２产E P S的能力逐级增强,当浓度为４０g/L时,菌株产胞外多糖的量最多,高达７２６．４μg/m L．这是因为随着乳糖浓度的提高,培养基中充分的营养物质为植物乳杆菌２Ｇ２的增殖培养提供优良环境,提高了其新陈代谢速度,从而使菌株２Ｇ２发酵液中的胞外多糖产量逐渐增加;但乳糖浓度在４０~５０g/L时,植物乳杆菌２Ｇ２产E P S 的能力急剧降低,当浓度为５０g/L时,菌株产胞外多糖的量最少,为４９３．０９μg/m L．这是因为培养基中营养物质(乳糖)浓度过高,会使培养基的渗透压太高,导致细胞脱水,抑制植物乳杆菌２Ｇ２的生长,从而影响其产E P S的能力．因此根据本次试验研究,可以获知植物乳杆菌２Ｇ２产E P S的最适乳糖浓度为４０g/L．２．２．４㊀不同温度对产E P S结果影响㊀为探究不同的发酵温度对菌株产E P S含量的影响,本实验利用蒽酮Ｇ硫酸法测定活化后的植物乳杆菌２Ｇ２产多糖溶液的吸光度值,并代入葡萄糖标准曲线回归方程中计算E P S的产量,结果如图５所示．图５㊀不同温度下的E P S产量由图５可得,随着培养温度的不断上升,植物乳杆菌２Ｇ２产E P S的能力呈先上升后降低趋势,当培养温度为３７ħ时,植物乳杆菌２Ｇ２产E P S 的能力最强,合成量为７３１．２８μg/m L;５１ħ时E P S含量最低,为４８９．７２μg/m L．这是因为温度与微生物生长代谢之间密切相关,当处于适宜温度下,乳酸菌生长迅速,发酵性能强,从而产E P S 的能力也会相应提高;当超出适宜温度范围时,乳酸菌增殖代谢速率降低,发酵性能降低,甚至会有个别细菌因过高的温度而失活,从而影响菌株产E P S的能力．因此根据本次试验研究,可以获知植物乳杆菌２Ｇ２产E P S的最适温度为３７ħ．2.3㊀响应面实验分析２．３．１㊀回归方程的参数分析㊀本次试验以接种量㊁乳糖浓度㊁温度３个培养因素进行优化分析,根据上述单因素试验结果,可知当接种量为３％㊁碳源为乳糖㊁浓度为４０g/L㊁温度为３７ħ时植物乳杆菌２Ｇ２产胞外多糖的含量最多．因此将这些条件作为基础条件来采用B o xＧB e h n k e n法进行进一步的优化,其优化方法可见表３．选择好各试验因素的含量之后,按照表３进行实验,再利用软件D e s i n gＧE x p e r８．０．６设计出组合试验,数据可见表４．再根据R S A软件对数据进行分析,分析结果如表５．在响应面优化设计中,F值反映的是不同变量与响应值之间的拟合程度,F值越高,表明模型６５㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀兰州文理学院学报(自然科学版)㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第３４卷表３㊀B o xＧB e h n k e n法因素选择与含量水平接种量/％浓度/(g/L)温度/ħ－１２．５０３５．００３５．０００３．００４０．００３７．００＋１３．５０４５．００３９．００的显著性好;而P值反映的是不同变量对响应值的影响程度,P值越小,表明该因素对响应值的影响程度更大．由表５可知,F模型＝３０．１１,P＜０ ００１时,模型为显著;失拟项F＝２．４１,P＝０ １５２０＞０．０５时,不显著,因此模型建立有效．此外,从表５分析结果还获知在接种量㊁乳糖浓度㊁培养温度３个培养条件中,乳糖浓度的F模型最大,P值最小,模型显著,对植物乳杆菌２Ｇ２产E P S能力的影响程度最大;相反,菌株接种量的F模型最小,P值最大,模型不显著,对植物乳杆菌２Ｇ２产E P S能力的影响程度最小．因此各因子对植物乳杆菌２Ｇ２产E P S能力的影响顺序为:乳糖浓度＞接种量＞培养温度[１８]．２．３．２㊀响应曲面实验分析㊀接种量与浓度交互对E P S产量的影响如图６,植物乳杆菌２Ｇ２产E P S的能力随接种量和乳糖浓度的增加呈先上升后降低趋势．其中,相对于接种量,乳糖浓度的响应曲面坡度更加陡峭,变化更加显著,因此乳糖浓度对植物乳杆菌２Ｇ２产E P S能力的影响更为显著．并且由表５方差分析结果可知,接种量与浓度的交互作用对E P S产量的影响不显著．表４㊀中心组合实验的设计和结果实验号A接种量/％B乳糖浓度g/LC发酵温度/ħY胞外多糖(μg/L)１３．００４５．００３５．００１１４５．５０２３．００４０．００３７．００１１３１．３２３３．００３５．００３９．００６６２．２１４２．５０４０．００３９．００６７７．９４５３．５０３５．００３７．００６７３．９７６３．００３５．００３５．００１３６９．４４７２．５０４５．００３７．００１００６．３２８３．５０４０．００３９．００９２８．３８９２．５０３５．００３７．００７２５．３８１０３．５０４０．００３５．００６０６．３２１１３．５０４５．００３７．００１１０３．２４１２２．５０４０．００３５．００９８３．７１１３３．５０４５．００３９．００１４９８．９１表５㊀中心组合实验结果分析方差来源平方和自由度均方F值P值显著性模型１．３E＋００６９１．３E＋００５３０．１１＜０．０００１显著A２６６１９．４５１２６６１９．４５６．３５０．０３０４B２．８E＋００５１２．８E＋００５６４．００＜０．０００１显著C３２１５．５７１３２１５．５７０．７７０．４０１７A B７４４６．４５１７４４６．４５１．７８０．２１２１A C７９９１０．４６１７９９１０．４６１９．０６０．００１４显著B C２．８E＋００５１２．８E＋００５６６．８４＜０．０００１显著A２５．１E＋００５１５．１E＋００５１２０．９０＜０．０００１显著B２１９４００．８８１１９４００．８８４．６３０．０５６９C２３３９７．６５１３３９７．６５０．８１０．３８９１残差４１９１６．０４１０４１９１．６０失拟误差２１３１１．５４３７１０３．８５２．４１０．１５２０不显著纯误差２０６０４．５０７２９４３．５０总变异１．２E＋００６１９接种量与温度交互对E P S产量的影响如图７,植物乳杆菌２Ｇ２产E P S的能力随接种量和温度的增加呈先上升后降低趋势．其中,相对于温度,接种量的响应曲面坡度更加陡峭,变化更加显著,因此接种量对植物乳杆菌２Ｇ２产E P S能力的影响更为显著．并且由表５方差分析结果可知,接种量与温度的交互作用对E P S产量的影响显著．浓度与温度交互对E P S产量的影响如图８,７５第３期孔德卉等:高产胞外多糖能力的乳酸菌筛选及其培养条件的优化植物乳杆菌２Ｇ２产E P S 的能力随乳糖浓度和温度的增加呈先上升后降低趋势．其中,相对于温度,乳糖浓度的响应曲面坡度更加陡峭,变化更加显著,因此乳糖浓度对植物乳杆菌２Ｇ２产E P S 能力的影响更为显著．并且由表５方差分析结果可知,乳糖浓度与温度的交互作用对E P S 产量的影响显著．图６㊀接种量与浓度交互对E P S产量的影响图７㊀接种量与温度交互对E P S产量的影响图８㊀浓度与温度交互对E P S 产量的影响3㊀结论根据上述实验探究得到产E P S 最佳工艺参数:接种量为３．５％,温度为３９ħ,最佳碳源为乳糖,其最适浓度为４５g /L ,E P S 产量能够达到１４９８．９１μg /m L ．按照上述条件实验进行３次重复试验,其误差在５％以内,说明该模型能够较好地模拟其发酵过程中E P S 的含量变化．参考文献:[１]唐京,陈明,柯文灿,等．乳酸菌在疾病防治和人体保健中的应用研究进展[J ]．微生物学杂志,２０１７,３７(４):９８Ｇ１０７．[２]华鹤良．乳酸菌的分离鉴定及其抗菌肽与发酵性能研究[D ]．扬州:扬州大学,２０１４．[３]MA J AMA A H ,I S O L A U R IE ,S A X E L I N M ,e t a l ．L a c t i c a c i db a c t e r i a i n t h e t r e a t m e n t o f a c u t e r o t a v i r u s ga s t r o e n t e r i t i s [J ]．J P e d i a t r G a s t r N u t r ,１９９５,２０(３):３３３Ｇ３３８．[４]黄承敏,肖茜,王蓉蓉,等．一株高产胞外多糖乳酸菌的分离鉴定及其产胞外多糖的研究[J ]．中国酿造,２０１９,３８(１):８０Ｇ８３．[５]袁起伟,郝凤奇,杨文涛,等．乳酸菌抗肿瘤作用的研究进展[J ]．食品科学,２０１１,３２(９):３０３Ｇ３０６．[６]张玉龙,胡萍,王金龙,等．产胞外多糖乳酸菌的筛选及抗氧化特性研究[J 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c c h a r i d e s ,w i t ha no u t pu t o f １０１２．６μg /m L ．F o r t h e t e s tb a c t e r i a ,t h e r e s p o n s es u r f a c em e t h o dw a su s e dt oo p t i m i z e t h ec o n d i t i o n s f o r p r o d u c i n g e x t r a c e l l u l a r p o l y s a c c h a r i d e s ．T h r o u g ha s i n g l e f a c t o r e x pe r i m e n t ,t h e ef f e c t so f s t r a i n i n Ｇo c u l a t i o n a m o u n t ,c u l t u r e t e m pe r a t u r e ,d if f e r e n t c a r b o n s o u r c e s a n d c o n c e n t r a t i o n s o n t h e p r o d u c t i o n o fe x t r a c e l l u l a r p o l y s a c c h a r i d e sw e r e i n v e s t ig a t e d ．O nthi sb a s i s ,t h er e s p o n s es u r f a c e m e t h o d w a s u s e d t o f u r t h e r o p t i m i z e t h e c o n d i t i o n s f o r t h e p r o d u c t i o n o f e x t r a c e l l u l a r p o l ys a c c h a r i d e s ．T h e r e s u l t s s h o w e d t h a t t h e m a j o r f a c t o r sa f f e c t i n g th e p r o d u c t i o no fL a c t o b a c i l l u s p l a n t a r u m ２Ｇ２e x t r a c e l l u l a r p o l y s a c c h a r i d e sw e r e l a c t o s e c o n c e n t r a t i o n ＞i n o c u l a t i o n a m o u n t ＞c u l t i v a t i o n t e m p e r a t u r e ,t h e o p t i m a l o p t i m i z a t i o n c o n d i t i o n sw e r e l a c t o s e４５g /L ,i n o c u l a t i o na m o u n t ３．５％,c u l t u r e t e m pe r a t u r ew a s３９ħ,a n d t h e y i e l dof e x t r a c e l l u l a r p o l y s a c c h a r i d e u n d e r t h i s c o n d i t i o nw a s １４９８．９１μg/m L ,w h i c hw a s １．４８t i m e s t h a t b e f o r e o pt i m i z a t i o n ．K e y wo r d s :l a c t i c a c i db a c t e r i a ;e x t r a c e l l u l a r p o l y s a c c h a r i d e ;r e s p o n s e s u r f a c em e t h o d o l o g y ９５第３期孔德卉等:高产胞外多糖能力的乳酸菌筛选及其培养条件的优化。
乳酸菌菌种的分离筛选原理
乳酸菌菌种的分离筛选原理乳酸菌是一类广泛存在于自然界中的益生菌，广泛应用于食品、饲料、医药等领域。
乳酸菌菌种的分离筛选是乳酸菌应用研究中的重要一环，其目的是从大量的混合菌群中筛选出具有优良特性的菌株。
乳酸菌菌种的分离筛选原理主要包括以下几个方面：1. 选择合适的培养基：乳酸菌菌种对营养要求较高，因此选择适宜的培养基是分离筛选的首要步骤。
常用的培养基有MRS培养基、DC培养基等，它们含有适宜乳酸菌生长的营养成分，能提供所需能量和营养物质。
2. 适宜的培养条件：乳酸菌对培养环境的温度、pH、氧气和二氧化碳等条件有一定要求。
通常情况下，乳酸菌分离筛选需要在适宜的温度（一般为30-40）下进行，pH值保持在4.5-7.0之间，氧气和二氧化碳含量适中。
3. 分离方法：乳酸菌菌种的分离常采用传统的分离培养技术，如层析法、稀释平板法、摇瓶培养法等。
其中，层析法是一种常用的快速分离方法，通过将混合菌群在筛选培养基上涂抹或刺激，使不同菌株在筛选培养基上形成分离的菌落。
4. 鉴定鉴别：乳酸菌菌种的筛选与鉴定是不可分割的一步，只有确定菌株的种属和特性才能真正确认其乳酸菌的菌种类型。
目前，常用的鉴定方法包括形态学观察、生理和生化特性检测、分子生物学方法（如PCR技术、16S rDNA序列分析）等。
在乳酸菌菌种的分离筛选过程中，还需要注意以下几个问题：1. 选择样品：样品的选择对于乳酸菌菌种的分离筛选至关重要。
通常情况下，从乳制品、肠道、土壤等环境中寻找潜在的乳酸菌菌种，可以提高分离到优良菌株的几率。
2. 优化培养条件：对于特殊的乳酸菌菌种，可能需要优化培养条件，如调整温度、添加特定的营养成分等，以促进其生长和繁殖。
3. 评价筛选结果：乳酸菌菌种的分离筛选结果需要综合考虑其特性和应用价值。
如菌株的酸奶生产能力、耐酸碱能力、抗菌能力、抗氧化能力等。
总结起来，乳酸菌菌种的分离筛选原理主要包括选择合适的培养基和培养条件、采用适当的分离方法和鉴定鉴别技术。
土著菌乳酸菌酵母菌采集繁育方法
土著菌乳酸菌酵母菌采集繁育方法土著菌乳酸菌和酵母菌在食品工业中被广泛应用，具有重要的发酵功能和保健功效。
而采集和繁育这些菌种是进行相关研究和生产的首要步骤。
本文将介绍土著菌乳酸菌和酵母菌的采集和繁育方法，以供参考。
一、土著菌乳酸菌采集方法1. 选择合适的采集源：土著菌乳酸菌主要存在于土壤、植物叶片、动物肠道等环境中。
首先要选择适宜的采集源，确保菌株的纯度和活性。
2. 采集样品：使用无菌棉签或刮片等工具采集样品，避免外界的污染。
样品应该覆盖一个较大范围，以增加菌株的多样性。
3. 菌株分离：将采集得到的样品置于无菌培养基中，在适宜的温度和湿度条件下进行培养。
经过一段时间后，通过形态特征、生理特性和分子生物学方法等进行菌株分离，筛选出目标土著菌乳酸菌。
4. 菌株保存：将分离得到的菌株进行纯化和保存。
常见的保存方式有冷冻保存和液氮保存。
确保保存的菌株无变异和污染。
二、酵母菌采集方法1. 选择合适的采集源：酵母菌可以存在于土壤、水域、蔬菜水果表面等各种环境中。
根据需求选择相应的采集源，并确保其来源的纯净度和安全性。
2. 采集样品：使用无菌的方法采集样品，将其置于无菌容器中。
样品的选取要广泛，以获得多样性的菌株。
3. 筛选菌株：将采集得到的样品进行前处理，如过滤、稀释等。
然后将处理后的样品进行培养，酵母菌会在适宜的培养基上生长。
根据菌株的形态结构和生长特性，筛选出目标酵母菌。
4. 菌株保存：将分离得到的酵母菌进行纯化和保存。
常见的保存方法有冷冻保存和低温保存。
确保保存的菌株无变异和污染。
三、土著菌乳酸菌和酵母菌的繁育方法1. 选取合适的培养基：根据菌株的需求，选择适宜的培养基。
土著菌乳酸菌通常在MRS培养基中生长，酵母菌则适合在YPD培养基中繁育。
2. 培养条件调控：调整培养基的pH值、温度、氧气供应、培养时间等因素，以促进土著菌乳酸菌和酵母菌的生长和繁殖。
3. 扩大培养：通过适当的接种量将菌种进行扩大培养，以获取更多的菌体。
乳酸菌分离鉴定及试验方法
乳酸菌分离鉴定及试验方法一、引言乳酸菌是一类广泛存在于自然界中的微生物，具有重要的生物学功能和应用价值。
乳酸菌可以通过发酵作用，将葡萄糖、果糖等碳源转化为乳酸和其他有机酸，同时还会产生一些对人体有益的物质，如维生素、酶、抗生素等。
乳酸菌在食品工业、医药工业、农业等领域具有重要的应用前景。
乳酸菌的分离鉴定及试验方法对于深入研究乳酸菌菌种的特性、功能以及在不同领域中的应用具有重要意义。
本文将介绍乳酸菌的分离鉴定及试验方法，旨在为相关研究人员提供参考和指导。
二、乳酸菌分离方法1. 采样乳酸菌的分离首先需要进行采样工作。
可以从发酵食品、乳制品、蔬菜、水果、土壤、肠道等多种来源进行采样。
在采样过程中应注意样品的新鲜性和卫生性，避免外部污染对实验结果造成影响。
2. 培养基的选择乳酸菌可以利用多种培养基进行分离和培养，常用的培养基有MRS培养基、乳清培养基等。
根据具体的分离目的和需求选择适合的培养基。
3. 分离将采样得到的样品进行系列稀释，取适量的稀释液均匀涂布在含有适当培养基的琼脂平板上，培养温度一般在30-37摄氏度之间，培养时间约48-72小时。
4. 纯化观察培养基上的菌落形态，选择典型的菌落进行分离单菌培养，通过多次传代稀释可以纯化获得纯种的乳酸菌。
5. 形态观察利用显微镜对分离得到的菌株进行形态学观察，包括细胞形状、大小、排列方式等。
三、乳酸菌鉴定方法1. 生理生化鉴定通过对分离得到的菌株进行生理生化特性的研究，包括乳酸发酵能力、氧耐受性、温度、pH值的适应能力等，可以初步判断乳酸菌的种属。
2. 生化试剂法利用生化试剂对乳酸菌进行鉴定，如气体发生试验、氧化还原酶试验、酶活性试验等。
3. 分子生物学鉴定通过PCR扩增乳酸菌的16S rRNA基因序列，测序后与数据库比对，确定乳酸菌的种属分类。
四、乳酸菌试验方法1. 发酵活性测定通过测定菌株在不同条件下的发酵活性，如发酵速率、产酸速率、产酶能力等。
2. 抗菌活性测定测定乳酸菌对一些有害菌的抑菌作用，判断其在抗菌方面的潜力。
L_乳酸高产菌株的选育
21No. 1. 2004食品技术L(+-乳酸高产菌株的选育徐子钧1 李剑1 马建芳2 王淑芳2 刘如林1 (1.南开大学生命科学学院天津・300071; 2.天津南开戈德集团天津・300071摘要:以代谢调控发酵理论为依据,利用紫外线、亚硝基胍、DES 等理化因子对乳酸菌进行复合诱变,再用高浓乳酸钙平板、纯乳酸平板、琥珀酸平板筛选得到一株高产L(+-乳酸的正向突变株M 7,平均发酵产量为90g/L ,比原菌株产量提高30%,对糖的转化率为88.9%。
关键词:乳酸菌;L-乳酸;菌种选育中图分类号:TS201.3 文献标识码:A 文章编号:1005-9989(200401-0021-03Breeding of L (+-Lactic acid bacteriaXU Zi-jun 1 LI Jian 1 MA Jian-fang 2 WANG Shu-fang 2 LIU Ru-lin 1(1. Life College, Nankai University, Tianjin, 300071; 2. Tianjin Nankai Guard Co.,Ltd, Tianjin, 300071Abstract: Multiple mutagenesis(U.V., NTG, DES were applied and the L(+-lactic acid producing mutant was selected based on the pathway analysis and metabolic engineering theory. After fermentation for 72 hours, the mutant strain gave a L(+-lactic acid output of 90g/L, 30% higher than the parent strain and sucrose conversion of 88.9%.Key words: lactic acid bacteria; L(+-lactic acid; breeding0 前言乳酸是一种重要的有机酸,可分为D 型和L 型乳酸,人体只能代谢其中的L 型乳酸,而且L-乳酸及其盐类和衍生物在医疗、农业等许多部门都有广泛的用途[1]。
乳酸菌的分离和初步鉴定
乳酸菌的分离和初步鉴定刘海音张超(长春师范学院生物系，长春，130032)摘要：本文采用BCG牛乳培养基琼脂平板筛选乳酸菌，经过连续6次以上的传代，以达到分离提纯，镜检时观察到链球状和杆状两种形状。
为了鉴定分离出的菌种，做了一系列的生理生化反应实验，如吲哚试验的反应结果为阴性，糖发酵试验的反应结果为阳性。
此外还进一步做了小型发酵实验，检测出了乳酸的存在⑴。
以上实验结果符合乳酸菌的特征，从而证实该分离出的菌种为乳酸菌，杆状的叫做短乳杆菌，链球状的叫做乳链球菌。
关键词：乳酸菌分离鉴定乳酸菌为一群可发酵碳水化合物以获取能量，并生成大量乳酸的一类细菌的总称。
利用发酵技术保藏食品，最典型的是通过乳酸菌的发酵。
这在发酵乳工业中已经得到广泛的应用。
利用天然的或经筛选的乳酸菌发酵，已经生产出多种不同类型的发酵乳。
因而分离和鉴定乳酸菌对人类的生产和生活都具有非常重要的意义。
本报告采用BCG牛乳培养基琼脂平板筛选和分离乳酸菌，利用镜检观察到了链球状和杆状两种形状。
通过吲哚试验和糖发酵试验以及小型发酵实验证明该菌种为乳酸菌，杆状的叫做短乳杆菌，链球状的叫做乳链球菌1. 材料和方法1.1材料1.1.1 选用沈阳乳业有限责任公司乳品一厂生产的辉山纯酸奶1.1.2 培养基BCG牛乳培养基A(溶液)：脱脂奶粉100g, 水500 ml, 加入1.6%溴甲酚绿（B.C.G）乙醇溶液1 ml,80 摄氏度灭菌20 min.B(溶液)：酵母膏10 g, 水500 ml, 琼脂20 g, PH : 6.8 121摄氏度灭菌20 min以无菌操作趁热将A ,B 溶液混合均匀后倒平板。
乳酸菌培养基牛肉膏 5 g , 酵母膏5 g , 蛋白胨10 g ,葡萄糖10 g , 乳糖5 g , 氯化钠 5 g ,水1000 ml , PH : 6.8121摄氏度湿热灭菌20 min蛋白胨水培养基蛋白胨10 g , 氯化钠5 g , 水1000 ml , PH : 7.2 ~ 7.4121 摄氏度湿热灭菌20 min糖发酵培养基蛋白胨水培养基1000 ml , 1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1~2 ml ,PH : 7.6 , 另配20%糖溶液（葡萄糖，蔗糖）各10 ml.制法：1）.将上述含指示剂的蛋白胨水培养基（PH : 7.6 ）分装于试管中，在每管内放一倒置的小玻璃管（Durhem tube）,使充满培养液。
乳酸菌的培养检测方案
品质管理检测项目细菌形态学分类一乳酸杆菌乳酸杆菌的基本属性：乳酸菌为一群可发酵碳水化合物以获取能量，并生成大量乳酸的一类细菌的总称。
利用发酵技术保藏食品，最典型的是通过乳酸菌的发酵。
这在发酵乳工业中已经得到广泛的应用。
利用天然的或经筛选的乳酸菌发酵，已经生产出多种不同类型的发酵乳。
因而分离和鉴定乳酸菌对人类的生产和生活都具有非常重要的意义。
无芽孢，革兰氏染色呈阳性。
微好氧，厌氧发酵，最适温度30~40摄氏度，最适PH值为5.5~6.2，在微酸环境下可以生长，中性或者偏碱性环境中则生长速率下降。
在固体培养基上培养时，通常厌氧条件或者减少氧气压力和充有体积分数为5%~10%的CO2可以增加其表面生长物，有些菌株在分离时就是厌氧的。
（一）实验仪器和试剂：实验仪器：现有的仪器：欠缺的仪器：培养基和试剂：①培养基：BCP培养基、MRS培养基和SL培养基BCP培养基：酵母膏2 5g，蛋白胨5g，葡萄糖5g，溴甲酚紫0.04g，琼脂15g，蒸馏水lO00ml，pH7 0；MRS培养基（可以培养包括双岐乳杆菌、嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌）：重量(g) 牛肉蛋白粉10 ，鱼肉汁10 ，酵母浸出汁粉5 ，葡萄糖20 ，醋酸钠5 ，柠檬酸二铵 2 ，吐温80 0.1 ，硫酸镁0.58 ，硫酸锰0.28 ，蒸溜水1 000ml ，备注：用高压锅在121℃灭菌15min，调节pH6.2～6.4 。
乳酸杆菌选择性琼脂SL：酪蛋白水解物10g；酵母提取物5g；柠檬酸二铵2g；乙酸钠（CH3COONa？3H2O）25g；MgSO4？7H2O 0.58g；琼脂15g；葡萄糖20g；吐温80 1.0ml；磷酸氢二钾6g；FeSO4？7H2O 0.03g；MnSO4？4H2O 0.15g。
以上用量为1000ml培养基的用量。
溶解琼脂在500ml的沸水中，溶解其他组分在500ml的水中，用冰醋酸调pH=5.4，并混合已融化的琼脂，进一步煮沸5分钟，倾倒平板或此热的培养基适量分装入灭菌的试管，这样无需进一步灭菌，避免重复融化和冷却。
乳酸菌的筛选与鉴定流程
乳酸菌的筛选与鉴定流程1.材料首先要确定目标，即所筛选的乳酸菌来自哪里，例如想要筛选一株果蔬发酵乳酸菌，那我们就得找一个产区或者其他地方自然发酵果蔬的样品。
1.1培养基查找相关文献，菌种生化鉴定用培养基建议查看文献：工业微生物实验手册MRS培养基：牛肉膏10 g/L，蛋白胨10 g/L，吐温801g/L，葡萄糖50 g/L，乙酸钠5g/L，硫酸镁0.2 g/L，磷酸氢二钾2 g/L，柠檬酸二铵2 g/L，溴甲基酚紫0.4 g/L，酵母提取物5 g/L，琼脂15～20 g/L，pH 6.3～6.7，121 ℃湿热灭菌30 min。
（PS：若自己嫌麻烦，可买现成的MRS培养基）初筛培养基：在MRS分离培养基的基础上，添加0.5%碳酸钙，乳酸调至PH2.0.（加碳酸钙是为了能更好的挑出优势菌，乳酸调至PH2.0也是同样道理）如图：若是乳酸菌菌落旁会有清晰可见的透明圈，这是由于乳酸与碳酸钙反应了。
高盐复筛培养基∶在MRS分离培养基的基础上，添加10%氯化钠和0.5%碳酸钙。
高糖复筛培养基∶在MRS分离培养基的基础上将葡萄糖质量分数提高到30%，添加0.5%碳酸钙。
明胶培养基∶蛋白胨25 g/L，牛肉膏7.5 g/L，氯化钠5g/L，明胶100 g/L，pH7.0～7.2，121∶湿热灭菌15 min。
果蔬发酵培养基∶将苹果、胡萝卜、西瓜、西红柿等水果、蔬菜清洗去皮切分后分别榨汁除渣制得发酵果酱，然后按1∶1∶1∶1比例混合经巴氏灭菌后4 ∶冷藏。
按照混合果蔬汁33.3%、葡萄糖5%、蔗糖5%、氯化钙0.5%、磷酸氢二钠0.05%、磷酸二氢钠0.05%、硫酸镁0.03%、柠檬酸0.1%的配比配制，除果蔬和柠檬酸外其余成分于115 ∶湿热灭菌15 min。
2.方法2.1乳酸菌的分离筛选取产区自然发酵苹果原浆，用0.9%灭菌生理盐水进行10 倍梯度稀释后，吸取适宜稀释度溶液涂布至MRS分离培养基中，37 ∶恒温厌氧培养24h，挑取菌落黄色范围大并具有乳酸菌典型特征的单菌落，进行革兰氏染色观察菌体形态。
乳酸菌生长最佳培养基的筛选
乳酸菌生长最佳培养基的筛选Prepared on 22 November 2020乳酸菌生长最佳培养基的筛选摘要：文中通过检测乳酸菌在不同固体和半固体培养基中的菌落数、菌落大小及溶钙圈大小,以筛选出乳酸菌生长的最佳培养基。
实验表明,在添加胡萝卜汁的乳酸菌分离固体培养基上,乳酸菌生长最好,活菌数含量最高,菌落和溶钙圈最大。
同种培养基,半固体培养较固体培养更适于乳酸菌生长,前者出菌快,活菌数多。
关键词：乳酸菌固体培养基半固体培养基菌落乳酸菌是有益于人体健康的益生菌,主要存在于人体肠道,其有助于宿主调整正常菌群,维持肠道微生态环境的平衡。
乳酸菌的代谢产物能降低肠道内的pH值,抑制肠道中腐败菌的生长和减弱腐败菌在肠道的产毒作用,并有帮助消化、防止便秘,防止细胞老化,降低胆固醇,抗肿瘤以及调节人体生理机能等保健和医疗作用[1-5]。
在食品向天然型、功能型发展的今天,乳酸菌制品正愈来愈受到人们的重视,通过检测乳酸菌在不同固体和半固体培养基中的菌落数,菌落和溶钙圈的大小,以筛选出乳酸菌生长的最佳培养基,用于乳酸菌制品的研究与开发一、材料及方法111菌种及来源保加利亚乳杆菌(lactobacillusbulgaricus),由西北农业大学微生物室提供。
(以下简称乳酸菌)。
112培养基11211固体培养基的筛选RJP培养基(1号):牛肉膏3g;蛋白胨3g;酵母膏3g;乳糖20g;琼脂15g;蒸馏水1000ml;pH610。
LAB培养基(2号):牛肉膏10g;酵母膏10g;乳糖20g;琼脂15g;吐温80110ml;CaCO310g;KH2PO42g;蒸馏水950ml;pH616。
214号培养基(3号):牛肉膏3g,胰胨10g;NaCl5g;酵母膏6g;葡萄糖2g;半胱氨酸013g;琼脂15g;蒸馏水1000ml;pH714~715乳酸菌分离培养基(4号):牛肉膏1g;蛋白胨1g;酵母膏1g;葡萄糖1g;蕃茄汁20%;吐温800105%;CaCO32g;溴甲酚绿0101%;琼脂115g;蒸馏水100ml;pH615。
乳酸菌鉴定
都要求无菌操作菌种的分离取lmL卤汁以10倍递增稀释方法（一份酸奶，九份无菌水，再取一份第一只管中溶液，加九份无菌水，依次类推），将其稀释至1/10～10的-10次幂（我打不上去），然后从不同浓度稀释液中分别取lmL倾注在平皿中，再倒入培养基相混合，待培养基凝固后倒置于30~C 恒温下培养48h。
挑取长势良好的单个茵落划线分纯，直至纯化(茵落单个大小一致，革兰氏染色镜检，茵体一致)。
结果分离得到3株不同菌株，分别编号为菌株1、菌株2、菌株3。
再分别转移到试管斜面上进行保存。
分离用培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，蒸馏水1 000 mL，琼脂20g，pH7．0—7．2；保存用斜面培养基：酵母膏1％，碳酸钙2％，葡萄糖1％，琼脂2％，pH 7．0。
培养条件将分离出的菌株1、菌株2、菌株3分别接种在上述4种不同的培养基上，在30℃恒温条件下培养48h后观察并测定其培养结果。
测定方法菌落总数采用逐级稀释法来计数；pH值用pHS一2C酸度计测定；乳酸定性及含量测定依据食品检验技术1I．2．1乳酸菌的分离与筛选的试验程序自然发酵酸菜汁液一稀释一培养一挑起单菌落染色、镜检一挑选革兰氏阳性球菌单菌落一Ⅲ号培养基一挑选溶钙圈大的球菌反复在Ⅲ号培养基上几次纯化筛选一单菌落优良菌株一试管穿刺低温保存。
1．2 1．2 乳酸菌的鉴定用光学显微镜、放大镜进行乳酸菌的形态特征鉴定。
生理生化特征鉴定：产乳酸定性试验——乳酸纸层析法0- 、过氧化氢酶(接触酶)反应⋯、明胶水解反应、硫化氢反应、乳酸菌发酵营养型试验0 、耐盐、酸、温度试验。
1．2．I．3 乳酸菌的保存⋯采用定期移植低温保藏法。
培养基配方：葡萄糖1％、蛋白胨0 2％、l(}l2PQ|0．2％、琼脂20％、pH值7 0，分装试管，121。
c灭菌30min。
将使用对数生长期后期的细胞进行穿刺培养，然后密封存于冰箱玲藏室内(5qc左右)，2个月移植1次。
1．2．2 分离乳酸菌的生理特点试验1 2 2．1 最适生长温度的测定OD值以同温下不接种培养基作对照，定期取出接种培养基在721分光光度计上，用最大吸收光波长=6001RIifl测定。
荔枝内生乳酸菌的筛选鉴定及发酵效果分析
荔枝内生乳酸菌的筛选鉴定及发酵效果分析荔枝是一种热带水果，其口感鲜甜多汁，深受人们喜爱。
荔枝内生的乳酸菌具有很高的营养和生理活性，对人体健康具有益处。
对荔枝内生乳酸菌进行筛选鉴定及发酵效果分析，对于发掘其潜在的营养和功能具有重要意义。
对荔枝内生乳酸菌进行筛选鉴定是十分重要的。
乳酸菌是一类革兰氏阳性杆菌或球形菌，以产生乳酸为代谢产物而得名。
对内生乳酸菌的筛选可以利用平板和液体培养基，通过酸和碱反应、温度耐受性、盐耐受性以及对酶反应等方法进行鉴定，以保证所筛选到的菌种具有良好的发酵特性和生物活性。
在筛选鉴定后，还需要进行发酵效果分析。
发酵是乳酸菌生长、分裂和代谢产物积累的过程，其发酵效果不仅直接影响到产品的质量和口感，还与菌株的生理特性和发酵工艺有关。
通过测定酸奶pH值、酸奶的酸度、总酸度、酸奶的黏度、酸奶的感官评价等指标，评估内生乳酸菌的发酵效果，以确定最佳的发酵工艺参数和菌株选择。
荔枝内生乳酸菌的筛选鉴定及发酵效果分析工作的开展，对提高荔枝产品的附加值和市场竞争力具有积极作用。
希望通过本研究，能为荔枝乳酸菌的开发利用和产品附加值提升提供一定的理论基础和技术支撑。
一、引言荔枝是一种热带水果，其果肉鲜甜多汁，具有独特的风味和口感，深受人们的喜爱。
而荔枝内生的乳酸菌则具有多种细菌和酵母，对人体健康具有重要的意义。
乳酸菌是一类革兰氏阳性杆菌或球形菌，以产生乳酸为代谢产物而得名，广泛存在于大自然中的各种环境中。
一些内生乳酸菌菌株对人体具有益处，可以改善肠道微生态平衡，增强人体的抵抗力，预防腹泻和便秘等肠道疾病。
在荔枝中，除了含有丰富的营养物质外，还含有大量的内生乳酸菌。
对荔枝内生乳酸菌的筛选鉴定及发酵效果分析，目前研究较少，所以本研究旨在对荔枝内生乳酸菌进行筛选鉴定，评价其发酵效果，为开发利用荔枝乳酸菌提供更多的科学依据。
二、荔枝内生乳酸菌的筛选鉴定1. 筛选培养基的选择在进行荔枝内生乳酸菌的筛选鉴定前，首先需要选择适宜的筛选培养基。
产胞外多糖(EPS)乳酸菌菌株的分离、筛选
产胞外多糖(EPS)乳酸菌菌株的分离、筛选1.目的要求(1)熟悉产胞外多糖乳酸菌菌株的筛选方法(2)了解乳酸菌产胞外多糖的基本原理2.基本原理微生物胞外多糖(exopolysaccharides, EPS)是一些特殊微生物在生长代谢过程中分泌到细胞壁外、易与菌体分离的荚膜多糖或黏液多糖，属于微生物的次级代谢产物。
微生物EPS是一种长链、高分子质量的聚合物，甚独特的物理学和流变学特性以及使用安全性使它在食品和非食品工业备受青睐，尤其是它在医药领域所具有的巨大应用潜能正日愈引起人们的广泛关注。
自然界中能产生多糖的微生物种类很多，涉及细菌、酵母和丝状真菌。
长久以来，乳酸菌用于发酵乳的生产，通常认为乳酸菌EPS安全性更为可靠，而且乳酸菌作为生理功能调节剂，利用益生菌制成活菌制剂，省去常规发酵、提取等繁琐工艺。
因此，开发乳酸菌EPS较其他微生物EPS来说，更具有理论意义与实际价值。
多糖难溶于乙醇，因此如果乙醇溶液中有絮状沉淀出现，通常可认为样品中含有多糖。
本实验就是利用多糖的这种性质来沉淀分离微生物EPS以供下一步的多糖检测。
目前用于多糖检测的方法较多，主要有干燥称重法、硫酸一蒽酮法、DNS(3, 5一二硝基水杨酸）法、苯酚一硫酸法、相对黏度法和Imshenetskii等报道的浊度法等。
由于苯酚一硫酸法具有简单方便、显色稳定、灵敏度高、重现性好、不受蛋白质干扰等优点而深受欢迎。
其原理是根据苯酚一硫酸试剂与游离的寡糖和多糖中的己糖、糖醛酸（或甲苯衍生物）发生的显色反应。
己糖在490nm处（戊糖及糖醛酸在480nm处）有最大吸收，吸收值与糖含量呈线性关系。
具体操作见实验步骤。
本实验利用多糖难溶于乙醇的性质来沉淀分离微生物EPS。
本实验以乳制品和肉制品为初始原料，分离产EPS的乳酸菌菌株并筛选高产EPS的优良菌株。
3实验材料3.1原料从市场上购买的乳制品、肉制品。
3.2培养基MRS液体培养基、固体培养基（1.5％琼脂）。
高产细菌素乳酸菌的筛选（方案）
⾼产细菌素乳酸菌的筛选（⽅案）项⽬⼀⾼产细菌素乳酸菌的筛选⼀、概述1、乳酸菌乳酸菌是⼀群形态、代谢性能和⽣理学特征不完全相同的⾰兰⽒阳性菌( G+) 的统称，在发酵碳⽔化合物时其代谢产物主要为乳酸。
乳酸菌形态多样，通常不运动，乳酸菌微好氧，在固体培养基上培养时，采⽤厌氧或低氧压可增加其在表⾯的⽣长物，乳酸菌的⽣长温度在20~53℃，最适温度是30~40℃，耐酸，最适pH 通常是5.5~6.2，⼀般pH在5.0 或更低情况下可以⽣长，在碱性或中性条件其⽣长速率降低。
2、细菌素细菌素是由细菌在代谢过程中通过核糖体合成产⽣的⼀类具有抑菌活性的蛋⽩质或多肽，主要对同源和近缘的细菌有抑制作⽤，在产⽣细菌素的同时还会产⽣免疫蛋⽩，从⽽避免细菌素对⾃⾝细胞的杀伤作⽤。
乳酸菌素是乳酸菌在代谢过程中，合成并分泌到环境中的⼀类对⾰兰⽒阳性菌，尤其是亲缘较近的细菌具有抑菌作⽤的杀菌蛋⽩或多肽乳酸菌素( Nisin) 是乳酸球菌代谢过程中合成和分泌的具有很强杀菌作⽤的物质。
作为乳酸菌细菌素，许多证据表明，Nisin对细胞主要作⽤在细胞质膜，⽽对细菌的杀菌作⽤是由于在菌膜上形成空洞，使膜的通透性增⼤。
⼆、实验⽬的1.熟练掌握培养基的接种，抑菌试验。
2.掌握培养基的配制原则与⽅法。
3.了解⽜津杯法，并能规范操作相关步骤。
三、实验内容1.材料与试剂泡菜⼤肠杆菌、⾦黄⾊葡萄球菌1mol/L NaOH、和HCl溶液、pH试纸、⽊⽠蛋⽩酶、双氧⽔2．培养基①MRS培养基: 蛋⽩胨10g、⽜⾁膏10g、酵母膏5g、柠檬酸氢⼆铵2g、葡萄糖20g、吐温80 1mL、⼄酸钠5g、磷酸氢⼆钾2g、硫酸镁0.58g、硫酸锰0.25g、琼脂18g、蒸馏⽔1000mL,②⽜⾁膏蛋⽩胨固体培养基：⽜⾁膏3.00g、蛋⽩胨5.00g、NaCl3.00g、蒸馏⽔1000ml、琼脂粉8.00g、115℃灭菌20min。
③⽯蕊⽜奶培养基：⽜奶培养基(⽜奶培养基的制备取脱脂奶粉，制成10%的溶液) ，每100ml中加⼊2.50ml⽯蕊⼄醇溶液( 取⽯蕊20g，研磨后置锥形瓶中，加⼊40%⼄醇150ml，煮沸1min，倒出上层液，再加⼊40%⼄醇150ml，煮沸1min，倒出上层液，与第1次倒出液合并，再以40%⼄醇加⾄全量为300ml，滴加1mol/L 盐酸，随加随振摇，⾄溶液变紫⾊为⽌,pH6.0~8.0，混匀，取5~10ml分装于试管中，115℃灭菌20min。
mrs培养基鉴别乳酸菌的原理
mrs培养基鉴别乳酸菌的原理Mrs培养基是一种常见的用于鉴别和培养乳酸菌的营养基。
它在菌落形态、颜色、大小及pH等方面有着很好的区分度。
本文将围绕Mrs培养基鉴别乳酸菌的原理展开，阐述其具体步骤。
步骤一：准备Mrs培养基Mrs培养基的配方包括葡萄糖、胰蛋白胨、酵母提取物、磷酸盐缓冲液、琼脂和一些必要的微量元素。
首先需要称取适量的Mrs培养基粉末，加入足量的蒸馏水，用1000ml烧瓶装满，并加盖用锡箔纸盖好，然后在121℃高压蒸汽灭菌器上进行高温灭菌。
待温度降至40℃左右时，将培养基倒入培养皿中。
步骤二：分离干净的菌种分离干净的菌种是进行Mrs培养基鉴别乳酸菌的前提。
可以通过分离纯种法将菌种分离出来，并在液体培养基上培育至足够的菌液浓度。
步骤三：接种菌液使用无菌的匀菌棒，取少量菌液先在斜板上匀开，然后在准备好的Mrs培养基表面均匀地涂布菌液（最好不要涂太多的菌液，否则菌落数量过多会形成过度交织的菌落，不利于鉴别和计数）。
步骤四：培养将涂有菌液的培养皿，用无菌的夹子将培养皿盖口面向上转动，将其倾斜放置，放在一个恒温培养箱内，在30～35℃恒温下培养24～72小时。
步骤五：观察与鉴别菌落的形态、颜色、透明度、大小等特征，可以通过肉眼直接观察，或者使用显微镜进行观察。
不同种类的乳酸菌，其菌落在Mrs培养基上会表现出不同的特征，例如Lactobacillus 系列菌落相对呈现红色或者微黄色，且菌落数量相对较多；而Streptococcus则更加聚集且菌落相互之间不那么明显区分。
因此通过观察菌落的这些不同特征，可以初步鉴别出乳酸菌的种类。
总之，Mrs培养基鉴别乳酸菌的原理就是根据不同乳酸菌菌落形态、颜色、大小及pH值的特征来区分不同种类的乳酸菌。
这种方法简单，可靠性高，广泛应用于乳酸菌的鉴别和生产。
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乳酸菌菌种的培养筛选方法
简介
本文档介绍了乳酸菌菌种的培养筛选方法。
乳酸菌是一种有益菌，常被应用于食品工业和医药领域。
通过培养筛选方法，可以有效筛选出优质的乳酸菌菌种，以满足特定需求。
培养基准备
1. 选择适合乳酸菌生长的培养基，如MRS培养基。
2. 按照培养基的使用说明准备培养基溶液。
3. 灭菌培养基溶液，可使用高压灭菌器或高温灭菌法。
菌种接种
1. 从已有的乳酸菌菌种中选择适合的菌株。
2. 取一定量的菌种，注意保持无菌操作。
3. 将菌种转移到培养基中，可采用无菌环或吸管接种法。
4. 将接种好的培养基培养物置于恒温培养箱中，保持适宜的温度和氧气条件。
筛选方法
1. pH值筛选：选择适宜pH范围的培养基进行培养，通常在
pH 4-6之间。
2. 温度筛选：通过调整培养温度来筛选适应不同温度的菌种。
3. 抗性筛选：将菌种暴露在一定浓度的抗生素中，筛选出对抗
生素具有抗性的菌株。
4. 发酵性筛选：观察菌种在培养基中发酵的能力，以选择产酸
产气能力强的菌株。
筛选结果评估
1. 观察培养基的菌落形态，如形状、颜色等特征。
2. 测定菌株的生长速度和产酸量等。
3. 利用分子生物学方法进行菌株鉴定，如PCR、16S rRNA测
序等。
结论
通过以上培养筛选方法，可以高效地筛选出优质的乳酸菌菌种。
根据特定需求，可以选择适应不同环境和具有良好生产特性的菌株，为食品工业和医药领域的应用提供基础支持。
以上为乳酸菌菌种的培养筛选方法的简要介绍，希望对您有所帮助。