HAT培养基筛选杂交瘤细胞的原理

HAT培养基

HAT培养基
英文名称：HAT medium
定义：
用于筛选具有次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)或胸苷激酶(TK)活性缺陷细胞的培养基。

是含有次黄嘌呤(H)、氨基蝶呤(A)、胸苷(T)和甘氨酸的完全培养基。

在氨基蝶呤(二氢叶酸类似物)存在下，这种酶缺陷的细胞不能通过核苷酸合成旁路合成次黄嘌呤和胸苷。

HPRT和TK缺陷细胞可以在此培养基中生存。

是常用的骨髓杂交瘤细胞选择性培养基。

缺失这两种酶的细胞，在HAT培养基中，应该不能生存，只有发生融合或者其他情况下，才能是细胞重新获得用旁路途径进行DNA合成能力。

二、
HAT培养基也就是指含有这三种物质的细胞培养基。

对￡具有合成DNA原料的核苷酸的形成上，在细胞内具有起始合成途径（denovopathway）和中间合成途径（salvagepa-th■way）。

中间合成途径包括：通过HGPRT的催化作用把次黄嘌呤转化成次黄嘌呤核苷－磷酸(IMP)，通过TK的催化把胸腺嘧啶核苷转化成脱氧胸腺嘧啶核苷－磷酸(dTMP)，再进一步合成核酸。

由于氨基蝶呤可阻碍起始合成途径，所以培养基中含有它时，细胞便只有中间合成途径，所以必须供给核苷酸。

至于缺失中间合成途径的细胞，可失去增殖能力臻于死亡。

根据这一点，不仅把混存于细胞群中的正常细胞，通过试管内培养进行选择，例如嘌呤的中间合成途径缺失株和嘧啶的中间合成途径缺失株，由于可以互补，所以两者的杂种细胞，即使在氨基蝶呤的存在条件下也可以增殖。

在这种情况下，利用HAT培养基可对杂种细胞进行选择。

次黄嘌呤和胸腺嘧啶脱氧核苷可作为中间合成途径的原料而进行添加。

抗体的制备方法与原理

抗体的制备方法与原理－单克隆抗体的制备1975年Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞与和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交瘤细胞既可产生抗体，又可无性繁殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。

这一技术上的突破使血清学的研究进入了一个高度精确的新纪元。

免疫细胞化学的技术关键之一是制备特异性强、亲合力大、滴度高的特异性抗体，由于每种抗原都有几个抗原决定簇，用它免疫动物将产生对各个决定簇的抗体，即多克隆抗体。

单克隆抗体则是由一个产生抗体的细胞与一个骨髓瘤细胞融合而形成的杂交廇细胞经无性繁殖而来的细胞群所产生的，所以它的免疫球蛋白属同一类型，质地纯一，而且它是针对某一抗原决定簇的，因此特异性强，亲合性也一致。

单克隆抗体（McAb）的特性和常规血清抗体的特性比较见2-3。

表2—3 单克隆抗体（McAb）和常规免疫血清抗体的特性比较单克隆抗体的制备方法如下。

（一）动物的选择与免疫1．动物的选择纯种BALB/C小鼠，较温顺，离窝的活动范围小，体弱，食量及排污较小，一般环境洁净的实验室均能饲养成活。

目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种BALA/C小鼠。

2．免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb 至关重要。

一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。

（1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐剂。

常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。

初次免疫抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0.8～1ml,0.2ml/点）↓3周后第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip（腹腔内注射）（ip剂量不宜超过0.5ml）↓3周后第三次免疫剂量同一，不加佐剂，ip（5～7天后采血测其效价）↓2～3周加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv（静脉内注射）↓3天后取脾融合目前，用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如：①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。

临床免疫学检验名词解释重要知识点上

抗原抗体反应：是指抗原与相应抗体在体内或体外发生的特异性结合反应。

抗原抗体间的结合力涉及静电引力、范德华力、氢键和疏水作用力，其中疏水作用力最强，它是在水溶液中两个疏水基团相互接触，由于对水分子的排斥而趋向聚集的力。

亲和性（affinity）：是指抗体分子上一个抗原结合点与一个相应抗原表位（AD）之间的结合强度，取决于两者空间结构的互补程度。

亲合力（avidity）：是指一个完整抗体分子的抗原结合部位与若干相应抗原表位之间的结合强度，它与亲和性、抗体的结合价、抗原的有效AD数目有关。

抗原抗体反应的特点：特异性、可逆性、比例性、阶段性。

带现象（zone phenomenon）：一种抗原-抗体反应的现象。

在凝集反应或沉淀反应中，由于抗体过剩或抗原过剩，抗原与抗体结合但不能形成大的复合物，从而不出现肉眼可见的反应现象。

抗体过量称为前带，抗原过量称为后带。

免疫原（immunogen）：是指能诱导机体免疫系统产生特异性抗体或致敏淋巴细胞的抗原。

免疫佐剂（immuno adjustvant）：简称佐剂，是指某些预先或与抗原同时注入体内，可增强机体对该抗原的免疫应答或改变免疫应答类型的物质。

半抗原（hapten）：又称不完全抗原，是指仅具有与抗体结合的能力(抗原性)，而单独不能诱导抗体产生（无免疫原性）的物质。

当半抗原与蛋白质载体结合后即可成为完全抗原。

载体（carrier）：结合后能给予半抗原以免疫原性的物质。

载体效应：初次免疫与再次免疫时，只有使半抗原结合在同一载体上，才能使机体产生对半抗原的免疫应答，该现象称为~。

单克隆抗体（McAB）：将单个B细胞分离出来，加以增殖形成一个克隆群落，该B细胞克隆产生的针对单一表位、结构相同、功能均一的抗体，即~。

多克隆抗体（PcAb）：天然抗原分子中常含多种不同抗原特异性的抗原表位，以该抗原物质刺激机体免疫系统，体内多个B细胞克隆被激活，产生含有针对不同抗原表位的免疫球蛋白，即~基因工程抗体（GEAb）：是利用DNA重组及蛋白工程技术，从基因水平对编码抗体的基因进行改造和装配，经导入适当的受体细胞后重新表达的抗体。

hat选择培养基筛选杂交瘤细胞的原理

hat选择培养基筛选杂交瘤细胞的原理下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。

文档下载后可定制修改，请根据实际需要进行调整和使用，谢谢！本店铺为大家提供各种类型的实用资料，如教育随笔、日记赏析、句子摘抄、古诗大全、经典美文、话题作文、工作总结、词语解析、文案摘录、其他资料等等，想了解不同资料格式和写法，敬请关注！Download tips: This document is carefully compiled by this editor. I hope that after you download it, it can help you solve practical problems. The document can be customized and modified after downloading, please adjust and use it according to actual needs, thank you! In addition, this shop provides you with various types of practical materials, such as educational essays, diary appreciation, sentence excerpts, ancient poems, classic articles, topic composition, work summary, word parsing, copy excerpts, other materials and so on, want to know different data formats and writing methods, please pay attention!原理及应用：选择培养基筛选杂交瘤细胞在细胞生物学研究中，筛选杂交瘤细胞（hybridoma cells）是一项关键技术，这些细胞能够产生单克隆抗体，用于生物医药研究和治疗。

杂交瘤细胞筛选实验报告

一、实验目的本实验旨在通过细胞融合技术，获得具有无限增殖能力和特异性抗体分泌能力的杂交瘤细胞。

通过筛选和克隆化，最终获得纯化的单克隆抗体。

二、实验原理杂交瘤细胞筛选技术是利用细胞融合技术，将小鼠的骨髓瘤细胞与分泌某种抗体的淋巴细胞融合，形成杂交瘤细胞。

杂交瘤细胞具有肿瘤细胞无限增殖的特性，同时保留淋巴细胞分泌特异性抗体的能力。

通过筛选和克隆化，获得纯化的单克隆抗体。

三、实验材料1. 试剂：聚乙二醇（PEG）、HAT培养基、抗原、酶联免疫吸附剂（ELISA）、辣根过氧化物酶标记羊抗鼠lgG抗体、包被液、脱脂奶粉、洗涤液、底物显色液、终止液等。

2. 仪器：倒置显微镜、细胞培养箱、超净工作台、冰箱、酶标仪、微量移液器、恒温箱、96孔板等。

3. 实验动物：小鼠。

四、实验步骤1. 细胞融合：将骨髓瘤细胞和分泌某种抗体的淋巴细胞按照一定比例混合，加入PEG诱导细胞融合。

2. 细胞培养：将融合后的细胞接种于含有HAT培养基的培养瓶中，在细胞培养箱中培养。

3. 细胞筛选：经过1-2周的培养，筛选出能够存活并无限增殖的杂交瘤细胞。

4. 特异性抗体筛选：采用ELISA方法，将抗原固相在微孔板上，将杂交瘤细胞培养上清加入微孔板中，检测抗体与抗原的结合情况。

5. 克隆化：将筛选出的阳性杂交瘤细胞进行克隆化，确保获得纯化的单克隆抗体。

6. 阳性杂交瘤细胞筛选：利用间接ELISA方法，检测克隆化后的杂交瘤细胞是否产生特异性抗体。

五、实验结果1. 细胞融合：成功将骨髓瘤细胞和分泌某种抗体的淋巴细胞融合。

2. 细胞培养：在HAT培养基中，杂交瘤细胞能够存活并无限增殖。

3. 细胞筛选：经过筛选，获得能够存活并无限增殖的杂交瘤细胞。

4. 特异性抗体筛选：ELISA结果显示，部分杂交瘤细胞能够产生特异性抗体。

5. 克隆化：对筛选出的阳性杂交瘤细胞进行克隆化，获得纯化的单克隆抗体。

6. 阳性杂交瘤细胞筛选：间接ELISA结果显示，克隆化后的杂交瘤细胞均能产生特异性抗体。

杂交瘤法制备单克隆抗体的过程

杂交瘤法制备单克隆抗体的过程引言：单克隆抗体在生物医学研究和临床应用中起着重要作用。

其中，杂交瘤法是制备单克隆抗体的一种常用方法。

本文将详细介绍杂交瘤法制备单克隆抗体的过程。

1. 选择免疫原制备单克隆抗体的第一步是选择合适的免疫原。

免疫原可以是蛋白质、多肽、糖蛋白或其他生物大分子。

选择免疫原时需要考虑其抗原性、纯度和稳定性。

2. 免疫动物免疫将选择好的免疫原注射到小鼠等免疫动物体内，激发其免疫系统产生抗体。

免疫过程中需要进行多次免疫，以增加抗体的产生。

通常，第一次免疫后，需要在一定时间间隔内进行多次增强免疫，以提高抗体的效价。

3. 细胞融合免疫动物产生的抗体是多克隆抗体，其中含有多种抗体细胞。

为了制备单克隆抗体，需要将这些抗体细胞与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞。

4. 杂交瘤细胞筛选杂交瘤细胞的筛选是制备单克隆抗体的关键步骤。

一般采用HAT （杂交瘤培养液，含有一种离子交换剂、一种抗代谢药物和一种抗生素）培养基进行筛选。

由于骨髓瘤细胞具有无限生长的能力，而免疫细胞不具备，因此只有杂交瘤细胞能在HAT培养基中存活和繁殖。

5. 单克隆抗体鉴定通过ELISA（酶联免疫吸附测定）或其他方法，对杂交瘤细胞进行单克隆抗体的鉴定。

常用的方法包括Western blotting、免疫组化和流式细胞术等。

鉴定合格的单克隆抗体可以进行进一步的扩增和纯化。

6. 单克隆抗体扩增通过体外培养，将单克隆抗体扩增至足够的量。

扩增过程中需要对培养条件进行优化，以提高抗体的产量和纯度。

7. 单克隆抗体纯化通过柱层析、亲和层析、离子交换层析等方法，对扩增后的单克隆抗体进行纯化。

这些方法能够去除杂质，提高抗体的纯度和活性。

8. 单克隆抗体应用纯化后的单克隆抗体可以应用于生物医学研究和临床治疗中。

其应用包括免疫组织化学、免疫荧光、免疫沉淀、免疫电泳等多个方面。

结论：杂交瘤法是制备单克隆抗体的重要方法之一。

通过选择免疫原、免疫动物免疫、细胞融合、杂交瘤细胞筛选、单克隆抗体鉴定、扩增和纯化等步骤，可以制备出高纯度和高活性的单克隆抗体。

安徽省合肥市肥东县第二中学2023年高考适应性考试生物试卷含解析

2023年高考生物模拟试卷注意事项：1．答卷前，考生务必将自己的姓名、准考证号填写在答题卡上。

2．回答选择题时，选出每小题答案后，用铅笔把答题卡上对应题目的答案标号涂黑，如需改动，用橡皮擦干净后，再选涂其它答案标号。

回答非选择题时，将答案写在答题卡上，写在本试卷上无效。

3．考试结束后，将本试卷和答题卡一并交回。

一、选择题(本大题共7小题,每小题6分,共42分。

)1．下列关于植物的克隆技术的叙述，错误的是（）A．高度成熟和分化的植物细胞，仍保持了恢复到分生状态的能力B．由于遗传性的差异，不同种类植物细胞全能性的表达程度不相同C．适当配比的营养物质和生长调节剂可诱导愈伤组织的形成D．二倍体植物的花粉培养得到单倍体的过程属于器官培养2．下列关于细胞的结构与功能的相关叙述中，正确的是（）A．人成熟红细胞无线粒体，其有氧呼吸场所是细胞质基质B．植物细胞叶绿体产生的ATP能用于生长、物质运输等生理过程C．核糖体是蛋白质的“装配机器”，由蛋白质和RNA组成D．根尖分生区细胞中高尔基体与分裂后期细胞壁的形成有关3．哺乳动物受精卵的前几次分裂异常可能导致子细胞出现多核现象。

经研究发现，受精卵分裂时，首先形成两个相对独立的纺锤体，之后二者夹角逐渐减小，形成一个统一的纺锤体。

科研人员用药物N处理部分小鼠（2n=40）受精卵，观察受精卵第一次分裂，结果如图所示。

以下有关实验的分析中，合理的是A．两个纺锤体可能分别牵引来自双亲的两组染色体，最终合二为一B．细胞A最终可能将分裂成为1个双核细胞，1个单核细胞C．细胞B最终形成的子细胞中每个核的染色体条数为40D．药物N抑制两个纺锤体的相互作用，可能和马达蛋白的作用有关4．果蝇的红眼和白眼由一对等位基因（W/w）控制。

让一只纯合的红眼雌果蝇与一只白眼雄果蝇交配得到F1，F1全为红眼；F1雌雄个体随机交配得到F2。

为了确定W/w是位于常染色体上，还是位于X染色体上，下列数据中不需要统计的是（）A．F2中雌性个体的性状分离比B．F2中雄性个体的性状分离比C．F2中白眼果蝇的性别比例D．F2中红眼果蝇与白眼果蝇的比例5．下列有关高中生物实验的叙述，正确的是（）A．观察DNA和RNA在细胞中的分布时，应选择染色均匀、色泽较浅的区域进行观察B．低温诱导洋葱根尖细胞染色体加倍的实验中能观察到同源染色体联会现象C．利用口腔上皮细胞观察线粒体的实验中细胞的完整性遭到破坏D．探究培养液中酵母菌数量动态变化的实验中无需要使用显微镜6．下列有关生物体中有机物的叙述，正确的是（）A．含有C、H、O、N元素的有机物属于生物大分子B．DNA分子解旋后，空间结构改变，将失去其功能C．淀粉、蛋白质、脂肪在氧化分解时都能释放出能量D．性激素是基因表达的直接产物，可调节生命活动7．如图表示动物体温调节过程的部分示意图，图中①、②、③代表激素，当某人走出房间进入寒冷环境时，下列叙述错误的是A．血液中激素①、②、③的含量会增加B．骨骼肌受有关神经支配，不自主战栗C．激素③作用的靶器官只有甲状腺D．激素①、②对垂体的作用效应都为促进8．（10分）生物是一门实验学科，生物学经典实验有很多，下列相关叙述错误的是（）A．赫尔希和蔡斯实验所用材料噬菌体能在肺炎双球菌中增殖B．卡尔文用放射性同位素标记法研究CO2中的C在光合作用中的转移途径C．摩尔根运用假说一演绎法证明了控制果蝇红眼与白眼的等位基因位于X染色体上D．温特实验证明了胚芽鞘弯曲生长是由化学物质引起的，并把这种物质命名为生长素二、非选择题9．（10分）果蝇体内的Ⅳ号染色体多一条（三体）或少一条（单体）均可以存活并能够繁殖，没有Ⅳ号染色体的个体不能存活。

单克隆抗体制备过程中经过两次筛选.

单克隆抗体制备过程中经过两次筛选单克隆抗体制备过程中，总共有两次筛选，第一次筛选出杂交瘤细胞，第二次筛选出能产生特异性抗体的杂交瘤细胞，两次筛选的原理和方法是不相同的。

第一次筛选的原理与方法：细胞融合后，杂交瘤细胞的选择性培养是第一次筛选的关键。

普遍采用的HAT选择性培养液是在普通的动物细胞培养液中加入次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶核苷酸（T）。

其依据是细胞中的DNA合成有两条途径：一条途径是生物合成途径（“D途径”），即由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸，为DNA分子的合成提供原料。

在此合成过程中，叶酸作为重要的辅酶参与这一过程，而HAT培养液中氨基喋呤是一种叶酸的拮抗物，可以阻断DNA合成的“D途径”。

另一条途径是应急途径或补救途径（“S途径”），它是利用次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK）催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷生成相应的核苷酸，两种酶缺一不可。

因此，在HAT培养液中，未融合的效应B细胞和两个效应B细胞融合的“D途径”被氨基喋呤阻断，虽“S途径”正常，但因缺乏在体外培养液中增殖的能力，一般10d左右会死亡。

对于骨髓瘤细胞以及自身融合细胞而言，由于通常采用的骨髓瘤细胞是次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶缺陷型（HGPRT）细胞，因此自身没有“S途径”，且“D途径”又被氨基喋呤阻断，所以在HAT培养液中也不能增殖而很快死亡。

惟有骨髓瘤细胞与效应B细胞相互融合形成的杂交瘤细胞，既具有效应B细胞的“S途径”，又具有骨髓瘤细胞在体外培养液中长期增殖的特性，因此能在HAT培养液中选择性存活下来，并不断增殖。

第二次筛选的原理和方法：在实际免疫过程中，由于采用连续注射抗原的方法，且一种抗原决定簇刺激机体形成相对应的一种效应B淋巴细胞，因此，从小鼠脾脏中取出的效应B淋巴细胞的特异性是不同的，经HAT培养液筛选的杂交瘤细胞特异性也存在差异，所以必须从杂交瘤细胞群中筛选出能产生针对某一预定抗原快定簇的特异性杂交瘤细胞。

杂交瘤细胞的筛选方法

杂交瘤细胞的筛选方法杂交瘤细胞是一种重要的细胞系，它具有细胞免疫特性和高效的抗体分泌能力，因此在生物医学研究和生物制药领域有着广泛的应用。

在进行杂交瘤细胞的筛选时，需要注意一些关键的方法和步骤，以确保获得高质量的杂交瘤细胞系。

本文将介绍杂交瘤细胞的筛选方法，希望对相关研究工作有所帮助。

首先，进行细胞融合。

细胞融合是获得杂交瘤细胞的第一步，通常采用多种方法进行细胞融合，如聚乙二醇法、电脉冲法和病毒介导法等。

在进行细胞融合时，需要注意细胞的状态和融合条件的选择，以确保融合效率和细胞存活率。

其次，进行细胞筛选。

细胞融合后，需要对细胞进行筛选，以筛选出具有杂交瘤特性的细胞。

通常可以采用细胞培养基中添加抗生素的方法进行筛选，如添加含有肿瘤细胞毒素（如HAT）的培养基，以选择出对抗生素敏感的杂交瘤细胞。

接着，进行单克隆细胞的筛选和鉴定。

在获得杂交瘤细胞系后，需要进行单克隆细胞的筛选和鉴定，以确保所得到的细胞具有单一的抗体分泌能力。

通常可以采用限稀释法或流式细胞术等方法进行单克隆细胞的筛选和鉴定，以获得高效的抗体分泌细胞系。

最后，进行细胞的保存和扩增。

在获得理想的杂交瘤细胞系后，需要进行细胞的保存和扩增，以确保细胞系的长期稳定和高效的抗体分泌能力。

通常可以采用液氮保存和定期传代扩增的方法进行细胞的保存和扩增，以满足不同实验和生产的需要。

总之，杂交瘤细胞的筛选是一个关键的步骤，需要注意细胞融合、细胞筛选、单克隆细胞的筛选和鉴定，以及细胞的保存和扩增等关键方法和步骤。

希望本文介绍的方法对相关研究工作有所帮助，也希望在未来的研究和应用中能够取得更好的效果。

hat培养基筛选杂交瘤细胞的原理

hat培养基筛选杂交瘤细胞的原理
筛选杂交瘤细胞原理是一种用来检测细胞的方法，它可以帮助我们发现不同的基因变化以及个体之间的活动。

筛选杂交瘤细胞使用的荧光技术是一种将少量物质转变成荧光信号的技术。

通过荧光技术，科学家们可以观察一个特定对照组，以及另一个不同的细胞群体。

在这种情况下，研究人员可以观察杂交瘤细胞，并尝试判断去区分哪些细胞是真正的杂交瘤细胞，哪些是质变或未发生突变的细胞。

筛选杂交瘤细胞也可以使用一种称为“hat select”的技术，它是一种在细胞的遗传学性质上控制细胞突变的技术。

“hat select”使用的原理是在受精卵上插入一种含有新基因的病毒，该病毒具有抗生素抵抗力的能力，病毒的基因将与卵染色体的基因结合，从而杂交瘤细胞将具备抗生素抵抗力的可能性。

不同的抗生素将被用来筛选不同的基因变异，并确定有几个药物抵抗力的基因变异。

筛选杂交瘤细胞是一种非常重要的手段，它可以为我们提供有用的信息，以便进行细胞的诊断和治疗。

这种技术的使用不仅可以使细胞的诊断更加准确，而且可以帮助科学家们更好地理解细胞的行为，以及特定紊乱的产生。

如何筛选杂交瘤细胞-华采豆

如何筛选杂交瘤细胞在单克隆抗体制备过程中，有两次的筛选过程，第一次是筛选出杂交瘤细胞（用选择性培养基），第二次是进一步选出能生产我们需要的抗体的杂交瘤细胞。

利用杂交瘤技术制备单克隆抗体的基本原理是：根据以下三个原则：①一种淋巴细胞克隆只产生一种抗体；②细胞荣恶化技术产生的杂交瘤细胞可以保持双方亲代细胞的特性；③利用代谢缺陷补救机理筛选出杂交瘤细胞，并进行克隆化，然后大量培养增殖，制备所需的单克隆抗体。

单克隆抗体制备过程中，总共有两次筛选，第一次筛选出杂交瘤细胞，第二次筛选出能产生特异性抗体的杂交瘤细胞，两次筛选的原理和方法是不相同的。

第一次筛选的原理与方法：细胞融合后，杂交瘤细胞的选择性培养是第一次筛选的关键。

普遍采用的HAT选择性培养液是在普通的动物细胞培养液中加入次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶核苷酸（T）。

其依据是细胞中的DNA合成有两条途径：一条途径是生物合成途径（“D途径”），即由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸，为DNA分子的合成提供原料。

在此合成过程中，叶酸作为重要的辅酶参与这一过程，而HAT培养液中氨基喋呤是一种叶酸的拮抗物，可以阻断DNA合成的“D途径”。

另一条途径是应急途径或补救途径（“S 途径”），它是利用次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK）催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷生成相应的核苷酸，两种酶缺一不可。

因此，在HAT培养液中，未融合的效应B细胞和两个效应B细胞融合的“D 途径”被氨基喋呤阻断，虽“S途径”正常，但因缺乏在体外培养液中增殖的能力，一般10d左右会死亡。

对于骨髓瘤细胞以及自身融合细胞而言，由于通常采用的骨髓瘤细胞是次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶缺陷型（HGPRT）细胞，因此自身没有“S途径”，且“D途径”又被氨基喋呤阻断，所以在HAT培养液中也不能增殖而很快死亡。

惟有骨髓瘤细胞与效应B细胞相互融合形成的杂交瘤细胞，既具有效应B细胞的“S途径”，又具有骨髓瘤细胞在体外培养液中长期增殖的特性，因此能在HAT培养液中选择性存活下来，并不断增殖。

免疫学与检验重要知识点汇总

免疫学与检验重要知识点汇总免疫应答主要分为哪几个阶段？1）识别阶段2）活化和增值阶段3）免疫效应中枢免疫器官和外周免疫器官有哪些器官组成？各有什么功能？1）中枢免疫器官：免疫细胞发生、分化、成熟的场所，如骨髓，胸腺2)外周免疫器官：免疫细胞产生应答的场所。

如脾脏，淋巴结，黏膜，扁桃体等。

T细胞、B细胞和NK细胞的主要功能分别是什么？1）T细胞：介导细胞免疫，辅助体液免疫。

2）B细胞：产生体液免疫3）NK细胞：介导天然免疫，发挥细胞毒作用。

根据作用方式及其特点的不同，机体存在两类免疫简述各自的概念和特征？1)先天性免疫或固有性免疫，是个体出生是就具有的天然免疫，可通过遗传获得，是机体在长期进化过程中逐渐建立起来的主要针对入侵病原体的天然防御功能。

其主要特征是反应迅速，针对外来异物的范围较广，不针对某个特定异物抗原，也称非特异性免疫。

2)适应性免疫，是个体出生后，接触到生活环境中的多种异物抗原，并在不断刺激中逐渐建立起来的后天免疫，也称获得性免疫。

其主要特征是针对某个特定的异物抗原而产生免疫应答，开始的应答过程比较缓慢，一旦建立清除该抗原的效率很高，特异性很强，也称特异性免疫。

简述抗原抗体反应的原理。

答：抗原与抗体能够特异性结合是基于抗原表位与抗体超变区分子间的结构互补性与亲和性，这种特性是由抗原、抗体分子空间构型所决定的，它们之间的结合是抗原表位与抗体超变区沟槽分子表面的结合简述抗原抗体反应的类型。

答：抗原抗体反应分为五种类型：①颗粒性抗原与相应抗体结合所产生的凝集反应；②可溶性抗原与相应抗体结合所产生的沉淀反应；③抗原抗体结合后激活补体所致的细胞溶解反应；④细菌外毒素或病毒与相应抗体结合所致的中和反应；⑤免疫标记的抗原抗体反应等。

什么是带现象答：在抗原抗体反应等价带前后，由于抗体或抗原过量(形成前带或后带)，上清液中可测出游离的抗体或抗原，形成的沉淀物少，不出现可见反应，这种现象在做血清学试验时称为带现象。

融合细胞的筛选方法

融合细胞的筛选方法
融合细胞是一种重要的细胞学技术，它可以将两个不同的细胞融合成一个细胞，从而产生新的细胞类型。

这种技术在生物医学研究中有着广泛的应用，例如用于生产单克隆抗体、研究细胞信号传导、研究病毒感染等。

然而，融合细胞的筛选是一个非常关键的步骤，因为只有筛选出合适的融合细胞才能得到理想的结果。

下面介绍几种常用的融合细胞筛选方法。

1. HAT选择法
HAT选择法是一种常用的融合细胞筛选方法。

它利用了两种细胞的不同特性，即骨髓瘤细胞可以在含有氨基酸代谢抑制剂（H）和嘌呤类似物（A）的培养基中生长，而淋巴细胞则不能。

因此，将两种细胞融合后，只有融合细胞可以在HAT培养基中生长，从而实现筛选。

2. GFP筛选法
GFP筛选法是一种利用荧光蛋白（GFP）标记的融合细胞筛选方法。

在融合细胞中，只有成功融合的细胞才能表达GFP，从而实现筛选。

这种方法可以通过荧光显微镜观察，也可以通过流式细胞术进行高通量筛选。

3. 紫杉醇选择法
紫杉醇选择法是一种利用化学物质紫杉醇（Taxol）筛选融合细胞的方法。

紫杉醇可以抑制细胞有丝分裂，从而使得只有融合细胞可以在含有紫杉醇的培养基中生长。

这种方法可以用于筛选细胞融合后的杂交瘤细胞。

融合细胞的筛选是一项非常重要的工作，不同的筛选方法适用于不同的实验需求。

在进行融合细胞实验时，需要根据实验目的选择合适的筛选方法，并进行严格的实验控制，以确保实验结果的可靠性。

HAT培养基筛选杂交瘤细胞的原理

HAT（一）培养基筛选杂交瘤细胞的原理HAT培养基是指含有次黄嘌呤（hypoxantin）、氨基蝶呤（aminopterin）和胸腺嘧啶脱氧核苷（thymidin）三种物质的细胞培养基。

1.细胞内合成DNA原料的核苷酸形成的途径（1）起始合成途径（de novo pathway）：由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸，为DNA分子的合成提供原料。

在此合成过程中，叶酸作为重要的辅酶参与这一过程。

（2）中间合成途径（salvage pa-thway）：利用次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK）催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷生成相应的核苷酸。

2.利用HAT培养基筛选杂交瘤细胞（1）经融合后细胞将以多种形式出现：融合的脾细胞—瘤细胞、融合的脾细胞—脾细胞、融合的瘤细胞—瘤细胞、未融合的脾细胞、未融合的瘤细胞以及细胞的多聚体形式等。

正常的脾细胞在培养基中存活仅5～7天，无需特别筛选，细胞的多聚体形式也容易死去。

而未融合的瘤细胞则需进行特别的筛选去除。

（2）融合所用的瘤细胞是经毒性培养基选出的中间合成途径缺失株（例如嘌呤的中间合成途径缺失株和嘧啶的中间合成途径缺失株），即只有起始合成途径。

效应B细胞虽不增殖，但有两条DNA合成途径。

（3）氨基蝶呤是叶酸的拮抗剂，可阻碍起始合成途径。

HAT培养基中含有氨基蝶呤时，细胞只有中间合成途径，所以必须供给核苷酸。

杂交瘤细胞的起始合成途径被氨基喋呤阻断，但可通过中间合成途径利用以培养基中次黄嘌呤和胸腺嘧啶脱氧核苷为原料进行合成。

而缺失中间合成途径的瘤细胞，失去增殖能力。

从而选择出杂交瘤细胞。

1/1。

单克隆抗体制备过程中经过两次筛选[1]

单克隆抗体‎制备过程中‎经过两次筛‎选单克隆抗体‎制备过程中‎，总共有两次‎筛选，第一次筛选‎出杂交瘤细‎胞，第二次筛选‎出能产生特‎异性抗体的‎杂交瘤细胞‎，两次筛选的‎原理和方法‎是不相同的‎。

第一次筛选‎的原理与方‎法：细胞融合后‎，杂交瘤细胞‎的选择性培‎养是第一次‎筛选的关键‎。

普遍采用的‎H A T选择‎性培养液是‎在普通的动‎物细胞培养‎液中加入次‎黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶‎核苷酸（T）。

其依据是细‎胞中的DN‎A合成有两‎条途径：一条途径是‎生物合成途‎径（“D途径”），即由氨基酸‎及其他小分‎子化合物合‎成核苷酸，为DNA分‎子的合成提‎供原料。

在此合成过‎程中，叶酸作为重‎要的辅酶参‎与这一过程‎，而HA T培‎养液中氨基‎喋呤是一种‎叶酸的拮抗‎物，可以阻断D‎N A合成的‎“D途径”。

另一条途径‎是应急途径‎或补救途径‎（“S途径”），它是利用次‎黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸‎核苷转移酶‎（HGPRT‎）和胸腺嘧啶‎核苷激酶（TK）催化次黄嘌‎呤和胸腺嘧‎啶核苷生成‎相应的核苷‎酸，两种酶缺一‎不可。

因此，在HA T培‎养液中，未融合的效‎应B细胞和‎两个效应B‎细胞融合的‎“D途径”被氨基喋呤‎阻断，虽“S途径”正常，但因缺乏在‎体外培养液‎中增殖的能‎力，一般10d‎左右会死亡‎。

对于骨髓瘤‎细胞以及自‎身融合细胞‎而言，由于通常采‎用的骨髓瘤‎细胞是次黄‎嘌呤—鸟嘌呤磷酸‎核苷转移酶‎缺陷型（HGPRT‎）细胞，因此自身没‎有“S途径”，且“D途径”又被氨基喋‎呤阻断，所以在HA‎T培养液中‎也不能增殖‎而很快死亡‎。

惟有骨髓瘤‎细胞与效应‎B 细胞相互‎融合形成的‎杂交瘤细胞‎，既具有效应‎B细胞的“S途径”，又具有骨髓‎瘤细胞在体‎外培养液中‎长期增殖的‎特性，因此能在H‎A T培养液‎中选择性存‎活下来，并不断增殖‎。

第二次筛选‎的原理和方‎法：在实际免疫‎过程中，由于采用连‎续注射抗原‎的方法，且一种抗原‎决定簇刺激‎机体形成相‎对应的一种‎效应B淋巴‎细胞，因此，从小鼠脾脏‎中取出的效‎应B淋巴细‎胞的特异性‎是不同的，经HA T培‎养液筛选的‎杂交瘤细胞‎特异性也存‎在差异，所以必须从‎杂交瘤细胞‎群中筛选出‎能产生针对‎某一预定抗‎原快定簇的‎特异性杂交‎瘤细胞。

生物技术制药笔记,期末考试题

1、真核，原核，病毒有什么区别吗？答：三者的共同点是:（1）均有严整的结构。

（2）均能以自身特定的方式繁殖后代。

（3）均有特定的遗传物质。

（4）在繁殖过程当中均能体现遗传和变异现象。

（5）它们的遗传物质都是核酸。

(注意"朊病毒”不属于“病毒”，其只含有蛋白质)三者的不同点:（1）原核生物与真核生物均为细胞结构的生物，病毒为无细胞结构的生物。

（2）原核生物(如细菌、放线菌、蓝藻、支原体等)和真核生物(如动物、植物、真菌等)的主要差别在于前者的结构和功能单位是原核细胞，后者的结构和功能单位是真核细胞。

原核细胞结构简单，无成型的细胞核，细胞质中缺少复杂的细胞器(只有核糖体这中细胞器)真核细胞结构复杂，具有细胞核，细胞质中有分工精细，结构复杂多样的细胞器(如线粒体、叶绿体、高尔基体、内质网、核糖体、中心体、溶酶体、液泡等)（3）病毒无细胞结构，自身没有代谢所需的酶系统及其遗传信息表达系统，从而没有独立的新陈代谢能力，只能专-地寄生在活的寄主细胞内部生活繁殖。

原核生物和真核生物具有相对独立的生命结构体系，能独立地进行新陈代谢。

对寄生生活的原核生物和真核生物而言(如肺炎球菌、绿脓杆菌、蛔虫等)它们的寄生环境也通常是细胞外。

它们的代谢活动还是在自身的细胞内部进行的。

（4）原核生物和真核生物的遗传物质均细胞结构的生物其遗传物质均为DNA,病毒的遗传物质为DNA或RNA,所以病毒根据遗传物质的差:异可分为DNA病毒和RNA病毒两大类。

核糖核酸和脱氧核糖核酸结构的不同有什么影响？答：（1）含有的五碳糖不同(从名字就可以看出)（2）含有的碱基不完全相同，前者特有尿嘧啶，后者特有胸腺嘧啶。

（3）结构一般不同，前者多为双螺旋结构，后者多为单链结构（4）功能不同，前者可起催化等功能，后者作为遗传物质HAT培养基的筛选原理为：DNA合成途径有生物合成途径与应急合成途径两种，HAT培养基中含有次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶核苷酸（T）等物质，氨基喋呤可以对DNA 的生物合成途径进行阻断，骨髓瘤细胞会因为生物合成途径被阻断且自身缺乏应急合成途径导致不能增殖进而快速的死亡；而B淋巴细胞因缺乏体外增殖的能力，一般在10天左右死亡；杂交瘤细胞具有体外增殖能力且由于次黄嘌呤与胸腺嘧啶核苷酸的存在，可以通过应急途径合成DNA并在HAT培养基中正常生长，不会死亡。

hat筛选杂交瘤细胞原理

hat筛选杂交瘤细胞原理嗨，亲爱的小伙伴！今天咱们来唠唠HAT筛选杂交瘤细胞这个超有趣的事儿。

咱们先得知道啥是杂交瘤细胞呢。

简单来说呀，就是把一种能无限增殖的细胞（像骨髓瘤细胞）和一种能产生特异性抗体的细胞（比如B淋巴细胞）融合在一起，这样就得到了杂交瘤细胞。

这个杂交瘤细胞可厉害啦，它既有骨髓瘤细胞无限增殖的本事，又有B淋巴细胞产生特异性抗体的能力。

那HAT是啥呢？HAT是一种特殊的培养基，它里面有三种关键的成分，分别是次黄嘌呤（H）、氨基蝶呤（A）和胸腺嘧啶核苷（T）。

这就像是一场特殊的考验，只有符合条件的细胞才能在这个培养基里快乐地生长。

对于骨髓瘤细胞来说呢，它有个小毛病。

正常的细胞可以自己合成DNA的一些原料，但是骨髓瘤细胞在氨基蝶呤（A）存在的情况下，它自己合成DNA的路就被堵住了。

因为氨基蝶呤会阻断细胞内嘌呤和嘧啶合成的主要途径。

那骨髓瘤细胞要想在HAT培养基里生长，就得走另外一条路，也就是利用次黄嘌呤 - 鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK）来利用次黄嘌呤（H）和胸腺嘧啶核苷（T）合成DNA。

可是呀，很多骨髓瘤细胞是缺乏HGPRT酶的，所以在HAT培养基里，它就没法生长啦，就像一个找不到路的小迷糊，只能慢慢被淘汰掉。

再说说B淋巴细胞呢，B淋巴细胞本身是正常的细胞，它有HGPRT酶，理论上可以在HAT培养基里生长。

但是呢，B淋巴细胞有个小弱点，它不能无限增殖呀，在培养的过程中，它自己就慢慢不行了，就像一个小蜡烛，燃烧一会儿就熄灭了。

而咱们的杂交瘤细胞就不一样喽。

杂交瘤细胞是融合了骨髓瘤细胞和B淋巴细胞的优点。

它从B淋巴细胞那里得到了HGPRT酶，这样就可以在氨基蝶呤存在的情况下，利用次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷来合成DNA啦。

同时呢，它又从骨髓瘤细胞那里继承了无限增殖的能力。

所以在HAT培养基里，杂交瘤细胞就像一个超级小战士，能够茁壮成长。

其他不符合条件的细胞，就都被这个特殊的培养基给筛选掉了。

杂交瘤细胞制备流程

杂交瘤细胞制备流程
杂交瘤细胞制备流程简述如下：
1. 免疫动物：首先将特定抗原注射到小鼠体内，激活其免疫系统产生特异性抗体的B淋巴细胞。

2. 细胞融合：从小鼠脾脏中分离出已免疫过的B淋巴细胞，与具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞在特定条件下（如聚乙二醇诱导）进行融合。

3. 选择培养：将融合后的细胞接种于选择培养基上，如HAT培养基，该培养基可使非融合细胞和自身融合的骨髓瘤细胞死亡，仅允许杂交瘤细胞存活及增殖。

4. 单克隆筛选：通过有限稀释法或克隆环等方法进一步筛选单个杂交瘤细胞克隆，确保每个克隆来源单一，能稳定分泌目标抗体。

5. 抗体检测与鉴定：对获得的单克隆杂交瘤细胞株进行抗体特性分析，确认其分泌的抗体具有所需特异性和亲和力。

6. 扩增保存：成功筛选出的杂交瘤细胞株进行大量扩增，并长期冷冻保存以供后续研究和生产使用。

画线单克隆实验报告

一、实验目的1. 学习并掌握单克隆抗体制备方法。

2. 掌握单克隆抗体纯化技术。

3. 了解单克隆抗体的应用。

二、实验原理单克隆抗体（Monoclonal Antibody，MAb）是由单一B细胞克隆产生的高度特异性的抗体。

它具有特异性强、亲和力高、纯度高、稳定性好等特点，在医学、生物技术等领域具有广泛的应用。

本实验通过动物免疫、细胞融合、筛选、克隆化等步骤，制备出针对特定抗原的单克隆抗体。

三、实验材料1. 动物：小鼠（Balb/c系）2. 抗原：待检抗原3. 细胞株：小鼠骨髓瘤细胞（SP2/0）4. 培养基：RPMI-1640培养基、完全培养基、半量培养基5. 试剂：FCS、聚乙二醇（PEG）、HAT培养基、HAT筛选培养基、抗体纯化试剂盒等6. 仪器：离心机、CO2培养箱、倒置显微镜、酶标仪等四、实验方法1. 动物免疫：取小鼠，按抗原免疫程序进行免疫，免疫间隔时间为2周，共免疫3次。

2. 细胞融合：将免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞按一定比例混合，加入聚乙二醇（PEG）进行细胞融合。

3. 细胞筛选：将融合后的细胞进行HAT培养基培养，筛选出杂交瘤细胞。

4. 克隆化：将筛选出的杂交瘤细胞进行克隆化培养，获得单克隆细胞。

5. 抗体检测：通过ELISA方法检测单克隆细胞的抗体活性，筛选出阳性克隆。

6. 单克隆抗体纯化：采用抗体纯化试剂盒对阳性克隆进行纯化。

五、实验结果1. 免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合成功，得到杂交瘤细胞。

2. 在HAT培养基中筛选出杂交瘤细胞，克隆化培养得到单克隆细胞。

3. 通过ELISA方法检测，筛选出针对待检抗原的阳性克隆。

4. 单克隆抗体纯化成功，纯度达到90%以上。

六、实验讨论1. 本实验成功制备了针对待检抗原的单克隆抗体，为后续的抗体应用奠定了基础。

2. 在细胞融合过程中，采用适当比例的脾细胞与骨髓瘤细胞可以提高融合率。

3. 在筛选杂交瘤细胞时，HAT培养基的浓度和培养时间对筛选效果有较大影响。