植物生理实验报告

学号：
.
植物生理学实验报告
学院名称：生物科学与技术
年级班别：硕-植物11班
*名：**
2011年3月7号
实验一红外线CO2气体分析仪测定光合速率
一、实验目的
1. 学习并掌握微量红外气体分析仪的工作原理和使用方法。

2. 使用微量红外气体分析仪测定植物光合速率。

二、实验原理
在密闭的系统中，由于同化室中的叶片进行光合后，系统中的CO2浓度不断下降，可用单位时间内同化室中CO2浓度的减少量或CO2浓度减少量所需的时间，根据叶片面积、同化室体积，计算光合速率。

许多由异原子组成的气体分子对红外线都有特异的吸收带。

CO2的红外吸收带有四处，其吸收峰分别在2.69μm、2.77μm、4.26μm和14.99μm处，其中只有4.26μm的吸收带不与H2O的吸收带重叠，红外仪内设置仅让4.26μm红外光通过的滤光片，当该波长的红外光经过含有CO2的气体时，能量就因CO2的吸收而降低，降低的多少与CO2的浓度有关，并符合朗伯—比尔定律（A=lg(1/T)=Kbc 其中A为吸光度，T为透射比，是透射光强度比上入射光强度，c为吸光物质的浓度，b为吸收层厚度）。

分别供给红外仪含与不含CO2的气体，红外仪的检测器便可通过检测红外光能量的变化而输出反映CO2浓度的电讯号。

三、分析检测原理
红外线通过两个气室，一个是充以不断流过的被测气体的测量室，另一个是充以无吸收性质的背景气体的参比室。

工作时，当测量室内被测气体浓度变化时，吸收的红外线光量发生相应的变化，而基准光束(参比室光束)的光量不发生变化。

从二室出来的光量差通过检测器，使检测器产生压力差，并变成电容检测器的电信号。

此信号经信号调节电路放大处理后，送往显示器以及总控的CRT显示。

该输出信号的大小与被渊组分浓度成比例。

接收室内充以样气中的待测组分，两个接收室中间用一个薄的金属膜隔开，在两测压力不同时膜片可以变形产生位移，膜片的一侧放一个固定的圆盘型电极。

可动膜片与固定电极构成了一个电容变进器的两极。

整个结构保持严格的密封，两接收气室内的气体为动片薄膜隔开，但在结构上安置一个大小为百分之几毫米的小孔，以使两边的气体静态平衡。

辐射光束通过参比室、测量室后，进入检测器的接收室。

被接收室里的气体吸收，气体温度
升高，气体分子的热运动加强，产生的热膨胀形成的压力增大。

当测量室内通入零点气(N2)时，来自两气室的光能平衡，两边的压力相等，动片薄膜维持在平衡位置，检测器输出为零。

当测量室内通入样气时，测量边进入接收室的光能低于参比边的，使测量边的压力减小，于是薄膜发生位移，故改变了两极板问的距离，也改变了电容量C。

于是输出一个与待测组分浓度成比例的电信号。

四、材料与方法
1. 植物材料：百合竹（Dracaena reflexa），龙舌兰科。

2. 使用仪器：微量红外气体分析仪（图1）。

图中仪器型
号FF1-FQ-B。

图1 微量红外线气体分析仪3. 实验步骤：
（1）按要求将参比管和工作管气路系统交叉连接起来，一端接到气泵，一端连接到充满NaOH颗粒的透明玻璃长管，使气路闭合。

（2）将作用开关打到A（预热档），接通电源，打开红外仪电源预热一段时间，打开气泵电源，仪表盘指示的CO2浓度缓慢下降，直到零点附近，如果偏离零点，需要将作用开关达到C（工作档/调零档）调零。

仪表盘上由上向下分别标有4套刻度值，其最大数值依次为600ppm,300ppm,150ppm和75ppm，它们在步进开关分别对准1，2，3和4时使用，误差从5ppm，2.5ppm，1.25ppm到0.75ppm。

调零校准仪器时需要由粗到细，再由细到粗。

（3）调零后，将参比管进气口和出气口相连以封闭参比管，将工作管进气口接高浓度CO2气（接外界大气），另一端接气泵，再通入密闭透明同化室，使气流流过同化室中的植物，最后回到仪器中检测。

未照射强光，稳定一段时间测定CO2浓度C1。

（4）照射光强约6000Lux的强光，观察CO2浓度变化，并测定CO2稳定时的浓度C2。

五、实验结果
外界大气压刚刚充入时，在没有照光情况下，测得CO2浓度C1为243ppm。

照射强光后，3min 后CO2浓度C2下降到190ppm，5min 后CO2浓度C2下降到170ppm，10min
后CO2浓度C2下降到158ppm。

根据：
Pn＝ΔC×V×273×P/[Δt×S×22.4×(273＋t)×0.1013]
其中Pn为光合速率（μmol/m2s），ΔC为CO2浓度差C1-C2(ppm)，Δt为测定时间（s），S为叶片面积（m2），V为封闭同化室（包括气路系统）体积（L），t为同化室的温度，P 为大气压（Mpa），按照同化室体积15*15*30cm3，空气大气压1个标准大气压0.1MPa，测定时间30min，叶面积单叶（10*2*0.958cm2，其中叶面积指数取花生的0.958）与整株植物叶片数量（约300）乘积，同化室温度25℃测算，得出百合竹的光合速率为3.98μmol/m2s。

六、分析与讨论
在没有照光情况下，测得CO2浓度C1为243ppm。

照射强光后，3min 后CO2浓度C2下降到190ppm，5min 后CO2浓度C2下降到170ppm，10min后CO2浓度C2下降到158ppm，说明在光照过程中CO2不停地被消耗，植物光合作用吸收了CO2。

吸收的CO2量能够反应植物光合作用的状况。

进而通过相关公式计算出其光合作用速率。

说明了CO2的消耗是与光合作用速率相关的。

利用这种方法测定植物光合速率时需要考虑同化室体积，因为同化室体积与植物株型不符，如同化室远大于植物，则测算出的光合速率可能偏高。

测定时间并不是越长越好，因为长时间处于密闭的同化室，叶片蒸腾、光呼吸等生理变化会对测量产生干扰，比如强光照射时间长可能产生一定热量，使同化室温度上升。

另外气路的密闭性也能造成测量误差，因为如果仪器气路漏气，会使同化室中植物吸收量计算值偏大，导致过高估计植物光合速率。

实验二离心薄层色谱法分离叶绿素
一、实验目的
1.学习并掌握植物叶绿素提取、分离和吸收光谱曲线的绘制。

2.学习并掌握旋转薄层层析法。

二、实验原理
离心薄层色谱(centrifugal thin layer chromatography，CTLC)属于薄层色谱的一种，又叫旋转薄层色谱，是一种离心型连续洗脱的环形薄层色谱分离技术，主要是在经典的薄层色谱基础上运用离心力促使流动相加速流动。

离心力用于分离，可以减少破坏，对沸点高、分子量大的化合物有利，可用于分离100mg左右的样品。

植物叶绿素a和叶绿素b在有机溶剂中溶解度不同，根据叶绿素a和b在固定相和流动相之间的吸附、分配作用的不同，再加上离心加速度的作用，使两组分之间原有的比移率（如果溶剂从原点渗透到距离a，位于原点的物质从原点向前移动到b，那么b/a值为这种物质的比移率）差异加大，从而提高了分离效果。

三、实验材料与方法
1. 植物材料：油松（Pinus tabulaeformis），松科。

（图1）
2. 使用仪器：圆板薄层仪（图2）。

图1 油松图2 圆板薄层仪
3. 实验步骤：
（1）叶绿素提取。

称取油松10g，剪碎，放入研钵中，加入少许CaCO3和石英砂，再加
入适量丙酮充分研磨，静置，浸提液过滤到分液漏斗中，加入30ml石油醚，100ml 10%NaCl 溶液使两相均匀混合，静置分层后弃下层，重复萃取1次，色素提取液备用。

（2）硅胶板制备。

称取30g硅胶，1.2g石膏70ml水，充分混匀后制版。

室温下放置12h，放80℃烘箱烘3h，取出层析板，冷却后刮板，除去中心及边缘多余硅胶，板固定在旋转薄层仪上，固定好板后盖上玻璃，卡住。

（3）先使用上样泵（调到10）吸取纯石油醚，润湿薄板。

当由圆心润湿到圆板的1/3时，吸取石油醚和丙酮8：2混合液，将上样泵调到5上样。

经过约30min，可见叶绿素a和b 分开，并分别收集叶绿素a和b谱带的洗脱产物。

（4）在分光光度计下测量，绘制出叶绿素a和b的吸收曲线。

四、实验结果
在叶绿素提取中叶绿素提取液在有机相，蛋白等杂质在水相，经分液漏斗弃下层水相就得到墨绿色的叶绿素溶液，在薄层仪上展层较好，叶绿素a、叶绿素b、叶黄素和胡萝卜素分离清晰，最外层为叶绿素a。

洗脱下来的色素用试管收集，叶绿素a和b颜色具有明显差别，叶绿素a为蓝绿色，叶绿素b为黄绿色。

根据标准的叶绿素吸收光谱图（图3），其中实线为叶绿素a曲线，虚线为叶绿素b曲线，看到它们各有两个明显的吸收峰。

叶绿素a最大吸收峰在430nm左右，另一吸收峰在662nm；叶绿素b最大吸收峰在450nm左右，另一吸收峰在642nm。

图3 叶绿素在乙醚中的吸收曲线
图4 测定叶绿素的吸收曲线
五、分析与讨论
从叶绿素提取的全过程以及分离得到的叶绿素a和b的流出液颜色判断，叶绿素提取浓度高，分离效果好。

但是分光光度计测定的吸收曲线中，叶绿素b的吸收峰出现位置与实际不符，叶绿素吸收峰值也不符合实际情况。

叶绿素a和叶绿素b提取浓度低的可能原因：一是提取过程中丙酮加入量不大适合，在研磨过程中叶绿素没有很好地溶解到丙酮中，最终只有少量叶绿素进入下一步操作；二是可能由于在研磨过程中加入的石英砂较少，材料又不易研磨，导致研磨不充分，在丙酮提取完后发现残渣颜色依旧很深，说明叶绿素提取不很成功。

实验三压力室法测定植物PV曲线
一、实验目的
1. 学习并掌握压力室法测定植物水势的原理和方法。

2. 用植物PV曲线研究质壁分离时植物水势状况，可用于植物抗旱性的测定。

二、实验原理
植物内水势由根系向地上部分的茎、叶逐渐递减，叶肉细胞中水势高于大气水势，由于水势的梯度，植物不断从根向地上部分输送水分，使根内水势下降，根从土壤中吸收水分。

植物蒸腾作用不断失水，产生蒸腾拉力，蒸腾拉力与根压共同作为植物吸水的动力。

水势等于溶质势（渗透势）、衬质势和压力势之和。

由于导管中水溶质势与张力比很低，水分在导管中的运输渗透势接近零，因此导管中水势近似等于水的压力势。

当枝条被剪断，导管中连续的水柱被截断，剪口上部水柱在蒸腾拉力作用下上移，剪口下的水柱受重力以及大气压的力液面下降。

压力室法就是将植物剪口上部枝条倒着竖直固定在密闭压力室中，通过外加高压气体将水柱压出枝条。

当压力不断增大，压出的水的总体积也不断增加，直到难以压出水来，称量得到排空导管水的枝条鲜重以及烘干的干重，绘制枝条中水分体积对外加压力的曲线，称为植物PV曲线。

植物PV曲线是指植物枝叶样品吸水饱和后，随压力室中连续加压渗透水量的体积与相应平衡压倒数之间的变化曲线。

应用PV曲线可测定植物细胞在膨压为0（质壁分离）时的渗透势、相对水含量和相对渗透水含量，以及饱和含水时的渗透势、束缚水含量、膨压随叶水势下降而降低的速率b值和组织细胞总体弹性模量等水分参数。

这些PV曲线的水分参数能够指示植物对干旱逆境的响应，为植物抗旱生理机制研究提供依据。

三、材料与方法
1. 植物材料：红掌（Anthurium andraeanum），天南星科。

2. 使用仪器：便携式植物水势压力室。

（图1）
图1 便携式植物水势压力室图2 压力室剖面图
3. 实验步骤：
（1）取样：自红掌植株上采集鲜样。

（2）数据获得：确认压力室开关和仪器进气口关闭，然后打开高压气瓶，待气压升到2000pa 时关闭气瓶。

（3）将植物枝条倒着直立固定在压力室中，旋紧压力室盖子。

将仪器的高压气开关打开，观察枝条断面发生的变化，直到枝条中的水被高压挤压出来，读取压力表盘上数值，此时的压力值为初始平衡压。

（4）接着测定不同压力下的累积水体积。

测量时压力在1.0Mpa以下，每次增加0.2Mpa，1.0Mpa以上，每次增加0.5Mpa。

每次加压后停留5min，并用事先称量干重的棉花棒吸收挤压出的水，然后放掉压力室中的气体，重新将压力打到之前的数值，再停止5min。

每个压力下测量结束，称量吸收了从植物中挤压出的水的棉花棒，并记录。

这样逐一测量，直到压力增加到4Mpa。

（5）由于除了自由水，植物枝叶中还有束缚水，因此测量结束后必须称取枝条不含自由水的鲜重，并将其放入烘箱，80℃烘干24h，至恒重。

（6）绘制V-P曲线，用图解法求出渗透水原初含量、初始质壁分离渗透势、充分紧张组织中的原始渗透势、平均膨压、非渗透水量和体积弹性模量。

4. 数据分析：
以平衡压的倒数为纵坐标，不同平衡压下的渗透水量为横坐标，渗透水量数据输入x 轴列，将所有平衡压的倒数值输入y1列，将进行直线回归的平衡压的倒数值（变幅相近的最后几个连续观测数据和紧邻的一个明显发生拐离的数据组成，这样既满足了幂函数和回归直线拐点的数学性质，又能得到比较满意的结果）输入y2列渗透水量相应的位置，作散点图，然后分别拟合幂函数和线性函数并得出拟合方程和决定系数。

四、实验结果
植物的总重为3.7877g，烘干之前为3.0331g，烘至恒重为1.1896g。

根据上述实验步骤测定的PV曲线如图3，渗出水原初含量为-0.10Mpa，初始质壁分离渗透势为-1.50Mpa，根据最后5个点进行线性回归，得到回归曲线（图4），在横轴的截距即为所有的自由水的量，经过计算自由水为1.1299g。

烘干得到恒重为1.1896g，经过计算，束缚水为1.4682g。

植物组织含水量：68.59%。

图3 大叶黄杨PV曲线
图4 大叶黄杨PV曲线（线性回归部分）
五、分析和讨论
由PV曲线看出细胞质壁分离之前植物组织排出水的体积随外界压力变化呈幂函数关系变化，质壁分离发生后二者关系为线性。

因为未发生质壁分离时，细胞壁对细胞具有一定压力，细胞水势等于这细胞壁压力和渗透压之和。

质壁分离后，细胞壁对细胞的压力消失，细胞渗透势只与外界压力有关，细胞失去水的体积随外界压力的增加而增大，且变化为线性的。

不同植物或同一植物不同器官在不同的环境水分状况下具有不同的PV曲线，其中反映出的相关参数能够说明植物耐干旱的程度，水分亏缺后恢复的等情况。

细胞质壁分离出现的快慢、发生质壁分离所需的渗透压，以及细胞体积弹性模量能够反应植物对水分胁迫的适应能力和水分亏缺后的恢复能力。

实验四生物氧测定仪测定生物呼吸速率
一、实验目的
1. 学习并掌握生物氧测定仪的原理及操作过程。

2. 制作生物氧测定仪测定植物呼吸速率图谱。

二、实验原理
氧电极是为测定水中溶解氧含量而设计的一种极谱电极。

目前通用的是薄膜氧电极，又称Clark电极，由镶嵌在绝缘材料上的银极（阳极）和铂极（阴极）构成，电极表面覆盖一层厚约20~25μm的聚四氟乙烯或聚已烯薄膜，电极和薄膜之间充以KCl溶液作为支持电解质。

由于水中溶解氧能透过薄膜而电解质不能透过，因而排除了被测溶液中各种离子电极反应的干扰，两极间外加的极化电压超过氧分子的分解电压时，透过薄膜进入KCl溶液的溶解氧便在铂极上还原：O2+2H2O+4e-=4OH-；银极上则发生银的氧化反应：4Ag+4Cl-=4AgCl+4e-。

此时电极间产生电解电流。

由于电极反应的速度极快，阴极表面的氧浓度很快降低，溶液主体中的氧便向阳极扩散补充，使还原过程继续进行，但氧在水中的扩散速度则相对较慢，所以电极电流的大小受氧的扩散速度的限制，这种电极电流又称扩散电流。

在溶液静止、温度恒定的情况下，扩散电流受溶液主体与电极表面氧的浓度差控制。

随着外加电压的加大，电极表面氧的浓度必然减小，溶液主体与电极表面氧的浓度差加大，扩散电流也随之加大。

但当外加的极化电压达到一定值时，阴极表面氧的浓度趋近于零，于是扩散电流的大小完全取决于溶液主体中的氧的浓度。

此时再增加极化电压，扩散电流基本不再增加，使极谱波（即电流-电压曲线）产生一个平顶。

将极化电压选定在平顶的中部，可以使扩散电流的大小基本不受电压微小波动的影响。

因此，在极化电压及温度恒定的条件下，扩散电流的大小即可作为溶解氧定量测定的基础。

电极间产生的扩散电流信号可通过电极控制器的电路转换成电压输出，用自动记录仪进行记录。

三、实验材料与方法
1. 植物材料：萌发的绿豆（Vigna radiata），豆科、萌发的小麦（Triticum aestivum Linn），禾本科
2. 使用仪器：生物氧测定仪。

3. 实验步骤：
将仪器电源线、氧电极线接好，清洗反应室。

打开仪器，进行仪器参数设定，然后用一定浓度的Na2SO3和蒸馏水进行O2浓度的调零和调满。

进入测量菜单，建立新的文件名，将反应室中加入研磨好的绿豆，将反映体积康之灾6ml，开始采集数据。

数据采集结束后，记录数据，彻底清洗反应室，再重复两次。

之后将测量材料换为萌发的水稻，同样测量三次。

也可以，待数据全部采集，将仪器关闭，接到电脑上，打开仪器进入数据管理菜单下，浏览数据，确认需要导出数据名称，操作计算机上预装的程序，仪器将自动导出需要的数据。

四、实验结果
五、分析与讨论
在植物萌发过程中，种子需要消耗氧气进行有氧呼吸，呼吸速率高。

从实验测得的数据来看，我们发现，萌发的绿豆呼吸值稍微大于萌发的小麦的呼吸值，推测这种差异是由于物种差异导致的。

反应中每次测量开始前需要仔细清洗反应室和氧电极探头，放在不同测量之间的干扰。

本实验中得到溶氧数据随时间有所变化说明，每次开始数值总要经过一段时间才能稳定。

这可能与反应室没有清洗干净或氧电极探头出滤膜有关，或与反应室漏气有关。

实验五AP4气孔计测定植物蒸腾速率
一、实验目的
1. 熟练掌握AP4气孔计的工作原理以及操作方法。

2. 使用AP4气孔计测定草本与木本植物的气孔导度和气孔阻力，计算蒸腾速率。

二、实验原理
蒸腾速率与气孔导度、土壤含水量和叶片相对含水量关系密切。

气孔导度可以用来评价城市大气污染状况，表征植物的生理状态，甚至可以用作抗旱植物、抗污染植物的筛选指标。

AP4气孔计根据循环扩散的原理，由植物叶片表明湿度的变化进行测量计算，得到气孔导度、气孔阻力等数据，并计算出植物蒸腾速率。

三、植物材料与方法
1. 植物材料：百合竹（Dracaena reflexa），龙舌兰科
2. 使用仪器：AP4气孔计（图1）。

3. 实验步骤：
（1）将装满打开仪器，进入校准界面，对仪器进行
开机校准。

首先进入校准菜单，将叶室夹张开，轻
轻晃动，测定环境中湿度值，然后使用铺好潮湿滤纸
的校准板，按照屏幕上的提示逐一校准6个点。

仪器
根据测定情况自动提示曲线的拟合状况，一般拟合标
准在5%以内对测量影响不大，可以接受。

若校准后，
匹配率大于5%，需要重新校准。

图1 AP4气孔计（2）校准后进入测量菜单，开始正式测量。

每测量一个值，需要待取值稳定两次再记录，而且叶室夹带黑色胶圈一侧为测量端，与待测叶表面接触。

（3）进入预览选项查看所需数据，用数据线将仪器和电脑相连，导出数据。

四、实验结果
图2正反叶面气孔阻力及气孔导度
五、分析与讨论
不同土壤水分条件下，蒸腾速率均与光照强度和气孔阻力具有显著相关关系，正常水分处理下植物蒸腾速率还与气温显著相关。

蒸腾作用常用气孔导度（气孔开度）来表示，也用气孔阻力表示，但是气孔开度与蒸腾强度呈正比，而气孔阻力则与蒸腾呈反比。

多数木本植物叶正表面具有一些防止水分蒸腾的组织如腺毛，蜡质层等，当气温、光照适宜，植物尽量控制蒸腾，以免水分散失，但随着午后气温的持续升高，为确保植物不受高温伤害，蒸腾会更加强烈。

因此，木槿叶片正面气孔阻力先升高后下降。

爬山虎叶片正面气孔阻力缓慢下降，说明叶片蒸腾逐渐上升。

两种植物叶片正面蒸腾速率表现差异可能与物种本身特性有关，也可能是仅测定了一天中某一段时刻的蒸腾，对植物蒸腾速率日变化没有全面了解，需要进一步研究才能比较出差异。

如上图所示，气孔开度与蒸腾强度呈正比，而气孔阻力则与蒸腾呈反比。

实验数据说明，反面叶片的气孔阻力明显小于正面叶片的气孔阻力，说明正面叶片的蒸腾速率较小；而反面叶片的气孔导度则明显大于正面气孔的气孔导度，也可以说明正面叶片的蒸腾速率较小。

这可能是由于叶片采集时间是当天午间，阳光照射强烈，正面叶片的气孔关闭，从而减少了蒸腾作用。

实验六Junior PAM测定F0’及叶绿素荧光诱导曲线
一、实验目的
1. 学习并掌握基础调制叶绿素荧光仪（Junior PAM）基本使用方法。

2. 使用Junior PAM测定植物的F0’以及绘制叶绿素荧光诱导曲线。

二、实验原理
叶绿素荧光是活体植物光合作用的探针。

当叶绿素分子受到外加激发光激发后，能量主要以3种方式散失，即荧光、光化学反应和热耗散。

这3种能量的总和相等，但彼此制约。

光合作用具有两个光系统，光系统Ⅰ（PSI）和光系统（PSⅡ）,它们之间具有蛋白或蛋白复合体组成的复杂的电子传递链，电子由最初的原初电子受体特殊对叶绿素a分子通过电子传递到达电子受体，生成NADPH和ATP的还原力，并最终将二氧化碳还原为有机物，同时生成氧气，将电能最终转化为稳定的化学能。

调制叶绿素荧光仪考虑到光合作用生理过程以及植物自然状态下生长的昼夜节律，用光化光、远红光近似模拟出植物自然状态下的光照条件，用可调制频率的脉冲光唯一地指示叶绿素荧光信号，通过进行饱和脉冲分析和进行荧光诱导曲线的绘制等方法研究植物对光信号变化的应答及植物的光合特性等。

如图1所示，植物在黑暗或低光照条件下经过一定时间的暗适应，打开测量光后，植物显示一定的荧光信号F0，这是初始荧光值，该值大小与叶绿素浓度有关。

然后给植物一个瞬间很强的饱和脉冲光，叶绿素分子激发出暗适应条件下的最大荧光值Fm，之后，荧光值缓慢下降。

打开光化光之后，荧光值先上升，然后缓慢下降到近平衡，此时再给予饱和脉冲光，植物由激发出一个荧光高峰，这是光下的最大荧光Fm’，植物状态趋于平稳后关闭光化光同时打开远红光，荧光值瞬间降到低于F0处，然后逐渐恢复到新的平衡状态。

因此，调制叶绿素荧光仪将调制叶绿素荧光技术以及饱和脉冲分析方法结合，通过不同光源的控制模拟改变自然光照条件，是研究植物光合特性及光适应的强大工具。

图1 植物叶绿素荧光特征曲线图2 基础调制叶绿素荧光仪。