流动相对色谱峰形及保留值的影响

• 分离可解离的化合物时, 流动相中添加缓冲盐并非仅仅用于稳定 流动相的pH 值, 缓冲盐、甚至简单的中性盐（如氯化钠）的反离 子还可与离子化的被测物通过相互间的缔合作用形成疏水性较强 的 中性离子对复合物; • 在低离子强度的缓冲液中, 吸附在固定相表面的离子化的被测物 分子的极性基团相互之间存在静电排斥效应 , 这使得色谱柱的饱 和容量显著降低; 随着缓冲液浓度(离子强度) 的增加, 中性离子对 复合物的浓度相应增加 , 固定相表面离子化的吸附物之间的相互 排斥作用随之减弱 , 导致色谱柱的饱和容量、尤其是填料上的低 能量位点的饱和容量以及平衡常数增加; 盐一类的流动相添加剂 可破坏离子化的被测物在流动相中的溶剂化-去溶剂化平衡, 产生 所谓的促溶效应(chaotropic effect) ,被测物与盐相互作用, 离子化 的被测物相互间的排斥作用减弱 , 从而显著地影响被测物在固定 相上的吸附行为; 在制备色谱系统中或被测物浓度较高时, 流动相 中 应 含 有 足 量 的 缓 冲盐以改善色谱峰形和分离效果。
• 如果水未冷却到室温就调节流动相 pH 值，会造成流动相 pH值的较大偏离，从而导致整个色谱分析实验的偏 差甚至失败。
• pH>水相
离子强度
• 在反相高效液相色谱过程中, 流动相的离子强度可显 著影响可解离的化合物的色谱峰形。
• 过载（overloading） ，峰形接近直角三角形。随着进 样量的增加, 色谱区带中高浓度的前半部的保留时间 减少, 但色谱区带均在同一时刻结束, 色谱峰的拖尾 因子及峰宽均显著增加, 同时被测物与有关物质间的 分离也随之变差。 • 选择合适的缓冲盐并适当地增加流动相的离子强度即 可显著改善色谱峰形, 色谱峰的拖尾因子及峰宽均随 之降低, 同时被测物与有关物质间也更加易于分离。
• 式中k′p 、k′p + 1是pH 值分别为p 、p + 1 时的容量因子, n 为pH 2-5 时的pH 值, Sp 、Spn为流动相pH 值增加±1 时药物容量因子 的响应系数和平均响应系数。 • 定义: Spn > 0.1 ,物质为碱性,保留值随pH 值增加而增加; Spn < 0.1 ,物质为酸性,保留值随pH 值增加而减少; - 0. 1 ≤Spn ≤0.1 ,物 质保留值几乎不受流动相pH 值变化的影响,被定义为中性。
• 有的药物在结构上同时含有酸性、碱性基团, 却表现出不同 色谱行为。如环丙氟呱酸和氨甲苯酸呈碱性, 丙谷胺为酸性, 而氟呱酸却类似中性。磺胺类药物多为中性或呈弱碱性。 • 一般来说, 碱性药物的保留值对pH值的敏感性差异较大, 保 留值大的药物对pH值的敏感性较大, 碱性药物对pH值敏感 性在 pH>4时显著增加 , 如酮康哇和益康哇。所以当分离碱 性或酸性药物采用的流动相pH值在4左右时, 要特别给予注 意, 以免影响分离度和峰序的改变, 如环丙沙星与氟哌啶, 地 卡因与普罗帕酮等在一之间发生峰序倒置。
C乙腈=0.32×C甲醇×C甲醇+ 0.57×C甲醇
以上公式是为保持相同的保留时间，乙腈、甲醇的 比例换算公式，其中C乙腈、C甲醇分别为乙腈/水、 甲醇/水的百分比。
• 化学结构是药物理化特性、色谱特征的物质基础, 不同结构的药 物表现出不同的色谱行为。 碱性药物均含有未参予共扼体系的氮原子, 酸性药物含羧基或磺酸基团, 中性药物不含酸碱基团,如甾体类和酰胺类
• 酸性 烟酸 阿魏酸 卡托普利 蔡普生 布洛芬 对氨基水杨酸 甘草酸 水杨酸 • 碱性 普罗帕酮 法莫替丁 阿替洛尔 利多卡因 苯丙哌林 环丙沙星 维拉帕米 氯丙嗪 • 中性 茶碱 维生素c 非那西丁 卡马西平 硝苯地平 地西泮 阿昔洛维
• 色谱柱的饱和容量可随缓冲盐的单价阳离子 ( 如 Na + 、 NH4+ 、K+ 、Cs+ ) 直径的增加 而降低, 选用Na+ , 色谱 柱的饱和容量相对较高。
• 生物碱 ：乙腈-KH2PO4
甲醇 ∶ KH2PO4 （ 0.01M， pH4. 3 ） =60∶40
甲醇 ∶ KH2PO4 （ 0.1M， pH4. 3 ） =50∶50
overloading
• 以硅胶为基质的反相键合相填料的表面实际上是不均匀的, 固定相中不可避免地含有少量高能量位点(sites) , 这些高 能量位点易被可解离的(甚至中性的) 化合物所过载。 • 解离的化合物在固定相表面的相互排斥作用以及较难渗透 进入疏水性的固定相中也是可能的原因，采用反相高效液 相分离可解离的(尤其是碱性的) 化合物时色谱柱易于过载, 甚至低达 10ng 的碱性化合物也可使常规色谱柱的表观柱 效明显降低; 减少进样量则可改善色谱峰形并使表观柱效 显 著 增 加 ; 过 载 效 应 可 随 着 流 动相的离子强度的增加而逐渐减弱。
甲醇 ∶ KH2PO4 （ 0.1M， pH3. 5 ） =50∶50
青霉素G浓度 2. 0, 1. 0, 0. 4, 0. 2mg/mL
甲醇∶ NH4H2PO4(0.025M) =55∶45
甲醇∶ NH4H2PO4(0.135M) =53∶47
克林霉素浓度 2. 0, 1. 0, 0. 4, 0. 2mg/mL
流动相对色谱峰形及 保留值的影响
pH
• 应用反相高效液相色谱进行分析测定时，常常采用离子 抑制法即向含水流动相中加入酸、碱或缓冲溶液等改性 剂，以使流动相的 pH 值控制一定数值，抑制溶质的离 子化，减少谱带拖尾、改善峰形，以提高分离的选择性。 例如在分析有机弱酸时，常向流动相中加入磷酸 ( 或乙 酸、三氯乙酸、甲酸、硫酸 ) ，就可抑制溶质的离子化， 获对称的色谱峰。对于弱碱性样品，向流动相中加入三 乙胺，也可达到相同的效果。方法建立时最好选用 pH 微小改变不影响分离的流动相， pH 值的较大变化往往 会对分析结果产生很大影响，因此流动相pH值 的调节是分析过程中至关重要的一个环节。
• 将常用药物按它们对流动相 pH 值变化的保留值函数特 征分成碱性、酸性和中性三类, 有利于从宏观上把握药 物的色谱行为趋势, 可以有预见性地规划分离条件的选 择, 减少不必要的实验条件和实验次数, 对内标物的选择 及分离度的改善和保留值的增减趋势均可作出事先的判 断, 这对在药物分析实践中有指导意义。
甲醇乙腈之比较
• 吸光度 比较乙腈和甲醇吸收光谱，乙腈吸收较小（特别是在短波长）。 • 压力 甲醇与水混合，压力增高； 乙腈在同样的流速下不在柱内加上 多余的压力。 • 洗脱能力 混合比率低时，乙腈的洗脱能力强。 有机溶剂100%或与此极接近时，常常都是甲醇的洗脱能力强。 • 分离(洗脱)的选择性 有机溶剂分子的化学性质(甲醇和乙醇是质子性，乙腈和四氢呋 喃是非质子性)不同所致。因此，在用乙腈类不能获得分离的选择 性，就试用甲醇类看看。 • 流动相的脱气 甲醇与水混合时发热，多余的溶解空气较易变为脱出气泡(脱气 容易)。而乙腈由于吸热冷却，随着慢慢回到室温，产生气泡，所 以要考虑脱气。 • 乙腈，特别是HPLC级的价格很高。