基因工程化分泌神经营养因子-3的鼠胚神经干细胞实验研究

盛生长。普通ＮＳＣ上清液组则无轴突生长（图４）。
８斗ｇ／ｍ１），２０００９离心２ｈ，然后收集细胞，加人新鲜
２．４ Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹
ＮＳＣ培养液及生长因子，继续培养。第２天再次重复
在Ｗｅｓｔｅｍ印迹的硝酸纤维膜上，转基因ＮＳＣ
以上操作。
上清液组可见到深黑色条带，而对照组只能见到模
１．２．５基因工程ＮＳＣ生物学活性检测：取孕１４ｄ胎 糊的印迹。表明转基因ＮＳＣ培养液中含有较高浓度
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ Ｌｅｎｔｉｖｉｍｓ；ｎｅｕｒａｌ ｓｔｅｍ ｃｅＵ；ｎｅｕｍｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏ卜３；ｓｐｉｎａｌ ｃｏｒｄ ｉｎｊｕｒｙ；ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
脊髓损伤（ｓｐｉｎａｌ ｃｏｒｄ ｉｎｊｕｒｙ，ＳＣＩ）后的解剖重 建和功能恢复一直是一个难题。近几十年来，科学家 们探索了多种治疗策略，包括：周围神经移植、雪旺 氏细胞移植、嗅神经鞘细胞移植，以及胚胎神经组 织移植等。虽然实验研究发现这些方法对于损伤脊 髓的轴突再生和功能恢复有～定促进作用，但仍然 难以重建损伤脊髓的功能。而神经干细胞（ｎｅｕｒａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ，ＮＳＣ）是中枢神经系统（ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｕｍｌ ｓｖｓｔｅｍ，ＣＮＳ）中具有自我更新能力和多种分化潜能 的细胞，能被大量扩增，并可在体内和体外诱导分化 成ＣＮＳ内主要的３种细胞：神经元、星形胶质细胞、 少突胶质细胞，目前已成为ＣＮＳ损伤后再生修复的 理想材料和转基因载体。本实验探索以Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ为 载体，构建同时表达绿色荧光蛋白（ｇｒｅｅｎ ｎｕｏｒｅｓ．
ｗａｓ ｇｅｎｅｔｉｃ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｂｙ Ｌｅｎ“ｖｉｍｓ ｔｏ ｅｘｐｒｅｓｓ ＧＦＰ ａｎｄ ｒａｔ ＮＴ一３； ￡ｈｅｎ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ
ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｎｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｉｃｍｓｃ叩ｅ、ｄｏｒｓａｌ ｒｏｏｔ ｇａｎｇｌｉｏｎ ｏｆ ｆｅｔａｌ ｍｔｓ ａｎｄ Ｗｅｓｔｅｍ ｂｌｏｔ．ＲｅｓｕＩｔ：Ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｎｇｉ—
摘要 目的：探索以Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ为载体，构建同时表达绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）和神经营养因子一３（ＮＴ一３）的基因工程化
鼠胚神经于细胞（ＮＳＣ）的可行性。方法：体外分离培养鼠胚ＮＳＣ，用同时携带ＮＴ一３和ＧＦＰ的ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ转染构建工
程化ＮＳＣ；用荧光显微镜、鼠胚背根神经结培养（Ｄｏｒｓａｌ Ｒｏｏｔ Ｇａｎｇｌｉｏｎ，ＤＲＧ）、Ｗｅｓｔｅｍ ｂｌｏｔ等方法检测基因工程ＮＳＣ
ＮＳＣ。
２．２基因工程ＮＳＣ的荧光显微镜观察
缩：在转染前１８—２４ｈ，将２９３Ｔ细胞接种于１０ｃｍ培
在倒置相差荧光显微镜下可见到转基因ＮＳＣ
养皿中。每皿约３×１０６个细胞，使其在转染时达到 呈现强度适中的荧光（图３）。
８０％一９０％汇片。将３种质粒ＬｅｎｔｉｖｉｌｌＪｓ—ＮＴ一３
２．３生物学活性检测
作者简介：蔡培强，男，主治医师，硕士
收稿日期：２００５—１ｌ一２８
万方数据
中国康复医学杂志，２００６年，第２ｌ卷，第５期ＣＡ；ｗｓｅ如ⅡｒＭｆ ｏ，舶＾曲ｉ耽ｍｉｏｎ讹ｄｉｃｉｗ，Ｍａｙ ２００６，Ｖ０１．２１，Ｎｏ．５
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１．１材料
１．２．６ Ｗｅｓｔｅｍ印迹：将待测样品（普通ＮＳＣ培养上
１．１．１ 试剂：ｂＦＧＦ购自美国Ｓｉｇｍａ公司；Ｎｅｓｔｉｎ抗
ｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ａｍｓｔｅｒｄａｍ．Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ
Ｍｉ啪ｉ ３ ７ｒｈｅ Ｍｉａｍｉ Ｐｒｏｉｅｃｔ ｔｏ Ｃｕｒｅ Ｐａｒａｌｖｓｉｓ．Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｖ ｏｆ
Ｓｃｈｏｏｌ
ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．Ｍｉａｍｉ．ＦＬ ３３１０１．ＵＳＡ
４中国科学院昆明动物研究所 ５通讯作者：汤逊（成都军区昆明总医院骨科，昆明，６５００３２）
３９８
中国康复医学杂志，２００６年，第２ｌ卷，第５期
·基础研究·
Ｃ硒Ｍ５ｅ如ｕｍ以妒肌＾曲抛出ｉｏｎ＾如ｄ如ｉｎｅ，Ｍａｙ ２００６，Ｖｏｌ＿２１，Ｎｏ．５
基因工程化分泌神经营养因子一３的
鼠胚神经干细胞实验研究水
蔡培强１ 汤 逊＂ 林月秋１ Ｂｌｉｔｓ Ｂ２ Ｏｕｄｅｇａ Ｍ３ 阳运康１ 徐 林４ 周田华
１．２方法
２结果
１．２．１神经干细胞的分离培养和鉴定：无菌条件下 ２．１ ＮＳＣ体外培养体系的建立
取孕１４ｄ的Ｗｉｓｔａｒ胎鼠皮层组织，仔细分离去筋膜
由１４ｄ胚鼠大脑皮层分离，培养的细胞，经６—
和血管，ＰＢＳ漂洗３次后，用显微剪反复剪碎组织，再 ７ｄ加ｂＦＧＦ的无血清培养后，细胞呈团状集落，悬浮
用２００目细胞筛过滤，转入ＤＭＥＭ／Ｆ１２，加Ｂ２７添加 生长。细胞集落中的细胞数从数十、至数百个不等
清液、转基因ＮＳＣ培养上清液）在沸水中加热
wenku.baidu.com
体、ＮＦ一２００抗体、ＧＦＡＰ抗体均购自武汉博士德生 １０ｍｉｎ，经ＳＤＳ聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后通过电泳
物工程公司；ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｂ２７、Ｎ２均购自美国Ｇｉｂｃｏ
将凝胶上的蛋白质转移到硝酸纤维膜上，然后将膜
公司；羊抗鼠ＮＴ一３抗体购自美国ＵＳＢ公司，超信号
２９３Ｔ细胞购自武汉大学保藏中心。携带ＮＴ一３和 １５ｍｉｎ．ＨＲＰ标记兔抗羊二抗孵育１ｈ．ｒＩＴｒＢＳ漂洗３
ＧＦＰ标记基因的Ｌｅｎｔｉｖｉｍｓ的各种质粒由美国迈阿 次，每次１５ｍｉｎ，然后超信号Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ化学发光底
密大学Ｍａｎｉｎ教授和荷兰鹿特丹神经研究所Ｂ． 物试剂盒显色。
ＢＬＩＴＳ博士构建。
转入含ｌ％胎牛血清白蛋白的ＴＢＳ（Ｏ．１Ｍ Ｔｒｉｓ—ＨＣＬ＋
Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ化学发光底物试剂盒（Ｐｉｅｒｃｅ ３４０７９ｚＺ）、 ０．９％Ｎａｃｌ）封闭液中封闭１ｈ，再于羊抗鼠ＮＴ一３一抗
质粒提取试剂盒购自美国Ｐｒｏｍｅｇａ公司；人胚肾
孵育１ｈ，‘ｒｒＢＳ（０．５％Ｔｗｅｅｎ２０＋ＴＢＳ）漂洗３次，每次
鼠，分离出ＤＲＧ，放人经多聚赖氨酸包被处理过的
的ＮＴ一３蛋白。
９６孔培养板中，每孔一个，分别加入转基因ＮＳＣ培
养上清液（ｎ＝１２）和普通ＮＳＣ培养上清液（ｎ＝１２），每孔 ３讨论
关键词 神经干细胞；基因工程；神经营养因子一３；脊髓损伤
中圈分类号：Ｒ４９，Ｒ６５１．２
文献标识码：Ａ 文章编号：１００ｌ—１２４２ｆ２００６）一０５一０３９８—０３
Ａ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｎ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｍｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｒａｔ ｎｅｕｒａｌ ｓｔｅｍ ｃｅＵ ｍｏｄｉ－ ｎｅｄ ｂｙ Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ ｔｏ ｄｅＨＶｅｒ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆｈｃｔｏｒ一３，ＣＡＩ Ｐｅｉｑｉａｎｇ。ＴＡＮＧ Ｘｕｎ，ＬＩＮ Ｙｕｅｑｉｕ，ｅｔ ａ１．，，ＣｈｉＩｌｅｓｅ ＪｏｕｒｎａＩ ｏｆ Ｒｅｈａｂｍｔａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｄｎｅ，２００６，２１（５）：３９８—４００ Ａｂｓｔｒａｃｔ ｏｂｊｅｃｔｉＶｅ：Ｔｏ ｃｏｎｓｔｍｃｔ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｒａｔ ｎｅｕｒａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ（ＮＳＣ）ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ Ｌｅｎｔｉｖｉｍｓ ｔ０ ｅｘ— ｐｒｅｓｓ ｂｏｔｈ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｐｍｔｅｉｎ （ＧＦＰ）ａｎｄ ｎｅｕｍｔｍｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ一３ （ＮＴ一３）ａｔ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｔｉｍｅ ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ａⅡｂｒｄ ｔｈｅ ｇｒａｆｔｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｆｕｒｔｈｅｒ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｍｅｔｈｏｄ：Ａｆｔｅｒ ｔｈｅ ｒａｔ ＮＳＣ ｗａｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ，ｔｈｅ ｒａｔ ＮＳＣ
ｎｅｅｒｉｎｇ ＮＳＣ ｗａｓ ｃｏｎｓｔｍｃｔｅｄ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ． ＡＵ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ＮＳＣ ｔｈａｔ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｂｒｉｇｈｔ ｇｒｅｅｎ ｎｕｏｒｅｓ— ｃｅｎｃｅ ｂｙ ｔｈｅ ｎｕｏＩＩｅｓｃｅｎｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ ｗａｓ ｏｂｓｅＩ、，ｅｄ．７Ｉ’ｈｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｍｅｄｉｕｍ ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ＮＳＣ ｃｏｕｌｄ ｉｎｄｕｃｅ ｎｅｕ— ｒｉｔｅ ｎｏｕｒｉｓｈｉｎｇ ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ ｆ南ｍ ＤＲＧ；Ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ＮＳＣ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｈｉｇｈ ｌｅｖｅｌ ＮＴ一３ ｗｈｉｃｈ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｄｅ— ｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｗｅｓｔｅｍ ｂｌｏｔ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｒａｔ ＮＳＣ ｉｓ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｃｏｎｓｔｍｃｔｅｄ， ｗｈｉｃｈ ｃａｎ ｂｅ ａｐｐｌｉｅｄ ｗｉｄｅｌｙ ｉｎ ｔｈｅ ｂａｓｉｃ ｓｔｕｄｙ ａｎｄ ｔｈｅ ｆｕｎｈｅｒ ｃｌｉｎｉｃ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｐｉｎａｌ ｃｏｒｄ ｉ１１ｊｕｒｙ ａｓ ｎｅｕ— ｍｌ ｇｒａｆｔｓ． Ａｕｔｈｏｒ’ｓ ａｄｄｒｅｓｓ Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃｓ，Ｋｕｎｍｉｎｇ Ｇｅｎｅｍｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｃｈｅｎｇｄｕ Ｍｉｌｉｔａｒｙ Ｃｏｍｍａｎｄ，Ｋｕｎｍｉｎｇ，６５００３２
携带病毒合成必须成分的辅助质粒（ＰＣＭＶ８４７）、口 层分离的细胞能够自我更新，Ｎｅｓｔｉｎ染色阳性，具有
腔粘膜水疱病毒糖蛋白（ＶＳＶ—Ｇ）用大肠杆菌ＤＨ５ ０【
分化为神经元和星形胶质细胞的能力，证明它就是
扩增，再经质粒提取试剂盒提取扩增的质粒。 １．２．３ ２９３Ｔ细胞的培养、转染、病毒上清收获和浓
ｃｅｎｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＧＦＰ）和神经营养因子一３（ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ＿３，ＮＴ一３）的基因工程化鼠胚ＮＳＣ的可行性， 力图为脊髓损伤基础研究及进一步临床应用提供有 价值的细胞资源。
ｌ材料和方法
｝基金项目：云南省自然科学基金资助项目（２００２Ｃ００７０Ｍ） ｌ 成都军区昆明总医院骨科，昆明，６５００３２ ２ Ｇｒａｄｕａｔｅ Ｓｃｈｏｏｌ ｆｂｒ Ｎｅｕｍｓｃｉｅｎｃｅｓ Ａｍｓｔｅｒｄａｍ．Ｎｅｔｈｅｄａｎｄｓ Ｉｎｓｔｉ．
１０¨ｇ、ＰＣＭＶ８４７ ６．５斗ｇ、ＶＳＶＧ ３．５“ｇ用磷酸钙沉淀 法转染。于转染后３６ｈ收集病毒上清，每天１次，共
１４ｄ胎鼠的ＤＲＧ培养４８ｈ后，可见到转基因 ＮＳＣ上清液培养组ＤＲＧ旺盛生长。轴突从ＤＲＧ密
３天。然后将所收集的病毒液经超速离心浓缩１００ 密麻麻地长出，呈细丝状，并不断地发出分支，相互
剂、ｂＦＧＦ（２０ｎｇ，ｍ１）；机械吹打制成单细胞悬液，台盼 （图１）。细胞集落培养１８代以上仍具ＮＳＣ特性。
兰染色计数，调整细胞浓度为５×１０５个／ｍｌ接种于培 ＮＳＣ经Ｎｅｓｔｉｎ免疫组化染色阳性（图２ａ）。加入血清
养瓶中。６—７天传代１次。用Ｎｅｓｔｉｎ抗体染色鉴定 诱导分化后，细胞团１—２ｄ开始贴壁分化，ＮＳＣ团呈
的转基因表达。结果：荧光显微镜观察到几乎１００％的工程化ＮＳＣ表达ＧＦＰ：ＤＲＧ培养和Ｗｅｓｔｅｍ ｂｌｏｔ检测到基因工
程化ＮＳＣ能高效分泌ＮＴ一３蛋白。结论：以ＩＪｅｎｔｉｖｉｒｕｓ为载体，构建同时携带并稳定表达ＧＦＰ和Ｎ‘ｒ＿３的基因工程化
鼠胚ＮＳＣ是可行的，可为脊髓损伤基础研究提供有价值的细胞资源。
ＮＳＣ，用ＮＦ一２００和ＧＦＡＰ鉴定诱导分化的神经元和 放射状发出许多轴突，相互交错呈网状。分化的细胞
星形胶质细胞。
有的为ｌ一２个或多个突起的呈ＮＦ一２００免疫染色
１．２．２ Ｌｅｎｔｉｖｉｍｓ质粒的扩增和提取：将３种质粒，
阳性的神经元（图２ｂ）；有的为多突起的呈ＧＦＡＰ免
即携带ＧＦＰ和ＮＴ一３的目的质粒ｆｋｎｔｉｖｉｍｓ—ＮＴ一３）、 疫染色阳性的星型胶质细胞（图２ｃ）。这种从胎鼠皮
倍，分装为３０¨ｌ每管，一８０℃保存。
交错成网状，长度甚至超过ＤＲＧ的直径，但没有神
１．２．４基因工程ＮＳＣ的构建：取（５—１０）×１０５个鼠 经元向外迁徙，说明转基因ＮＳＣ的培养介质中有较
胚ＮＳＣ。经吹打制成单细胞悬液，将其置人圆底离心
高的ＮＴ一３蛋白表达．能够促进胎鼠ＤＲＧ轴突的旺
管中，加入５肌ｌ病毒浓缩液和聚凝胺（终浓度为