改良枕大池二次注血法建立大鼠蛛网膜下腔出血模型

改良枕大池二次注血法建立大鼠蛛网膜下腔出血模型目的：建立大鼠蛛网膜下腔出血模型，通过研究其出血后认知、行为学改
变，基底动脉变化探讨枕大池穿刺二次注入自体动脉血溶血物法建立大鼠蛛网膜下腔出血模型的实际可行性。

方法：将72只清洁级雄性SD大鼠（体重300～350 g）随机分成对照组（n=12只）、实验组（n=60只）。

实验组又分别划分为出血后12 h、24 h、48 h、3 d、5 d 5个时相组，每个时相组各12只大鼠。

造模后，通过水迷宫试验观察各时相点大鼠蛛网膜下腔出血后的认知、行为学改变，评价大鼠的学习记忆功能障碍。

结果：水迷宫结果显示实验组大鼠与正常对照组比较，逃避潜伏期明显延长，跨越平台次数减少，差异均有统计学意义（P＜0.05）。

大体标本观察，对照组脑蛛网膜下腔未见出血，实验组大鼠蛛网膜下腔出血明显，可见有大量血液或血凝块弥漫分布于蛛网膜下腔。

结论：枕大池穿刺二次注入自体动脉血溶血物法建立模型操作简便易行，可重复性强，大鼠学习记忆功能障碍改变明显。

大鼠基底动脉痉挛明显，模型复制成功。

蛛網膜下腔出血（Subarachnoid hemorrhage，SAH）是临床常见的脑血管疾病，死亡率及致残率高，目前对于该病早期的高死亡率知之甚少，因此动物实验成为研究的重要方法。

建立一种操作简单、发病机制相似的动物模型来研究SAH 后的病理生理变化，对临床治疗具有重要的指导意义。

本研究采用枕大池穿刺二次注入自体动脉血溶血物法建立大鼠蛛网膜下腔出血模型，通过研究其出血后认知、行为学改变，探讨模型的可靠性，以期提供简单、可靠的SAH动物模型制作方法。

Otsuji等[6]1994年对Endo的模型进行改良，第二次注血时改用氧合血红蛋白代替全血，发现动物出现的神经功能障碍更加严重，使SAH的模型更加完善。

刘承基等[7-8]亦发现，SAH后急性脑血管痉挛与动脉破裂后血液成分进入蛛网膜下腔有关，血液对血管的长时间浸泡导致血管调节功能紊乱，血管收缩功能增强，同时舒张功能出现障碍，诱发血管痉挛。

血液进入蛛网膜下腔后红细胞溶解，释放氧合血红蛋白，灭活NO、激活鸟苷酸环化酶，增加氧自由基的产生，最终使血管收缩，此为引起脑血管痉挛的早期关键因素。

制作大鼠SAH模型的方法多种多样，到目前为止有关大鼠SAH的造模方法主要可归纳为三类：（1）颅内动脉刺破法；（2）枕大池注血法；（3）视交叉前池或蛛网膜下腔注血法[9]。

第一种方式是刺破颈内动脉颅内段某一点，血液流入蛛网膜下腔，该方法符合蛛网膜下腔出血的发病特点，但存在一定缺陷：①细线刺入血管后可能造成暂时性脑缺血，如时间超过30 min，有局部脑组织坏死的可能；②出血量不恒定，影响实验结果的观察；
③操作复杂，损伤大，死亡率较高，在蛛网膜下腔出血后24 h约50%的动物死亡；④可引起脑内出血，发生率约占全部实验动物的11%。

近年来，开颅视交叉池注血法建立SAH模型报道较多[10-11]，此方法应用脑立体定位仪固定，手术暴露冠状缝、矢状缝及bregma点，在bregma点前7.5 mm稍偏右侧处钻孔后行视交叉池注血[12]。

但此种方法要求仪器辅助，且操作过程复杂，需要经过专门训练才能熟练完成。

后两种造模方式多为手术开颅将非抗凝自体血经额或经小脑延髓池或侧脑室插管注入蛛网膜下腔，但采用自体动脉血注入小脑延髓池的
方法较多，称为枕大池注血法。

Dudhani等[13]、孙保亮等[14]对单次注血法进行改良，对寰枕区域进行了更细致的解剖，穿刺注血0.15 mL，停留30 s后拔针，48 h后第二次注血0.15 mL，称为枕大池二次注血法（double hemorrhage injection），也取得了成功，此方法克服了单次注血后血管痉挛不稳定的缺点，成为目前常用的SAH造模方法。

本实验考虑到SAH大鼠模型要求模型应具有发病机制相似、操作可控性强、所有模型之间差异应尽可能小、死亡率不能太高，经过认真地探索，对动物进行局部解剖测量，找到适合的进针角度及深度，并借鉴其他学者的成功经验，采用改良枕大池二次注入自体动脉血溶血物法，共制作出72只SAH模型，死亡率为11%，分析死亡原因可能与短时间内脑池注血，延髓受压，未进行复苏支持有关。

试验中采用冷冻后复溶的血液，原因在于动脉血经短暂冷冻复溶后，血清析出，红细胞裂解释放血红蛋白，更准确地模拟了临床中SAH后早期脑损伤的发病机制。

通常认为对造模后大鼠神经行为学的评价可反映模型脑损伤及后期恢复的程度，并以此判断造模是否成功[15]。

实验中发现，SAH后大鼠出现轻微的认知功能障碍，第3天左右会在脑干和Willis环的基底面发现凝血块，5～7 d后血凝块逐渐被吸收，在此期间死亡率约为20%[16]。

Morris水迷宫（Morris Water Maze）是目前国内外研究中广泛应用的检测空间学习记忆功能最精确、客观的一种方法。

测试大鼠学习、记忆功能的方法很多，而Morris水迷宫实验则最为常用，且可以通过每天变化平台的位置来增加难度[17]。

本实验显示试验组大鼠每天的隐匿平台逃避潜伏期均明显比对照组大鼠长（P＜0.01），平台搜索试验中每分钟穿越原平台位置的次数明显比对照组大鼠少（P＜0.01），说明缺血再灌注后大鼠空实验组大鼠与对照组相比在逃避潜伏期、平台搜索结果方面结果均差异显著，证明大鼠蛛网膜下腔注血后12～48 h学习记忆功能障碍明显，与临床SAH患者出现的相关症状类似，證明蛛网膜下腔出血后海马神经元受到损伤，Jeon等[18]猜测这可能与大脑皮层和海马内神经元的数量减少有关。

结合大体解剖等观察证明：采用改良枕大池二次注入自体动脉血溶血物法可成功制作蛛网膜下腔出血大鼠模型。

在此模型制作过程中，个人体会主要有以下几点：（1）保持相对恒定的实验环境温度：10-11月份，8只大鼠在首次注血后或二次注血后死亡，此时测量动物手术室的温度多在17～19 ℃。

而分析原因之后，笔者应用小动物保温毯，保持试验环境温度25～29 ℃，死亡率明显降低。

因此，建议操作时实验室温度维持在25℃以上。

（2）注血量及时间：注血量超过0.3 mL则因颅内压过高导致动物死亡；而注血量在0.2 mL以下（包括0.2 mL）时，颅底血液沉积不足，极少产生脑血管痉挛，不足以造成明确的脑损伤；注血时间要控制在5 min左右，注血过快可导致枕骨大孔疝形成。

（3）进针时不能太深，应用自制的穿刺针，刺破硬膜时突破感明显，可更好把握进针深度，损伤脑干的机率大大减少。

（4）股动脉取血后，迅速置于-80 ℃深低温冰箱冷冻10 min，37 ℃复溶。

（5）操作过程中严格无菌操作，预防颅内感染。

综上所述，采用非开颅枕大池二次注入自体动脉血溶血物法建立蛛网膜下腔出血大鼠模型，操作简易，可重复性强，动物行为活动改变、神经功能受损明显，成功模拟临床上动脉瘤性蛛网膜下腔出血的病理生理过程。

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（收稿日期：2017-02-13）（本文編辑：周亚杰）。