乙型肝炎病毒多聚酶区rt229突变的流行特点及其对病毒复制力的影响

乙型肝炎病毒多聚酶区rt229突变的流行特点及其对病毒复

制力的影响

纪冬;刘妍;思兰兰;李乐;王琳;陈国凤;韩萍;徐东平

【摘要】目的评价乙型肝炎病毒(HBV)多聚酶反转录酶(RT)功能域rt229突变对HBV复制力的影响.方法从慢性HBV感染患者血清中提取HBV DNA,使用PCR

扩增RT区及前C区基因,采用直接测序法分析耐药相关位点的突变;克隆患者HBV 全长基因组,获得S445-3及S869-4克隆并作为定点突变母本,以产生rt229突变

的各种模式.使用无载体介导的方法将含有rt229突变的全长HBV基因组转染入HepG2细胞系中,转染3d后采用Real-Time PCR法定量检测HBV复制中间体水平.结果在受检的6000例患者中,394例(6.57%)存在rt229突变,与拉米夫定(LAM)治疗相关的占78.93%,明显高于其他患者[包括接受阿德福韦酯(ADV)治疗、初治

和用药不详者]所占的21.07%.其中rtL229V、rtL229W和rtL229M单独突变分

别占全部rt229突变的12.44%、1.78%和4.57%,未发现rtL229F单独突变

株;rtL229V、rtL229W、rtL229M、rtL229F与LAM耐药突变共存分别占

43.65%、9.14%、9.64%和14.97%;rtL229V、rtL229M与ADV耐药突变共存分别占2.54%和1.27%.复制力评价结果显示,相对于前C区G1896A单独突变株

(S869-4),rtL229V、rtL229W、rtL229M和rtL229F突变将HBV复制力降低至2.92%、8.79%、26.04%和34.80%;相对于LAM耐药株(S445-3),伴随有

rtL229V、rtL229W、rtL229M和rtL229F的LAM耐药株的复制力增加了1.18、2.29、2.49和2.51倍.结论 rt229位点的突变可降低HBV的复制力,增强LAM耐药株的复制力;rt229突变可能为LAM耐药突变的补偿突变.

【期刊名称】《解放军医学杂志》

【年(卷),期】2010(035)006

【总页数】4页(P625-628)

【关键词】肝炎,乙型,慢性;药物耐受性;突变;抗病毒药

【作者】纪冬;刘妍;思兰兰;李乐;王琳;陈国凤;韩萍;徐东平

【作者单位】100039,北京,解放军302医院传染病研究所病毒性肝炎研究

室;100039,北京,解放军302医院传染病研究所病毒性肝炎研究室;100039,北京,解放军302医院传染病研究所病毒性肝炎研究室;100039,北京,解放军302医院传染病研究所病毒性肝炎研究室;100039,北京,解放军302医院传染病研究所病毒性肝炎研究室;100039,北京,解放军302医院肝纤维化微创诊疗中心;100039,北京,解放军302医院肝纤维化微创诊疗中心;100039,北京,解放军302医院传染病研究所病毒性肝炎研究室

【正文语种】中文

【中图分类】R512.62

乙型肝炎病毒(HBV)是部分双链DNA病毒,其复制是由多聚酶通过RNA中间体完成的,由于缺乏校读功能,经常可检测到多聚酶的反转录酶(RT)区的基因突变。RT区基因突变可以对病毒复制力及药物敏感性产生影响,从而影响疾病进展。长期使用核苷类似物(nucleotide analogues,NA)进行抗HBV治疗后,可筛选出特定位点的耐药突变,例如rtM 204I/V±rtL180M为拉米夫定(LAM)耐药位点,rtA 181V或rtN236T为阿德福韦酯(ADV)耐药位点[1-3]。除了这些典型的耐药突变,还存在一些非典型突变,如rt215、rt217、rt229等位点的突变,有研究发现在LAM无应答

患者中检测到rtL229V/M 突变[4]。本研究对6000例慢性HBV感染患者血清HBV RT区基因突变进行检测,以分析rt229的各种突变模式及其流行特点,并评测各种突变形式对HBV复制力的影响。

1 资料与方法

1.1 研究对象 2007年8月-2009年12月解放军302医院诊治的6000例慢性HBV感染患者,诊断标准按2000年9月(西安)全国会议修订的《病毒性肝炎防治方案》[5]执行,无重叠或混合感染,血清保存于-20℃。

1.2 方法

1.2.1 HBV RT与前C基因的扩增与突变分析使用病毒DNA提取试剂提取6000例患者血清HBV DNA,HBV RT区及前C区基因扩增采用本研究组建立的巢式PCR方法[6-7]。PCR产物经ABI 3730XL基因分析仪进行正、反双向DNA序列测定。对rt173、

rt180、rt181、rt202、rt204、rt215、rt217、rt229、rt236 等位点的序列峰图进行分析,结合正、反向测序结果比较印证,分析基因突变位点。

1.2.2 HBV全长基因克隆及定点突变选取S445和S869患者,提取血清HBV DNA,经PCR扩增后克隆到pGEM-Teasy载体中,具体方法参见文献[8],获得母代克隆

S445-3(GenBank号 FJ032334)及S869-4(GenBank号EU560441),使用定点突变引入rt229的各种突变模式,具体方法见试剂盒说明书。

1.2.3 HBV 1.0自身环化及细胞转染采用Bsp Q I/Sca I双酶切释放出HBV全长基因组。HepG2细胞系在含10%胎牛血清的DMEM中培养,采用脂质体介导的转染方法(具体参见操作手册),每孔转染DNA 1μg,设置未转染孔为阴性对照。进行两次独立的重复实验,具体方法参见文献[9]。

1.2.4 HBV复制中间DNA的提取与定量转染72h后,细胞裂解物经

DNase/RNase和蛋白酶K消化,酚/氯仿抽提后得到HBV复制中间体DNA,采用