桦褐孔菌gpd基因cdna序列和启动子的克隆与分析

第４１卷㊀第４期２０１９年１２月㊀㊀㊀㊀㊀㊀延㊀边㊀大㊀学㊀农㊀学㊀学㊀报A g r i c u l t u r a l S c i e n c e J o u r n a l o fY a n b i a nU n i v e r s i t y
㊀㊀㊀㊀㊀
V o l ．４１N o ．４
㊀D e c ．２０１９收稿日期:２０１９Ｇ０７Ｇ０８㊀基金项目:国家自然科学基金项目(３１１６０４０８,３１４６０５３６)作者简介:张宇婷(１９９５ )
,女,山西长治人,在读博士,研究方向为生物技术在蔬菜中的应用.曲柏宏为通信作者,㊀㊀㊀㊀E Ｇm a i l :b h q
u ２１１＠y b u ．e d u ．c n 文章编号:１００４Ｇ７９９９(２０１９)０４Ｇ０００７Ｇ０７㊀㊀㊀㊀D O I :１０．１３４７８/j ．c n k i ．j a s y
u ．２０１９．０４．００２桦褐孔菌G P D 基因c D N A 序列和启动子的克隆与分析
张宇婷１,２
,㊀朴钟云２,㊀刘㊀迪１,㊀曲柏宏１∗
(１．延边大学农学院,吉林延吉１３３００２;２．沈阳农业大学园艺学院,辽宁沈阳１１０１６１
)摘要:利用R A C E 和染色体步移技术首次从桦褐孔菌中克隆得到三磷酸甘油醛脱氢酶(G P D )基因和启动子序列.桦褐孔菌G P D 基因的c D N A 序列全长１２２３b p ,其中,编码区１０２０b p ,共编码３３９个氨基酸,相对分子质量约为３６．３９k D a ,理论等电点为８．２８.序列比对结果表明:桦褐孔菌G P D 基因与鲍姆桑黄(S a n g h u a n Ｇ
g p
o r u s b a u m i i )相似度为８８％.利用染色体步移技术方法克隆得到G P D 基因起始密码子上游４４６b p 启动子序列,分析表明在１５２b p 和１６０b p 处有２个转录起始位点,含有T A T A ㊁C A A T ㊁C C A A Tb o x 及重要顺势作用元件L T R ㊁O ２Ｇs i t e ㊁c i r c a d i a n ㊁S p １㊁T C C C Ｇm o t i f 等,这将为桦褐孔菌菌株的分类鉴定㊁功能研究及高效表达载体的建立提供基因资源.
关键词:桦褐孔菌;G P D 基因;启动子;克隆;序列分析中图分类号:S ５６７．３㊀㊀㊀文献标识码:A ㊀㊀㊀
C l o n i n g a n d s e q u e n c e a n a l y
s i s o f c D N Aa n d p
r o m o t e r o f G P D g e n e f r o m I n o n o t u s o b l i q u u s Z H A N G Y u t i n g １,
２,㊀P I A OZ h o n g y u n ２,㊀L I U D i １,㊀Q U B a i h o n g
１∗
(１．A g r i c u l t u r a l C o l l e g e o f Y a n b i a nU n i v e r s i t y ,Y a n j
i J i l i n １３３００２,C h i n a ;２．H o r t i c u l t u r e C o l l e g e o f S h e n y a n g A g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t y ,S h e n y a n g L i a o n i n g １
１０１６１,C h i n a )A b s t r a c t :T h e c D N As e q u e n c e a n d p r o m o t e r s e q u e n c e o f g l y c e r a d e h y d e Ｇ
３Ｇp h o s p h a t e d e h y d r o g e n a s e (G P D )g e n ew e r e f i r s tc l o n e df r o m I n o n o t u s o b l i q u u s b y R A C Ea n d g e n o m ew a l k i n g ．T h ec o m p l e t ec D N As e Ｇq u e n c e o f G P D i s o l a t e d f r o mI ．o b l i q u u s w a s １２２３b p i n v o l v e dO R Fo f １０２０b p e n c o d i n g a p r o t e i nc o m Ｇp r i s e do f ３３９a m i n o a c i d sw i t hm o l e c u l a rw e i g h t o f ３６．３９k D a a n dP I o f ８．２８．T h e s i m i l a r i t y b
e t w e e n t h e p u t a t i v e a m i n o a c i ds e q u e n c e so fG P Dh e r ea n dG P D
f r o m S a n
g
h u a n g p
o r u s b a u m i i i s８８％．T h e r ew e r e t w o t r a n s c r i p t i o n Ｇo r i g i n a t e ds i t e sa t１５２b p a n d１６０b p i n p r o m o t e r ,w h i c hc o n t a i n e d T A T A ,C A A T ,C C A A Tb o xa n d t h e i m p o r t a n t c i s Ｇ
a c t i n g e l e m e n t s :L T R ,O ２Ｇs i t e ,c i r c a d i a n ,S p １,T C C C Ｇm o t i f e t c ．T h i s w i l l p r o v i d e g e n e t i c r e s o u r c e f o r t h e t a x o n o m i c i d e n t i f i c a t i o n ,f u n c t i o n a l s t u d y a n d e s t a
b l i s h m e n t o f h i g h l y
e f f i c i e n t e x p r e s s i o nv e c t o r f o r I ．o b l i q
u u s ．K e y w o r d s :I n o n o t u s o b l i q u u s ;G P D g e n e ;p r o m o t e r ;c l o n i n g ;s e q u e n c e a n a l y s i s ㊀㊀桦褐孔菌(I n o n o t u s o b l i q
u u s (P e r s ．:F r ．)P i l át )俗称茶卡,生长在桦树㊁榆树㊁赤杨及花楸上,是一种
延㊀边㊀大㊀学㊀农㊀学㊀学㊀报第４１卷㊀
极其耐寒的药用真菌,具有抗肿瘤㊁降血糖㊁抗氧化㊁提高机体免疫能力等多种作用,以菌核入药[１Ｇ３].
三磷酸甘油醛脱氢酶(G l y c e r a l d e h y d eＧ３Ｇp h o sＧp h a t e d e h y d r o g e n a s e,G P D)能够催化三磷酸甘油醛转变为１,３Ｇ二磷酸甘油酸,是糖酵解㊁糖异生和卡尔文循环过程中的关键酶[４].不同物种之间G P D 基因在进化上具有一定的保守性,常被用来进行物种鉴定和种内系统发育分析.现已被应用于鉴定匍柄霉属新品种[５]㊁松茸种的界定[６]以及对木耳属菌株进行分类[７]等.并且G P D基因在真菌中的表达受非生物因素胁迫诱导,当细胞处在干旱㊁高盐㊁低温等情况下,基因表达将发生明显的改变,现已被用于研究环境信号在凤尾菇[８]㊁构巢曲霉[９]㊁拟南芥[１０]等生物中对基因转录的调控.G P D启动子区域具有很强的调控异源基因转录的功能,被用于构建外源真菌高效转化系统.目前已经作为外源基因启动子用于转化香菇[１１Ｇ１３]㊁平菇[１４]㊁草菇[１４]㊁双孢菇[１５]及银耳[１６]等.然而到目前为止,在桦褐孔菌中还没有关于G P D的报道.
本研究以桦褐孔菌为研究对象,克隆G P D基因c D N A及启动子序列并进行了生物信息学分析,为桦褐孔菌菌株的分类鉴定㊁功能研究及高效表达载体的建立提供基因资源.
１㊀材料与方法
１．１㊀供试菌株
桦褐孔菌J L０１菌株由延边大学长白山生物资源与功能分子教育部重点实验室保存并提供.１．２㊀主要试剂
T R I z o l R R e a g e n t(美国L i f eT e c h n o l o g i e s公司), S M A R T e r T M R A C E c D N A A m p l i f i c a t i o n K i t(日本C l o n t e c h公司),普通琼脂糖凝胶D N A凝胶回收试剂盒(美国O m e g a公司),p M D１８ＧTＧV e c t o r,L A T a q酶(T a K a R a),D N A m a r k e rD L２０００b p,D N A m a r k e r D L５０００b p,G e n o m eW a l k i n g K i t(T a K a R a),氨苄青霉素(A M P),C h l o r o f o r m㊁I s o p r o p y la l c o h o l㊁E t h a n o l 等常规试剂均为国产分析纯.
１．３㊀菌核培养与R N A、D N A提取
取人工栽培的桦褐孔菌菌核,用滤纸吸干,液氮研磨成粉末状.R N A的提取方法参照T R I z o l试剂盒说明书,D N A的提取采用C T A B法,琼脂糖凝胶电泳和核酸蛋白测定仪B i o P h o t o m e r e rP l u s(德国E p p e n d o r f公司)检测提取质量和浓度.１．４㊀G P D基因的克隆
根据已报道的G P D基因序列保守区域,利用软件P r i m e r５设计２对简并引物,I o G P D f和I o G PＧD r(表１),以反转录产物c D N A为模板进行P C R扩
增;根据获得的G P D基因的保守片段,设计５ᶄR A C E的２个正向特异性引物G A P D HＧ５R１和G A P D HＧ５R２,用于获得５ᶄ端序列,设计３ᶄR A C E的２个下游特异性引物G A P D HＧ３R１和G A P D HＧ３R２,用于获得３ᶄ端序列(表１),具体步骤按照S MA R T e r T M R A C Ec D N A A m p l i f i c a t i o n K i t试剂盒的说明书进行.根据R A C E扩增结果设计G A PＧD HＧF和G A P D HＧR引物扩增G P D基因全长.
表１㊀G P D基因克隆P C R扩增所用引物
T a b l e１㊀P r i m e r s f o rP C Ra m p l i f i c a t i o no fG P D g e n e c l o n e s 引物引物序列S e q u e n c e s(５ᶄＧ３ᶄ)
I o G P D f G T N G G N A T HA A Y G G N T T Y G G
I o G P D r T A N C C C C A Y T C R T T R T C R T A C
G A P D HＧ５R１T G G A C G T T A C A A G G G A T C A G T C A C C
G A P D HＧ５R２A T C G T C C T C C G T A A T G C C C T T C A A T
G A P D HＧ３R１C A A G C A G G C A G T T A A A G C G G C G T C C G A G A P D HＧ３R２A G A A C T T C G T G A A G C T G G T C G C A T G G T G A P D HＧF A G C C T C C A C C A C A A C C A T
G A P D HＧR G T C A G C A A A A A A T A C A C A T A T １．５㊀G P D基因启动子的克隆
根据已克隆的G P D基因全长序列设计反向特异性引物,扩增三磷酸甘油醛脱氢酶基因侧翼未知序列,设计原则参照T a k a r a公司的G e n o m e W a l kＧi n g试剂盒说明书,引物设计如下:
S P１:５ᶄＧA C C T C C C A G A C T A C T G A T G C C AＧ３ᶄS P２:５ᶄＧC G A C T A C G G G G C T A C A A G C A G CＧ３ᶄS P３:５ᶄＧG T G A T G T T G G C T T T T C C G A A G AＧ３ᶄ
正向引物选用染色体步移试剂盒中的简并引物A P１.以基因组D N A为模板采用三轮巢式P C R方法进行扩增.
２㊀结果与分析
２．１㊀G P D基因序列分析
序列分析表明,桦褐孔菌G P D基因c D N A全长为１２２３b p,含有１０２０b p完整的开放阅读框(图１),G e n B a n k登录号为K X９８６８０１,共编码３３９个氨基酸,分子量是３６．３９k D a,理论等电点为８．２８.稳定系数(i n s t a b i l i t y i n d e x)为２２．５５,属于稳定蛋白.带负电荷的残基总数(A s p＋G l u)３６,
８
㊀第４期张宇婷,等:桦褐孔菌G P D 基因c D N A 序列和启动子的克隆与分析
带正电荷的残基的总数(A r g ＋L y s )３８.该蛋白的分子式是C １６３５H ２５９７N ４３１O ４９０S ８,脂肪指数９２．０１,平均亲水性系数为－０．００２
.
M :D L２０００m a r k e r ;１．２:G P D 基因c D N A 全长序列
图１㊀I o G P D 基因全长序列电泳检测图
F i g ．１㊀A g a r o s e g e l e l e c t r o p h o r e s i s o f f u l l l e n g
t ho f I o G P D g e n e ２．２㊀G P D 基因编码蛋白的生物信息学分析
２．２．１㊀氨基酸序列比对分析
利用N C B I 中的B L A S T 工具,对I o G P D 基因
编码的氨基酸序列进行相似性搜索(图２),结果显
示I o G P D 与其他真菌G P D 的相似性较高,I o G P D
基因编码的氨基酸序列与鲍姆桑黄(S a n g h u a n g Ｇ
p o r u s b a u m i i )和地中海嗜蓝孢孔菌(F o m i t i p o r i a Ｇ
m e d i t e r r a n e a )的G P D 相似性最高(８８％),与其他物种,如黑木耳(A u r i c u l a r i a a u r i c u l a Ｇj u d a e )(８１％)㊁亚光木耳(A u r i c u l a r i a s u b g
l a b r a )(８１％)㊁假蜜环菌(A r m i l l a r i a t a b e s c e n s )(８０％)
㊁近光彩裂孔菌(S c h i z o p o r a p a r a d o x a )(８０％)等氨基酸序列具有较高的相似性,证明克隆得到的基因是桦褐孔菌G P D 基因.
通过软件构建I o G P D 的系统发育树发现(
图３),桦褐孔菌G P D 蛋白和所选取的９个相近物种真
菌的G P D 蛋白可以划分为６个分支.其中,桦褐孔菌G P D 蛋白与鲍姆桑黄亲缘关系最近,聚为一组,与地中海嗜蓝孢孔菌的G P D 蛋白亲缘关系较近;黑木耳㊁亚光木耳㊁近光彩裂孔菌等聚为一组,与G P D
蛋白亲缘关系较远
.
注:桦褐孔菌(A R A ９０２８５．１);黑木耳(A E O ６２１６９．１);假蜜环菌(C A F ７４７８６．１);亚光木耳(E J D ４４５７８．１
);近光彩裂孔菌(K L O １８７５１．１);鲍姆桑黄(O C B ９１４７３．１);灰盖鬼伞菌(X P _００１８３４１５９．２);地中海嗜蓝孢孔菌(X P _００７２６４９７２．１
)图２㊀桦褐孔菌G P D 与其他真菌G P D 氨基酸序列比对分析
F i g ．２㊀C o m p a r i s o no f t h e a m i n o a c i d s e q u e n c e o f I n o n o t u s o b l i q u u s
G P Dw i t ho t h e r f u n g a lG P Ds e q
u e n c e s ９
延㊀边㊀大㊀学㊀农㊀学㊀学㊀报第４１卷
㊀
注:桦褐孔菌(K X ９８６８０１);黑木耳(A E O ６２１６９．１);亚光木耳(X P _００７３４７３２６．１);毛木耳(A I B ０６３５６．１);近光彩裂孔菌(K L O １８７５１．１
);地中海嗜蓝孢孔菌(X P _００７２６４９７２．１);鲍姆桑黄(O C B ９１４７３．１);肉芽肿菌(K D Q １８０３７．１);假蜜环菌(C A F ７４７８６．１);裸脚菇(F D Ｇ３１７M １
)图３㊀I o G P D 蛋白与其它物种G P D 蛋白的系统进化关系
F i g ．３㊀P h y i o g e n e t i c r e l a t e d n e s s o f I o
G P Dt o o t h e r f u n g
a lG P D p r o t e i n s ２．２．２㊀三磷酸甘油醛脱氢酶基因的亚细胞定位预测
利用T MHMM S e r v e rV．２．０㊁WO L FP S O R T 和S i g n a l P ４．１S e r v e r 对I o G P D 进行跨膜区㊁亚细胞定位和信号肽预测(图４).结果显示,I o G P D 蛋白质序列没有跨膜区,没有信号肽序列,定位于细胞质
.
图４㊀I o G P D 蛋白质的信号肽分析图F i g ．４㊀S i n g a l p e p
t i d e p r e d i c t i o no f I o G P D p r o t e i n ２．２．３㊀I o G P D 的保守结构域和功能域分析
利用I n t e r P r o S c a n５预测蛋白质的保守结构域和功能域结果表明,该蛋白属于３Ｇ磷酸甘油醛脱氢酶家族,属于３Ｇ磷酸甘油醛脱氢酶I 型.１Ｇ１７２位氨基酸属于N A D (P )结合域;１４９－１５６位氨基酸为３Ｇ磷酸甘油醛脱氢酶活性位点;１５６－３１３位氨基酸为３Ｇ磷酸甘油醛脱氢酶催化结构域,参与氧化还原过程.
２．２．４㊀疏水性分析
利用P r o t S c a l e 工具对I o G P D 蛋白的疏水性进行分析(图５
).图中的纵坐标表示氨基酸的疏水性值,该值如果大于０表示疏水,小于０表示亲水,横坐标表示氨基酸的位置.I o G P D 蛋白总平均疏水指数为－０．００２,小于０,因此,I o G P D 蛋白属于亲水性蛋白.该蛋白的疏水性最大值在３２７位氨基酸处,为２．８６７,最小值在１９２位氨基酸处,为－２．５１１
.
图５㊀I o G P D 蛋白的疏水性分析图
F i g ．５㊀H y d r o p h o b i c i t i y a n a l y
s i s o f I o G P D p r o t e i n s ２．２．５㊀I o G P D 的二级结构预测利用S OM P A 和S w i s s ＧM o d e lW o r k s p a c e 在线工具对I o G P D 进行蛋白质二级结构和三级结构预测(图６,７).结果显示,αＧ螺旋为２８．０２％,延伸链为２８．０２％,β
Ｇ折叠为９．７３％,无规则卷曲所占比例最大,为３４．２２％.I o G P D 与已知三级结构的G P D
０
１
㊀第４期张宇婷,等:桦褐孔菌G P D 基因c D N A 序列和启动子的克隆与分析
蛋白模板中相似性最高的为６８．８８％,GMQ E 值和
QM E A N ４值分别为０．８４和－０．２４,
说明自动构建的三级结构模型质量较高
.
图６㊀I o G P D 蛋白质的二级结构预测
F i g ．６㊀S e c o n d a r y s t r u c t u r e o f I o
G P D p r o t e i nb y S
O M P
A 图７㊀I o G P D 蛋白质的三级结构预测F i g ．７㊀T h e t e r t i a r y s
t r u c t u r e o f I o G P D p r o t e i n ２．３㊀G P D 启动子的克隆
根据已经克隆得到的G P D 基因序列设计反向特异性引物,以基因组D N A 为模板,采用三轮巢式P C R 方法进行扩增,
将扩增得到的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测(图８),将产物进行切胶㊁回收㊁连接转化和菌液检测后送去测序.测序结果显示,第３
轮P C R 获得序列去掉与I o G P D 基因重复序列后共４４６b p 启动子序列
.
１:第１轮P C R 产物２:第２轮P C R 产物３:第３轮P C R 产物
图８㊀I o G P D 启动子序列电泳检测图
F i g ．８㊀A g a r o s e g e l e l e c t r o p
h o r e s i s o f I o G P D p r o m o t e r ２．４㊀三磷酸甘油醛脱氢酶启动子序列分析
克隆得到的４４６b p 桦褐孔菌G P D 启动子序列,经N e u r a lN e t w o r kP r o m o t e rP r e d i c t i o n 软件进行预测分析结果显示,启动子包含２个高分值起始转录位点(表２);用P L A N T C A R E 在线对G P D 基因启动子序列的顺式作用元件进行分析(表３),启动子序列包含C A A Tb o x ㊁T A T A b o x 和C C A A T
１
１
延㊀边㊀大㊀学㊀农㊀学㊀学㊀报第４１卷㊀
b o x等基本顺式作用元件,A A G A AＧm o t i f顺式控制元件,L T R低温响应元件,S p１㊁T C C CＧm o t i f光响应元件,
c i r c a
d i a n生理昼夜节律控制元件和参与蛋白代谢调节的重要顺式作用元件O２Ｇs i t e.这些顺式作用元件可能影响G P D基因对特定的非生物因素的响应及调控,进而调控或诱导基因表达等.
表２㊀启动子预测分析
T a b l e２㊀P r o m o t e r p r e d i c t i o na n a l y s i s
分值启动子序列位点０．８７C A C C T C A C T A C A C C G C T A T A T A A A G T C C C T C C T C C C T T T C A T C C T C C C T T１１２~１６２０．９８T A C A C C G C T A T A T A A A G T C C C T C C T C C C T T T C A T C C T C C C T T T C C T T C A G１２０~１７０
表３㊀G P D基因启动子顺式作用元件
T a b l e３㊀C i sＧa c t i n g e l e m e n t s o f t h e G P D g e n e p r o m o t e r
调控元件核心序列位置功能
T A T Ab o x T A T A/T A A T A/T A T A A A/
A T A T A A/T A T A T G T/C A CＧ
T A T A T A A A G ＋１２４/＋１２８/
＋３４３/－２３７/
－２４０
c o r e p r o m o t e r e l e m e n t a r o u n d－３０o f t r a n s c r i p t i o ns t a r t
C C A A Tb o x C A A C G G＋６７MY B H v１b i n d i n g s i t e
C A A Tb o x C A A T/C A A A T/C A A T T＋３５０c o mm o n c i sＧa c t i n g e l e m e n t i n p r o m o t e r a n de n h a n c e r r e g i o n s L T R C C G A A A－３９４c i sＧa c t i n g e l e m e n t i n v o l v e d i n l o wＧt e m p e r a t u r e r e s p o n s i v e n e s s S p１C C(G/A)C C C＋１４１/＋１５３l i g h t r e s p o n s i v e e l e m e n t
T C C CＧm o t i f T C T C C C T－２３p a r t o f a l i g h t r e s p o n s i v e e l e m e n t
A A G A AＧm o t i f G A A A G A A－３３５
c i r c a
d i a n C A A N N N N A T C＋１８８c i sＧa c t i n g r
e g u l a t o r y e l e m e n t i n v o l v e d i nc i r c a d i a nc o n t r o l O２Ｇs i t e G A T G A T G T G G＋２７０c i sＧa c t i n g r e g u l a t o r y e l e m e n t i n v o l v e d i n z e i nm e t a b o l i s mr e g u l a t i o n S k nＧ１_m o t i
f G T C A T－２６４c i sＧa c t i n
g r e g u l a t o r y e l e m e n t r e q u i r e d f o r e n d o s p e r me x p r e s s i o n U n n a m e d__４C T C C＋１３９/＋１４２/
＋１５４/＋１７０
３㊀讨论与结论
该研究以桦褐孔菌为试验材料,成功克隆获得了桦褐孔菌G P D基因全长c D N A序列１２２３b p,其中包含的开放阅读框(O R F)为１０２０b p,编码３３９个氨基酸.利用WO L FP S O R T进行亚细胞定位预测结果显示,该蛋白位于细胞质中.利用I nＧt e r P r o S c a n５预测I o G P D蛋白属于３Ｇ磷酸甘油醛脱氢酶家族的I型.通过系统进化树分析结果显示,本试验所克隆得到的G P D基因与其他真菌的G P D一致性较高,I o G P D与地中海嗜蓝孢孔菌和鲍姆桑黄的G P D蛋白相似性最高,亲缘关系最近,为８８％,证明克隆得到的I o G P D基因是桦褐孔菌的基因序列.
在基因表达调控过程中,启动子起着十分重要的作用,决定目的基因表达的起始位点,时间和表达的速率.本实验中使用T a k a r a公司的G e n o m e W a l k i n g试剂盒,根据已知基因序列,高效获取基因侧翼序列,具有高效简便,特异性强,灵敏度高等特点.本试验利用染色体步移技术进行三轮巢式P C R,克隆桦褐孔菌G P D基因启动子序列,得到２条特异性条带进行回收测序,并对测序结果进行分析,其中,７１１b p条带含启动子序列,其中启动子序列４４６b p,经N e u r a lN e t w o r kP r o m o t e rP r e d i c t i o n 软件进行预测分析结果显示,启动子包含２个高分值起始转录位点.用P L A N T C A R E在线对I o GＧP D启动子序列的顺式作用元件进行分析结果显示,启动子序列包含C A A T b o x㊁T A T A b o x㊁C C A A Tb o x等基本顺式元件和A A G A AＧm o t i f㊁L T R(低温响应元件)㊁S p１(光响应元件)㊁T C C CＧm o t i f(光响应元件)㊁c i r c a d i a n(生理昼夜节律控制元件)㊁O２Ｇs i t e(参与蛋白代谢调节)等重要顺式作用元件.T A T Ab o x是核心启动子的基本元件,是R N A聚合酶Ⅱ的识别位点,对转录起点的定位起关
２１
㊀第４期张宇婷,等:桦褐孔菌G P D基因c D N A序列和启动子的克隆与分析
键作用,一般存在转录起始位点－３０b p处.
C C A A Tb o x为一般上游启动子元件,是MY B H v１结合位点,并非所用真核生物基因的启动子都存在一般上游元件.C A A T b o x是启动子近侧的序列元件,常常表现出细胞类型的特异性,其主要功能是提高转录效率和特异性.S p１因子是各类细胞均存在的,能够提高基因的转录水平.试验克隆得到的I o G P D启动子片段具有与香菇㊁草菇㊁金针菇㊁灰树花及云芝中报道的相同的C T富含区,C A A TＧb o x, T A T AＧb o x等启动子基本顺式作用元件,说明在进化过程中有些真菌的G P D启动子序列具有很高的保守性,这使得G P D启动子在不同真菌转化中可能具有一定的通用性,例如来自香菇的G P D启动子在平菇㊁灵芝㊁草菇中都有驱动外源基因表达的活性.参考文献:
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３１。