土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
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碳源：葡萄糖、尿素 氮源：尿素
〖思考2〗该培养基对微生物 具有 （具有， 不具有）选择作用。如果具有，其选择 机制是 只有能够以尿素作为氮源的微生 。 物才能在该培养基上生长
4、培养基选择分解尿素的微生物的原理 培养基的氮源为尿素，只有能合成脲酶的微生物 才能分解尿素，以尿素作为氮源。缺乏脲酶的微 生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长繁 殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出 分解尿素的微生物。
方格网上刻有9个 大方格，其中只有 中间的一个大方格 为计数室，供微生 物计数用。
大方格的长和宽各为1mm，深度 为0.1mm，即1mm×1mm×0.1mm， 其容积为0.1mm3；
大方格
中 方 格
小 方 格
2、计数
16×25型： 一般取四角的 四个中方格（100 个小方格）计数 25×16型： 一般计数四个角 和中央的五个中方 格（80个小方格） 的细胞数。
1.间接计数法（活菌计数法） （1）常用方法：稀释涂布平板法。 （2）原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表
㈡.统计菌落数目：
每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M
面生长的一个菌落，来源于样品稀释 液中的一个活菌，通过统计平板上的 菌落数，就能推测出样品中大约含有 多少活菌。
其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平 均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液 的体积(ml)，M代表稀释倍数。
3、计算
以1mm×1mm×0.1mm型为例
计数室容积为0.1mm3，则每个小方格的容积 为1/4000 mm3 。
酵母细胞个数／1mL =
100个小方格细胞总数/ 100 ×400×10000×稀释倍数
80个小方格细胞总数/ 80 ×400×10000×稀释倍数
（三）.设置对照：
设置对照的主要目的是排除实验组中非测试 因素对实验结果的影响，提高实验结果的生物的培养与观察
培养不同微生物往往需要不同培养温度。 细菌：30～37℃培养1～2d 放线菌：25～28℃培养5～7d 霉菌：25～28℃的温度下培养3～4d。 在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。 选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止 因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。
当菌落数目稳定时，选取菌落数在30～
2、实验室中微生物的筛选原理：
人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温 度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。
3、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基： KH2PO4 1.4g NaH2PO4 2.1g MgSO4`7H2O 0.2g 葡萄糖 10.0g 尿素 1.0g 琼脂 15.0g ①从物理性质看此培养基属于哪类？从功能上属 于哪类培养基？ 固体培养基 选择培养基 ②在此培养基中哪些作为碳源、氮源？
300的平板进行计数。在同一稀释度下， 至少对3个平板进行重复计数，然后求出 平均值，并根据平板所对应的稀释度计 算出样品中细菌的数目。
微生物的培养与观察
（六）鉴定：筛选后必鉴定 鉴别培养基：加入某种指示剂或化 学药品，不影响微生物的生存 1、酚红培养基： 鉴定分解尿素的细菌。 原理：脲酶催化尿素分解成氨 →培养基碱性增强→ 酚红变红→脲 酶阳性 2、伊红—美蓝培养基： 鉴定大肠杆菌。 原理：代谢产物与伊红—美蓝 结合→ 菌落呈深紫色并带有金属光 泽。
[三]样品的稀释
◆应在火焰旁称取土壤10g。 ◆在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行
◆分离不同的微生物采用不同的稀释度 原因：不同微生物在土壤中含量不同 目的：保证获得菌落数在30～300之间、适于 计数的平板
为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释 度？测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解 尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？ 是不同的。例如在干旱土壤中的上层样本中： 好氧及兼性厌氧细菌数约为 2 185万，放线菌数 约为477万，霉菌数约为23.1万。
选择培养基：在微生物学中，将允许特定
种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类 微生物生长的培养基。
※几种常见选择培养基
1、加入青霉素的培养基 分离酵母菌、霉菌等真菌 2、不加氮源的无氮培养基 分离固氮菌 3、不加含碳有机物的无碳培养基
分离自养型微生物 4、加入高浓度食盐的培养基 分离金黄色葡萄球菌
注意事项
①为了保证结果准确，一般选择菌落数在30— —300的平板上进行计数。 ②为使结果接近真实值可将同一稀释度涂布至 少3个平板，经涂布，培养计算出菌落平均数。 ③统计的菌落数往往比活菌的实际数目低。
如何从平板上的菌落数推测出每克 样品中的菌落数？
• 统计某一稀释度下平板上的菌落数，最好 能统计3个平板，计算出平板菌落数的平均 值，然后按课本旁栏的公式进行计算
三、操作提示
无菌操作 做好标记 制定计划
课题成果与评价
（一）培养物中是否有杂菌污染以 及选择培养基是否筛选出菌落
对照的培养皿在培养过程中没有菌 落生长，说明培养基没有被杂菌污染。 牛肉膏培养基的菌落数目明显大于选择 培养基的数目，说明选择培养基已筛选 出一些菌落。
（二）样品的稀释操作是否成功 如果得到了2个或2个以上菌落数目在30～ 300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够 进行菌落的计数。 （三）重复组的结果是否一致 如果学生选取的是同一种土样，统计的结 果应该接近。如果结果相差太远，需要进一步 分析产生差异的原因。
实验设计：
根据图示2－7填写以下实验流程：
配制土壤 溶液
系列稀释
涂布平板 与培养
菌落计数
实验的具体操作
㈠.土壤取样
从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层 土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的 信封中。 ◆取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使
用前都要灭菌。
㈡.制备培养基：
制备以尿素为唯一氮源的选择培养基。
㈡.统计菌落数目：
2、显微镜直接计数：
利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积里 样品中微生物的数量。
缺点 不能区分死菌与活菌；
不适于对运动细菌的计数； 需要相对高的细菌浓度； 个体小的细菌在显微镜下难以观察；
一、血球计数板
1、血球计数板的结构
血球计数板是一种专门用于计算较大 单细胞微生物数量的仪器，由一块比普 通载玻片厚的特制玻片制成的玻片中有 四条下凹的槽，构成三个平台。中间的 平台较宽，其中间又被一短横槽隔为两 半，每半边上面刻有一个方格网。
原因：土壤中各类微生物的数量（单位：株/kg）
结论：为获得不同类型的微生物，就需要按不
同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地 提供选择培养的条件。
㈣.取样涂布
◆实验时要 对培养皿作 好标记。注 明培养基类 型、培养时 间、稀释度、 培养物等。
◆如果得到了2个或2个以上菌落数目在30——300的 平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计 数，如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大， 表明试验不精确，需要重新实验。
专题 微生物的培养与应用 课题 土壤中分解尿素的细菌的 分离与计数
一、课题背景 1、尿素的利用 尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被 农作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨之后 才能被植物利用。 2、细菌利用尿素的原因
土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶 CO(NH2)2 + H2O 脲酶
准备牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基将菌 液稀释相同的倍数，在牛肉膏蛋白胨培养基上生 长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目， 因此，牛肉膏蛋白胨培养基可以作为对照，用来 判断选择培养基是否起到了选择作用。由于初次 实验，对于稀释的范围没有把握，因此选择了一 个较为宽泛的范围：稀释倍数为103～107。每个 稀释度下需要3个选择培养基，1个牛肉膏蛋白胨 培养基，因此共需要15个选择培养基，5个牛肉 膏蛋白胨培养基。此外，还需要准备8个灭菌的试 管和1个灭菌的移液管。
例如：鉴别大肠杆菌培养基
伊红—美蓝培养基是鉴别培养基，可以 用来检测自来水中的大肠杆菌是否超标，因 为的代谢产物与伊红—美蓝结合，使菌落呈 深紫色并带有金属光泽，使大肠杆菌的菌落 显示出来，并没有促进大肠杆菌的生长和抑 制其他微生物的生长。
大肠杆菌在伊红美蓝琼脂(EMB)上典型特征
大肠杆菌呈 黑色中心 ,有或无金属光泽
2NH3 + CO2
3、常见的分解尿素的微生物 芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、 棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，某些真菌和放线菌。
4、课题目的 ①从土壤中分离出能够分解尿素的细菌 ②统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌
一.研究思路
㈠.筛选菌株 ㈡.统计菌落数目 ㈢.设置对照
1、实例： DNA多聚酶链式反应是 一种在体外将少量DNA 大量复制的技术，此项 技术要求使用耐高温 （930C）的DNA聚合酶。 原因：因为热泉温度70～800C，淘汰了绝大 多 数微生物只有Taq细菌被筛选出来。 启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的 要求，到相应的环境中去寻找。
〖思考2〗该培养基对微生物 具有 （具有， 不具有）选择作用。如果具有，其选择 机制是 只有能够以尿素作为氮源的微生 。 物才能在该培养基上生长
4、培养基选择分解尿素的微生物的原理 培养基的氮源为尿素，只有能合成脲酶的微生物 才能分解尿素，以尿素作为氮源。缺乏脲酶的微 生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长繁 殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出 分解尿素的微生物。
方格网上刻有9个 大方格，其中只有 中间的一个大方格 为计数室，供微生 物计数用。
大方格的长和宽各为1mm，深度 为0.1mm，即1mm×1mm×0.1mm， 其容积为0.1mm3；
大方格
中 方 格
小 方 格
2、计数
16×25型： 一般取四角的 四个中方格（100 个小方格）计数 25×16型： 一般计数四个角 和中央的五个中方 格（80个小方格） 的细胞数。
1.间接计数法（活菌计数法） （1）常用方法：稀释涂布平板法。 （2）原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表
㈡.统计菌落数目：
每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M
面生长的一个菌落，来源于样品稀释 液中的一个活菌，通过统计平板上的 菌落数，就能推测出样品中大约含有 多少活菌。
其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平 均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液 的体积(ml)，M代表稀释倍数。
3、计算
以1mm×1mm×0.1mm型为例
计数室容积为0.1mm3，则每个小方格的容积 为1/4000 mm3 。
酵母细胞个数／1mL =
100个小方格细胞总数/ 100 ×400×10000×稀释倍数
80个小方格细胞总数/ 80 ×400×10000×稀释倍数
（三）.设置对照：
设置对照的主要目的是排除实验组中非测试 因素对实验结果的影响，提高实验结果的生物的培养与观察
培养不同微生物往往需要不同培养温度。 细菌：30～37℃培养1～2d 放线菌：25～28℃培养5～7d 霉菌：25～28℃的温度下培养3～4d。 在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。 选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止 因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。
当菌落数目稳定时，选取菌落数在30～
2、实验室中微生物的筛选原理：
人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温 度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。
3、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基： KH2PO4 1.4g NaH2PO4 2.1g MgSO4`7H2O 0.2g 葡萄糖 10.0g 尿素 1.0g 琼脂 15.0g ①从物理性质看此培养基属于哪类？从功能上属 于哪类培养基？ 固体培养基 选择培养基 ②在此培养基中哪些作为碳源、氮源？
300的平板进行计数。在同一稀释度下， 至少对3个平板进行重复计数，然后求出 平均值，并根据平板所对应的稀释度计 算出样品中细菌的数目。
微生物的培养与观察
（六）鉴定：筛选后必鉴定 鉴别培养基：加入某种指示剂或化 学药品，不影响微生物的生存 1、酚红培养基： 鉴定分解尿素的细菌。 原理：脲酶催化尿素分解成氨 →培养基碱性增强→ 酚红变红→脲 酶阳性 2、伊红—美蓝培养基： 鉴定大肠杆菌。 原理：代谢产物与伊红—美蓝 结合→ 菌落呈深紫色并带有金属光 泽。
[三]样品的稀释
◆应在火焰旁称取土壤10g。 ◆在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行
◆分离不同的微生物采用不同的稀释度 原因：不同微生物在土壤中含量不同 目的：保证获得菌落数在30～300之间、适于 计数的平板
为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释 度？测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解 尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？ 是不同的。例如在干旱土壤中的上层样本中： 好氧及兼性厌氧细菌数约为 2 185万，放线菌数 约为477万，霉菌数约为23.1万。
选择培养基：在微生物学中，将允许特定
种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类 微生物生长的培养基。
※几种常见选择培养基
1、加入青霉素的培养基 分离酵母菌、霉菌等真菌 2、不加氮源的无氮培养基 分离固氮菌 3、不加含碳有机物的无碳培养基
分离自养型微生物 4、加入高浓度食盐的培养基 分离金黄色葡萄球菌
注意事项
①为了保证结果准确，一般选择菌落数在30— —300的平板上进行计数。 ②为使结果接近真实值可将同一稀释度涂布至 少3个平板，经涂布，培养计算出菌落平均数。 ③统计的菌落数往往比活菌的实际数目低。
如何从平板上的菌落数推测出每克 样品中的菌落数？
• 统计某一稀释度下平板上的菌落数，最好 能统计3个平板，计算出平板菌落数的平均 值，然后按课本旁栏的公式进行计算
三、操作提示
无菌操作 做好标记 制定计划
课题成果与评价
（一）培养物中是否有杂菌污染以 及选择培养基是否筛选出菌落
对照的培养皿在培养过程中没有菌 落生长，说明培养基没有被杂菌污染。 牛肉膏培养基的菌落数目明显大于选择 培养基的数目，说明选择培养基已筛选 出一些菌落。
（二）样品的稀释操作是否成功 如果得到了2个或2个以上菌落数目在30～ 300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够 进行菌落的计数。 （三）重复组的结果是否一致 如果学生选取的是同一种土样，统计的结 果应该接近。如果结果相差太远，需要进一步 分析产生差异的原因。
实验设计：
根据图示2－7填写以下实验流程：
配制土壤 溶液
系列稀释
涂布平板 与培养
菌落计数
实验的具体操作
㈠.土壤取样
从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层 土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的 信封中。 ◆取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使
用前都要灭菌。
㈡.制备培养基：
制备以尿素为唯一氮源的选择培养基。
㈡.统计菌落数目：
2、显微镜直接计数：
利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积里 样品中微生物的数量。
缺点 不能区分死菌与活菌；
不适于对运动细菌的计数； 需要相对高的细菌浓度； 个体小的细菌在显微镜下难以观察；
一、血球计数板
1、血球计数板的结构
血球计数板是一种专门用于计算较大 单细胞微生物数量的仪器，由一块比普 通载玻片厚的特制玻片制成的玻片中有 四条下凹的槽，构成三个平台。中间的 平台较宽，其中间又被一短横槽隔为两 半，每半边上面刻有一个方格网。
原因：土壤中各类微生物的数量（单位：株/kg）
结论：为获得不同类型的微生物，就需要按不
同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地 提供选择培养的条件。
㈣.取样涂布
◆实验时要 对培养皿作 好标记。注 明培养基类 型、培养时 间、稀释度、 培养物等。
◆如果得到了2个或2个以上菌落数目在30——300的 平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计 数，如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大， 表明试验不精确，需要重新实验。
专题 微生物的培养与应用 课题 土壤中分解尿素的细菌的 分离与计数
一、课题背景 1、尿素的利用 尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被 农作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨之后 才能被植物利用。 2、细菌利用尿素的原因
土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶 CO(NH2)2 + H2O 脲酶
准备牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基将菌 液稀释相同的倍数，在牛肉膏蛋白胨培养基上生 长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目， 因此，牛肉膏蛋白胨培养基可以作为对照，用来 判断选择培养基是否起到了选择作用。由于初次 实验，对于稀释的范围没有把握，因此选择了一 个较为宽泛的范围：稀释倍数为103～107。每个 稀释度下需要3个选择培养基，1个牛肉膏蛋白胨 培养基，因此共需要15个选择培养基，5个牛肉 膏蛋白胨培养基。此外，还需要准备8个灭菌的试 管和1个灭菌的移液管。
例如：鉴别大肠杆菌培养基
伊红—美蓝培养基是鉴别培养基，可以 用来检测自来水中的大肠杆菌是否超标，因 为的代谢产物与伊红—美蓝结合，使菌落呈 深紫色并带有金属光泽，使大肠杆菌的菌落 显示出来，并没有促进大肠杆菌的生长和抑 制其他微生物的生长。
大肠杆菌在伊红美蓝琼脂(EMB)上典型特征
大肠杆菌呈 黑色中心 ,有或无金属光泽
2NH3 + CO2
3、常见的分解尿素的微生物 芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、 棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，某些真菌和放线菌。
4、课题目的 ①从土壤中分离出能够分解尿素的细菌 ②统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌
一.研究思路
㈠.筛选菌株 ㈡.统计菌落数目 ㈢.设置对照
1、实例： DNA多聚酶链式反应是 一种在体外将少量DNA 大量复制的技术，此项 技术要求使用耐高温 （930C）的DNA聚合酶。 原因：因为热泉温度70～800C，淘汰了绝大 多 数微生物只有Taq细菌被筛选出来。 启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的 要求，到相应的环境中去寻找。