杆状病毒——昆虫细胞表达系统

实验材料：
1. 重组杆状病毒质粒：Bacmid/nsp-6及阳性对照Bacmid/CAT，已构建成功。

2. 昆虫细胞Sf9、High Five及其相关培养基、转染试剂均购自Invitrogen公司。

抗His单克隆抗体购自Oncogene公司，CAT-ELISA试剂盒购自Roche。

实验步骤：
一、昆虫细胞转染：
1． Sf9细胞计数，取6孔板中的两孔，每孔加入9×10 5个细胞(其中一孔设为正常对照)，并以全培培养至少1小时，使细胞贴壁。

2．准备重组质粒和细胞转染试剂的混合物：
a. 溶解1μg纯化重组杆状病毒重组质粒于100μl 无添加成分的Grace’s Medium。

b. 转染试剂充分摇匀后取6μl加入100μl 无添加成分的Grace’s Medium，混匀。

c. 将上述稀释好的质粒及稀释好的转染剂混匀，室温孵育20min。

3．重组质粒与转染剂混合液孵育的同时，以2ml无添加成分的Grace’s Medium洗涤待转染的一孔细胞并弃去洗液。

4．取0.8ml无添加成分的Grace’s Medium加入质粒与转染剂的混合液中，轻轻混匀后，总体积约为1ml。

加入上步洗涤后的细胞孔中，27℃继续培养5h。

5．移除质粒、转染剂混合物，加入2ml全培。

27℃湿盒孵育，直到病变现象产生。

二、病毒贮液的制备：
1. 病毒感染晚期（正常24-72h）可见细胞停止生长、黏附，呈颗粒状外观。

即收集含病毒的培养上清，500g离心5min，去除细胞和碎片。

2. 上清即为P1病毒贮液，移入新的离心管中4℃避光保存。

长期保存分装冻存于-80℃。

3. 病毒贮液的扩增，按以下公式进行所需病毒P1贮液的量：
感染所需病毒贮液量(ml)=
[MOI(pfu/cell) ×细胞数÷病毒贮液效价(pfu/ml)]
注：若不进行病毒空斑测定，P1贮液效价按照1×10 6到1×10 7计。

4. 扩增P1液制备P2病毒贮液方法如下：
a. 转染当天，取2×106个细胞/孔加入六孔板中，贴壁生长至少1h。

b. 每孔加入适量的P1贮液，27℃湿盒孵育48h。

c. 根均细胞病变情况（约48h后）收集各孔中的病毒上清液，500g离心5min取上清，即为P2病毒贮液。

4℃避光保存。

长期保存分装冻存于-80℃。

d. 制备了高效价的P2液后，按上述方法扩增P3贮液，用于高效表达。

三、病毒贮液初步鉴定
1. SDS-PAGE蛋白电泳：取P2或P3病毒贮液浓缩后上样（或直接上样）进行SDS-PAGE 蛋白电泳，初步根据分子量对表达蛋白进行鉴定。

CAT-his融合蛋白分子量约为28KDa，nsp6-his融合蛋白分子量约为34KDa。

2. western blot：以小鼠抗his单克隆抗体鉴定在相应条带出是否有his标记。

3. 以CAT-ELISA检测试剂盒检测Bacmid/CAT对照的蛋白表达情况。

方法详见CAT-ELISA 试剂和说明书。

结果
1. CAT-ELISA检测试剂盒成功检测出对照CAT质粒在细胞中的表达，同时可测于上清和细
胞中。

2. 蛋白电泳和免疫印迹均看见对照his-CAT蛋白表达，但不见我想表达的非结构蛋白his-nsp-6。

在接下来的这段时间里，一直在进行条件的摸索，现在把这段时间的结果报告一下：
1. 利用细胞DNA提取试剂盒提取感染细胞的DNA，用针对目的基因的特异性引物以PCR 的方法鉴定，发现结果呈阳性，表明该质粒成功转染，但为何不表达，仍需摸索。

2.根据上述结果，在后续的实验当中发现用感染的细胞涂片，使用特异性针对目的蛋白的抗体做免疫荧光鉴定，发现呈阳性，这一点证实转染的质粒成功且有蛋白表达，问题是为什么表达量如此低，以至于免疫印迹检测不出来？
下一步将要进行的工作是，摸索如何提高蛋白表达量的方法，使用空斑纯化获得较纯的病毒不知道能不能提高蛋白表达量？这一点，也请有经验的站友给与指导，谢谢！。