低分子肝素抗肝癌细胞增殖及机制研究

低分子肝素抗肝癌细胞增殖及机制研究陈公英李敏伟陈智顾新宇周慧明

【摘要】［目的］研究低分子肝素（LMWH）抗肝癌细胞SMMC-7721增殖作用及机制。［方式］ MTT法测LMWH、UFH及联合化疗药物阿霉素(ADR)对SMMC-7721的生长抑制作用，流式细胞仪Annexin V FITC-PI法检测细胞凋亡发生率，同时Western blot检测细胞p53、bcl-2蛋白表达。［结果］ LMWH、UFH能抑制细胞生长，呈剂量依托关系，并与诱导细胞凋亡有关；化疗药物ADR联合肝素有协同抗增殖作用。LMWH、UFH增进细胞凋亡进程中，p53表达无明显改变，bcl-2表达略下调。［结论］肝素、低分子肝素可通过诱导细胞凋亡发挥抗肝癌作用；化疗药物ADR联合肝素有协同抗增殖作用。

【关键词】低分子肝素流式细胞术凋亡阿霉素肝癌细胞

肝素（高硫酸化葡萄胺聚糖）是一种重要的抗凝药物。除抗凝活性之外，近来发觉其具有抗肿瘤、抗炎症、抗病毒等生物学作用，专门是抗肿瘤作用更受学者关注。最近几年进展起来的一种生化药物低分子量肝素，减少了由完整肝素带来的出血和血小板减少等副作用[1]，因此用于医治某些恶性肿瘤成效好且平安。本文要紧研究低分子

肝素抗肝癌细胞SMMC?鄄7721的增殖作用及机制。

1 材料与方式

材料

肝素钠注射液，12 500U/2ml (南京新天生物)；低分子量肝素钠，4 250IU/（意大利ALFA WASSERMANN 大药厂）；MTT（Sigma公司）；ANNEXIN V?鄄PI检测试剂盒（美国CALTAG 公司）；鼠抗人p53、bcl?鄄 2 单克隆抗体（DAKO公司）； biotinylated protein ladder detection pack(cell signaling 公司)；肝癌细胞株SMMC?鄄7721购于中科院上海细胞生物所。要紧仪器：免疫学标本制备仪（EPICS?鄄Q?鄄PREP型，美国Coulter公司产品），流式细胞仪（EPICS?鄄XL 型，美国Coulter公司产品）。

方法

细胞培育

肝癌细胞株SMMC?鄄7721采纳含10%（V/V）的小牛血清、300μg/ml L?鄄谷氨酰胺、100IU/ml青霉素和25μg/ml链霉素的RPIM1640（GIBCO BL）培育基、在37℃、5%CO2 及饱和湿度的条件下

培育。

细胞增殖抑制实验

按文献方式[1]将对数生长期细胞按2×104（100μl）/孔接种于96孔板，用含10%的小牛血清的培育基100μl培育24h，去掉培育基，加入用完全培育基配制的不同浓度两种肝素（0～100U/ml），并选择适合剂量25U/ml、50U/ml肝素加入亚毒性剂量的阿霉素，用完全培育基加至100μl；同时设空白对照，每一个浓度均设3个复孔。培育48h后，每孔加入20μl(5mg/ml)MTT，孵育4h。倾去上清液，加入二甲亚砜150μl/孔，于酶标仪上读取A570nm值，计算细胞生长抑制率=[（1-实验组吸光值/对照组吸光值）]×100%，得出量效关系曲线。

凋亡检测

将细胞以105/ml接种于24孔。用含有10%的小牛血清的培育基1ml培育24 h后倾去培育液，加入含适合剂量肝素的完全培育基1ml，培育48h,以不用肝素处置的细胞作阴性对照。采纳流式细胞术检测Annexin V和碘化丙啶（PI）荧光标记细胞凋亡值。操作严格按试剂盒说明书进行。结果以Annexin V染色阳性，PI染色阴性判定。

Western blot 分析

采纳细胞裂解缓冲液(25mmol/L Hepes，%Triton X?鄄100，1%去氧胆酸钠，%SDS，L NaCl，5mmol/L EDTA，50mmol/L NaF，1mmol/L PMSF，L Leupeptin) 4℃ 30min裂解细胞。15 000g 离心15min，取上清液。用Bradford法进行蛋白定量。加上样缓冲液(42mmol/L Tris?鄄HCl，10% 甘油, % SDS，5% 2?鄄巯基乙醇、% 溴芬蓝) 煮沸3min 后，10%SDS?鄄PAGE电泳、转移到PVDF膜，anti?鄄bcl?鄄二、p53一抗4℃孵育留宿，与标有HRP二抗结合，化学发光剂ECL显影。

统计分析

实验数据以平均值表示，采纳统计软件，进行独立样本t查验及直线相关分析。

2 结果

肝素对肝癌细胞增殖的抑制作用

肝癌细胞SMMC?鄄7721在别离与不同剂量100U/ml、50U/ml、25U/ml、ml的肝素培育48h进行后，其对细胞生长的抑制率别离为，肝素组%、%、%、%；低分子量肝素组%、%、%、%。相同浓度的两种肝素，LMWH抗癌作用明显高于肝素（t=，P<）;细胞增殖呈肝素浓度

依托关系（R=，P<），见图1。

肝素联合阿霉素对肝癌细胞增殖的协同抑制作用

SMMC?鄄7721细胞在与50U/ml浓度的肝素及亚毒性剂量的阿霉素（μg/ml）一起培育48h后，进行MTT实验，其结果如图2所示。ADR（μg/ml）抑制率%、肝素%、肝素+ADR %、LMWH %、LMWH+ADR %。两种肝素联合阿霉素对肝癌细胞增殖有显著的协同抑制作用（t1=，P<；t2=，P<）。肝素诱导肝癌细胞凋亡的作用

不同浓度的两种肝素处置SMMC?鄄7721细胞48h凋亡细胞明显增加。详见表一、图3。磷脂酰丝氨酸(phosphatidylscrine，PS)散布于细胞膜内，细胞发生凋亡的初期便从膜内翻转至膜外。Annexin V 在Ca＋＋存在时能够和PS特异结合。

肝素作用SMMC?鄄7721 p53，bcl?鄄2表达改变

在利用肝素处置SMMC?鄄7721细胞后，两种肝素两种剂量对p53基因表达无显著性阻碍，bcl?鄄2表达略降低，见图3。

3 讨论