宋应亮外泌体文献

宋应亮外泌体文献
细胞外囊泡(EVs)是一种磷脂双层膜封闭结构，包含RNA、蛋白质、脂质、代谢物和其他分子，由各种细胞分泌到体液中。

EV介导的生物分子转移是各种生理和病理过程的重要组成部分。

EV在新的诊断和治疗策略中的潜在应用已经引起了越来越多的关注。

然而，由于EV固有的复杂的生物发生以及它们在大小、组成和起源上的巨大异质性，其研究仍然具有很高的挑战性。

有必要建立标准化的方法来解决EV的异质性和EV研究中分析前和分析多样性的来源。

在此，我们回顾了为EV分离和表征而开发的技术，并讨论了EV研究的标准化路径。

一、EV的生物发生、生物学意义和应用
EV是一种磷脂双层膜封闭的生物实体，存在于多种生理液体中。

EV由各种类型的细胞分泌，携带来自其亲本细胞的重要生物分子。

EV的生成涉及多种生物发生途径，根据这些途径，EV可细分为几种类型，包括外泌体和微囊泡(MVs)。

外泌体(30-150nm)是通过核内体膜向多囊内体(MVEs)成熟过程中向内出芽产生的，而MVs(100-1000nm)是由质膜向外出芽形成的。

然而，它们仍然有几个共同的特征，包括：脂质和蛋白质聚集在核内体/质膜上；通过各种分选机制隔离胞质核酸、蛋白质和其他生物分子，然后使小囊泡出芽和裂变；以及涉及对接、融合和摄取的细胞间运输。

凋亡过程中形成的囊泡大于1000nm，称为凋亡小体。

最近创造的术语“外膜”描述了最小的(＜50nm)非膜结合纳米颗粒和更大的大分子复合物，也可以包括在总的术语“EVs”
下。

分选机制在涉及的细胞内复合物方面是多种多样的，可以大致分为两种主要途径，依赖运输所需的核内体分选复合体(ESCRT)和非依
赖ESCRT。

ESCRT依赖的机制是逐步发挥作用的，其中一系列ESCRT
亚复合物(如TSG101、CHMP蛋白)参与其中。

非依赖ESCRT的途径涉
及神经酰胺依赖途径，该途径产生膜亚结构域和四酯蛋白，如CD63、CD81和CD9，在膜上形成簇，诱导囊泡向内出芽和EV的形成。

此外，细胞质蛋白，如热休克70kDa蛋白(HSP70)，被归于来自大多数细胞
类型的外泌体中。

核酸(DNA、mRNA和miRNA)是EV携带的另一种重要的分子。

miRNA的分类是序列依赖的，导致特定miRNAs在EV中的差异分类。

总的来说，EV的形成有多种途径，导致异质种群的释放，
可能在大小、组成和功能上存在很大差异。

到目前为止，仍然很难根据分离的囊泡的亚群来确定一个特定的途径。

因此，显然需要更好地理解区分EV的生物发生、分类和释放的因素。

国际细胞外囊泡协会(ISEV)推荐使用“EV”作为这些类型的囊泡的总称，因为很难将EV分配给特定的生物发生途径，除非通过实时
成像技术在释放过程中被捕获。

ISEV还建议根据EV的物理特征进行分类，如大小和密度、不同的生化组成和表面电荷量。

一旦EV被释放到细胞外空间，它们就会被受体细胞内化（内吞、吞噬或微胞吞作用），然后转移EV的遗传物质和蛋白质，进一步与靶细胞的细胞信号通路相互作用。

EV用于在免疫细胞[树突状细胞(DCs)、B细胞、T细胞]之间传递信息，从而对免疫应答产生免疫抑制或免疫
激活作用。

中枢神经系统(CNS)的细胞使用EV作为信号传递到其他神经元细胞的主要途径。

更重要的是，EV已被发现在神经退行性疾病
如帕金森病和阿尔茨海默病在中枢神经系统的解剖连接区域之间的
传播中起作用。

在心血管系统中，心脏成纤维细胞EV富含miR-21，这是心肌肥厚的重要旁分泌信号中介。

此外，据报道，肿瘤来源的
EV在癌症的标志中发挥作用，如肿瘤生长、侵袭性、避免凋亡、免
疫细胞调节、抵抗和转移。

EV携带多种生物物质，被认为反映了亲本细胞的生理状态。

EV
的成分已经在病理生理状态的探测中被研究作为疾病诊断和监测的
潜在生物标志物。

例如，来自结直肠癌(CRC)患者血液样本的上皮来
源EV的miRNA分析显示，与健康个体相比，13个EpCAM+-EVmiRNA
水平升高。

此外，I期非小细胞肺癌(NSCLC)患者的EV miRNA图谱能够区分癌症的不同阶段。

在蛋白质方面，我们发现CD147在CRC细胞系分泌的EV以及CRC患者的血清中富集。

癌症患者中CD9和CD147
均呈阳性的EV水平显著高于健康供体。

尽管这些研究突出了EV的诊断潜力，但EV分离和鉴定方面的挑战直接影响了EV生物标志物的特异性和敏感性，以及它们转化为强大诊断工具的能力。

EV已被用于运输多种治疗分子，如siRNA、miRNA和小分子。

各种方法，如转染、孵育、超声处理、循环冻融和电穿孔处理，已经被开发出来用于装载这些分子。

装载方法的选择取决于装载分子的类型；例如，对于小的非编码RNA(siRNA和miRNA)，分离前转染亲本细胞
和分离后电穿孔是目前首选的方法。

小分子抗癌药物如阿霉素和紫杉
醇可通过孵育被纳入EV，并在临床前研究中显示了增强的抗肿瘤活性。

与其他传递载体相比，工程EV提供的一个独特优势是能够整合配体，它可以特异性地靶向癌细胞并逃避免疫反应。

Kalluri实验室已经表明，装载siRNA的CD47+EVs仅靶向KRAS突变的肿瘤，与携带类似数量的的脂质体相比，显示出更高的治疗效果。

来自Amiji实验室的研究者使用了一种新的方法来调节来自癌细胞的EV miRNA含量，将巨噬细胞从M2（原肿瘤）重新编程为M1（抗肿瘤）。

此外，EV免疫信号已被用于产生抗肿瘤作用。

最近的一项研究调查了DC衍生的EV与或不与程序性细胞死亡-1(PD-1)抗体一起使用索拉非尼治疗肝细胞癌的潜在协同效应。

基于EV作为药物传递工具和免疫疗法的潜力，一些公司，如Capricor Therapeutics、Codiak Biosciences、Evox Therapeutics和Puretech Health，已经开始了产品开发工作，将EV疗法转化为临床。

在http://ClinicalTrials、gov网站上搜索关键词“外泌体”或“细胞外囊泡”，可以发现一些临床试验，这些试验正在招募各种类型疾病的患者，包括几种类型的癌症、神经退行性疾病、焦虑、糖尿病和covid-19。

由于亲本细胞抗原的表面表达，DC衍生的外泌体已被用于疫苗传递，并在不同类型癌症的多个I期试验中被证明是安全的。

在II期临床研究中显示了一些有希望的结果，使用这些负载肿瘤抗原的EV作为抗NSCLC联合环磷酰胺的疫苗。

尽管EV的治疗应用取得了这些有趣的进展，但在将EV治疗转化为临床方面仍存在一些挑战。

其中一个主要的挑战是亲本细胞通过各种复杂的生物发生途径产生EV固有成分的异质性。

这种异质性可导致EV
大规模生产的批次内和批间差异。

为了将EV成功转化到临床，识别影响产品效力和稳定性的关键质量属性(CQAs)（如大小、纯度、分子组成）是必不可少的。

这篇综述全面概述了EV分离和鉴定的传统和新兴的方法，以及这些方法所面临的主要挑战。

此外，还强调了实现所讨论方法的标准化的可能途径，并确定了这些技术在推广和标准化方面的潜在好处和缺点。

这对已发表报告和对这些方法优缺点的严格评估将帮助读者了解当前EV研究和确定最有效的路径选择，在未来的相关研究领域的研究中实现和标准化感兴趣的特定技术。

二、EV分离：挑战和需求
1、EV的来源：EV的异质性和复杂性
EV可从各种生理液体中分离出来。

血液是EV最丰富的来源之一，估计浓度为5-15×10^8颗粒/ml。

从血液中分离EV的一个挑战是它含有脂蛋白[＜35nm，密度1、06-1、20g/cm3，极低、低、高密度脂蛋白(VLDL、LDL、HDL)]和乳糜微粒[75-1100nm，密度＜0、930g/cm3；
a、k、a、超低密度脂蛋白(ULDLs)，它在大小和密度上与EV重叠，不能通过传统的方法分离(例如，超离心(UC)]。

其他影响血液中EV 的数量、纯度和异质性的因素包括样本采集、处理、储存条件、稳定性、抗凝剂、采血量、采血时间、动物/患者的年龄、性别、疾病状态和喂养/禁食状态。

在晚期卵巢癌的病例中，会出现出血性恶性腹水，其中包含各种细胞类型分泌的大量EV，以及细胞、胞质成分和细胞外基质(ECM)片段。

这些额外的成分不仅影响EV亚群体的化学成
分，而且还改变了其物理性质，如血液的粘度，增加了分离高纯度EV群体的难度。

进一步的异质性来自于从细胞中释放出来的各种囊泡的生物发生。

2、规模化和通量
大多数用于EV分离的传统实验室级别的方法都采用了多个分离步骤，这给大规模生产带来了挑战，而且通量很低。

近年来，切向流过滤(TFF)结合基于色谱的方法已被开发出来，用于大规模的基于cGMP的EV生产。

这一额外的分离步骤能够更有效地去除蛋白质污染物，并能产生与UC类似的EV产量。

同样，基于尺寸排阻的EV分离方案也可以很容易地扩大规模。

3、关于样品收集、处理和储存的标准化的建议
鉴于生物流体的复杂性和异质性，通过样品收集、存储和处理的标准化，尽量减少预分离和分析前变量至关重要。

这里列出了一些减少下游分离和分析的人为因素影响的建议和措施。

4、样本收集、样本匹配、样本量和数据收集
对于从培养细胞中分离EV，建议如果可能，使用无血清培养基，或无EV血清作为细胞培养基中的生长补充剂。

临床血液样本采集，重要的是使用最小化剪切力的针头，减少血小板活化和血小板和红细胞衍生EV的释放，丢弃第一段收集的血液，静脉穿刺引起的细胞碎片也会造成污染。

对于每个被收集到的标本，亲本细胞也建议尽可能进行收集，以实现分子匹配、图谱分析、细胞和EV成分的差异分析，并确定与EV源变化相关的特定分子特征，如疾病的阶段。

进食/禁食
状态和样本采集时间（晨/晚）影响样本中的EV水平，但需要更多的研究来确定最佳参数。

当设计发现生物标记物和分析EV成分的实验时，具有至少80%的统计功效的样本量至关重要。

最后，应收集有关患者/动物的年龄、性别、种族、疾病状态和治疗状态的信息，以了
解这些参数对EV含量分析的影响。

5、样本处理
大多数已发表的从血液中分离EV的研究建议使用血浆进行分离，因为血清中含有血小板来源的EV，这些血小板主要在凝血过程中释放。

此外，抗凝血剂(肝素、柠檬酸、EDTA)的选择也会影响研究结果。

许多研究表明，使用EDTA作为下游EV-RNA分析的抗凝剂，因为它可以阻止EV-细胞聚集物的形成，抑制血小板来源的释放，并且肝素会抑制PCR反应。

通过初步离心分离细胞（红细胞、白细胞(WBCs)、血小板），应以尽量减少细胞成分释放的速度进行。

此外，必须采取预
防措施，尽量减少加工时间，以避免样品由于温度和酶活性如RNA酶和蛋白酶水解而导致降解。

6、样品稳定性和储存
灌洗(BAL)评估各种存储温度的影响(4°C−20°C和−80°C)和冻融循环（一到十）的大小，组成，和功能。

总的来说，目前的证据表明，−80°C是保存EV含量用于下游分子谱分析的最佳温度。

然而，应尽量减少冻融循环，因为EV可能会发生聚集和裂解，导致高估EV 大小，低估EV计数，并在分离过程中造成损失。

此外，当拟用于药
物传递应用的EV经过冻融循环时，载物的损失会导致效力的丧失。