卵黄抗体生产及应用技术ppt课件
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2.用于诊断分析或纯化生物活性分子，或在人医临床上那么需求提高IgY纯度或提纯 特异性IgY。
IgY纯化分三步： 第一步是粗提，将含有IgY的水溶性蛋白与水不溶的脂类和脂蛋白分别，即除去脂
质；方法有超滤、有机溶剂萃取、以及PEG、SDS沉淀脂蛋白等，经粗提的上清液 或水溶液中IgY含量占蛋白质的15%； 第二步用硫酸葡聚糖钠等进一步沉淀，提纯出纯度大于80%的IgY，此时的IgY要低 温或冻干保管；
3. IgY具有较强的抗热、抗酸、抗离子强度和一定的抗酶分解才干〔相对于IgG〕， 提纯后IgY在适宜条件储存10年滴度没有损失〔Olovson等，1993〕，幼畜可以口 服，经维护处置后成年动物也可以口服，提纯后可以肌注〔孙希琪，1995〕 ；
DA和FDA以为卵黄抗体是GRAS〔generally regarded as safe〕且已允许商业消 费用于人；
2.大肠杆菌导致仔猪腹泻及抗大肠杆菌菌毛IgY阻止其在小肠粘膜上 附着，体外粘着抑制实验支持这一假设〔Yokoyama等,1992〕。
3.李国平等〔2002〕证明：仔猪出生后头36小时内口服IgY不被分解， 和注射效果无差别。卵黄抗体与菌毛抗原的亲和力远远超越母乳 及高免血清中抗体与抗原的亲和力，对控制此病极为有利 。
续〔3〕
6.消费卵黄抗体典型的免疫程序〔Li-Chan等，2000〕： (1)首免，胸肌注射0.5～1mg/羽弗氏完全佐剂等体积乳化抗原； (2)首免后第3、5、7和25周用弗氏不完全佐剂乳化抗原进展2～4次加强免疫，剂量
逐渐放大1～2倍。这种多次注射加强剂量的抗原使之产生较高自动获得性免疫的 过程，称之为“超免疫作用〞。
3.经济、高效的分别纯化技术是关键。 4.缺陷及需求处理的问题。 5.开展趋势。
3.虽然可以经过遗传工程设计出HIV颗粒的许多抗原决议簇，由于HIV不断变异，使抗 HIV抗原决议簇的单克隆治疗AIDS病人缺乏长期效果；IgY是多抗，能同时识别几 个位点，提高了结合HIV颗粒的时机，使免疫系统除去HIV。
4.卵黄抗体维护免疫抑制病人或治疗先天性免疫缺陷患儿。 5.IgY作为分泌型IgA的替代物，为免疫抑制病人内脏外表提供维护。
5.普洛玛格公司的卵黄抗体纯化系统〔Promega's EGGstract IgY〕提供了快速和简 易的IgY分别方法。该系统能在约1小时内提取2～5mg/ml纯度75%的IgY。
续〔2〕
6.提纯方法的选择取决于IgY产量、纯度、费用要求和技术程度。 7.常用ELISA测定IgY活性。 8.提纯后抗体冷冻或冻干保管。50%〔w/v〕蔗糖能在热、酸和高压等加工条件下阻止
内容
〔一〕在家禽中的运用 〔二〕在水产养殖中的运用 〔三〕对仔猪和犊牛腹泻的防治 〔四〕在奶牛上的运用 〔五〕在人医上的运用
〔一〕在家禽中的运用
1.目前国内运用卵黄抗体防治的禽病有传染性法氏囊、鸡新城疫、鸭病毒性肝炎、小 鹅瘟、番鸭细小病毒、鸡减蛋综合征等。
2.用IgY治疗IBD和ND混合感染。 3.抗沙门氏菌LPS特异IgY阻止禽蛋和禽肉中沙门氏菌粘附、控制其增殖上发扬明显作
鼠IgG抗体〕，取决于免疫个体、免疫程序及抗原的免疫原性；
续〔2〕
5.影响IgY产量的要素包括： 〔1〕抗原的质与量〔颗粒/可溶性抗原、类毒素/菌体抗原、活菌/死菌，免疫麻木；
高免疫原性和平安〕 〔2〕机体方面，A包括产蛋鸡种类〔来航鸡、洛岛红鸡及其杂交后代的特异性IgY最
高平均浓度有显著差别〔D Carlander,2002)、B产蛋率和产蛋间歇与IgY浓度、C 蛋重及卵黄重、D营养影响免疫系统发育、免疫机能情况和消费性能、E安康情况 〔SPF鸡群，起码应无免疫抑制性疾病和垂直传播性疾病，对父母代IBD的免疫〕 〔3〕免疫途径、免疫程序、佐剂
续〔1〕
第三步是精提法：运用凝胶浸透层析、阴离子交换层析或超滤方法进一步纯化，获 得纯度96%～99%的IgY。
3.Akita等建立的水稀释法：先在微酸条件下用水稀释卵黄，分别出卵黄蛋白；再用 盐析、超滤、乙醇沉淀、凝胶过滤等进一步纯化IgY。
4.特异性抗体采用亲合色谱法纯化，离子交换层析法浓缩；或用免疫亲合法直接从水 溶液中提取。
续〔1〕
5.符合动物福利原那么。 因此，IgY具有可规模消费、本钱低、特异性抗体含量高、平安性好等优点,比
实验室条件下经过实验动物制备有限的高免血清更有适用性。
〔五〕IgY纯化、活性测定及保管
1.鸡蛋储存在+4℃条件下6个月IgY活性损失很小。用做食品和饲料添加剂，或兽医临 床上，IgY多以全卵黄或其水溶液的方式直接利用，或制成干粉利用。
4.如分别自家病原制备IgY用于本猪场腹泻防治，更有针对性，其效 果优于抗生素。
续〔1〕 5.卵黄抗体治疗仔猪黄痢的效果(肖驰，1997)
组别
治疗数
治愈数
卵黄抗体
131
128
庆大霉素
68
53
注土： 霉与 素其它三组相比，差别5极7 显著〔p<0.005〕 45
6.人痢工特攻灵毒实验证明，含特异性33牛冠状病毒〔BCV〕2或3 产
〔四〕 IgY相对IgG的优势
1.高度保守的哺乳动物蛋白质对禽有较强的免疫原性，且产生有效免疫反响所需抗原 量小〔Danielpour.D,1993〕，如IGF-1，且免疫应对快；
2.免疫反响具有交叉性，血缘越近，交叉反响程度越高；由于构造上差别，IgY 与 IgG几乎没有交叉免疫反响，减少了非特异结合和假阳性；减少非特异性结合使免 疫学检测灵敏性提高〔达50%〕；
〔三〕IgY构造特点
1.分子量160～180kDa，稍大于IgG〔 160kDa 〕； 2.多一稳定区而少一铰链区〔铰链区有较多脯氨酸，具有韧性，与抗体分子构型变
化有关〕；
续〔1〕
这种差别没有影响IgY的抗原-抗体结合特性和结合才干，结合价也是2〔Warr等, 1995〕，然而对于pH、温度及蛋白水解等引起构象变化的环境条件，IgY比IgG稳 定； 由于缺乏铰链区，两个抗原结合片段〔Fab〕严密陈列，使IgY短少韧性及功能种 类，在确定条件下沉淀及聚合反响才干降低〔Warr等，1995〕，这使其具有抵抗 幼龄动物胃酸屏障的才干。 3.IgY能介导过敏反响，与哺乳动物的IgE类似。
续〔1〕
6.与抗生素相比，IgY不会产生抗药性，是平安、有效、廉价的方式。人医上用IgY预 防小儿病毒性腹泻已获得理想的结果。开发功能性食品。
三、问题及展望
1.现代免疫技术、最新生化分别技术、鸡蛋的工业化加工综合利用技术相结合消费卵 黄抗体是处理我国鸡蛋消费供大于求、提高蛋鸡附加值有效措施。
2.IgY作为一种经济有效的消费多克隆抗体〔PcAb〕的方法，多种病毒、霉形体、棘 球绦虫、酶、激素、Ig、动物毒素等的特异性IgY已胜利制备〔罗函禄，1997〕。
卵黄抗体消费及运用技术进展 2003年6月
内容
一、消费技术 二、运用技术 三、问题及展望
一、 消费技术
(一) IgY产生过程 (二) IgY转移时间、产量及影响产量的要素 (三〕IgY构造特点 (四) IgY相对与IgG的优势 (五) IgY纯化、活性测定及保管
(一) IgY产生过程
1.腔上囊是禽类特有的控制体液免疫的淋巴器官； 2.腔上囊中B细胞遭到抗原刺激后分化成浆细胞，后者 分泌抗体进入血液； 3.经过血液循环和输卵管上皮层分泌滤泡，产蛋鸡将母 源抗体选择性分泌到卵黄内； 4.卵黄中Ig主要是IgG，叫IgY〔IgM和IgA转移到蛋清中〕； 5.小鸡经过IgY实现获得性被动免疫(猪、牛、马属经过初乳；兔经过胎盘)； 6.卵黄中含有多种不同抗体〔约200种，滴度取决于暴露程度；M.Coleman,2000)； 7.用某种病原菌免疫母鸡，可产生特异性IgY， Sugita等〔1996〕用26种甲醛灭活
吸收进入血液，仍能在循环中发扬活性作用。
〔五〕IgY在人医上的运用
1.经过口服病原特异性抗体建立人被动免疫维护，特别是对于胃肠道抗原。鸡蛋是正 常的食物组成，口服IgY没有毒副作用的风险，是人们喜欢的口服免疫治疗物品。
2.用抗链球菌卵黄抗体漱口能减少链球菌在牙齿珐琅质上的定居〔Hatta H等， 1997〕，有效预防龋齿。
IgY变性，在不能冷藏或在加工过程中维护IgY活性。 9. 对提纯的IgY进展微胶囊化处置能显著加强起抗胃蛋白酶和胃酸的才干。
二、 IgY运用技术
IgY上述优势及其对病原菌感染的防御无动物种属差 异使其在传染病的预防、诊断及治疗、免疫抗体监测、 免疫分析、酶联分析以及做为功能食品因子和抗生素替 代品都很有用，特别是用鸡高免卵黄抗体防治其他动物 和人的肠道疾病。
毒素大肠杆菌的卵黄和初乳具有类似防治犊牛腹泻的
效果。
治愈率
97.71 77.94 78.95 69.69
〔四〕IgY在奶牛上的运用
1.乳房炎给奶业带来宏大损失，在美国，1992年乳房炎呵斥十亿美圆损失； 3.SCC是衡量乳房感染与否及感染程度的目的，主要病原是葡萄球菌和链球菌； 4.日粮中特异性抗葡萄球菌和链球菌IgY显著降低了SCC； 5.IgY给量与产奶量和奶中无脂固型物添加相关； 6.M Coleman(2000推测)，IgY酶解片段〔Fab〕含9-11个氨基酸，能够不再降解而被
用〔H.H.Sunwoo等，2000〕。 4.IgY对雏鸡传染病的预防有独到优点；用于紧急预防接种见效快； 5.IgY替代血清抗体对禽传染病做出诊断和疫苗免疫后抗体程度监测。
〔二〕在水产养殖中的运用 1.经过饲料用IgY治疗鳗鱼爱德华氏菌症。
〔三〕IgY对仔猪和犊牛腹泻的防治
1.幼龄动物消化系统尚未发育完全，吸收初乳的同时口服特异性IgY， 维护作用将显著加强。这方面运用最多的是对仔猪大肠杆菌及仔 猪、羔羊轮状病毒腹泻的治疗。
病原菌免疫产蛋鸡，IgY 可预防多种疾病。
(二) IgY转移时间、产量及影响产量的因 素
1.用HI、ELISA、ID检查卵黄中IgY，抗体应对构成时间 晚于血清1～2周〔Theresa H P,1985；鸭腺病毒〕，以后与血清测得的HI滴度一致， 也有报道卵黄卵黄抗体具有累积作用；
2.经加强免疫，卵黄中特异性IgY效价能维持数月奶至1年； 3.一个卵黄约含100～400 mgIgY，一只产蛋鸡每年可获 得40～50gIgY〔D .Carlander,2002〕，相当与30只家兔同期内血清IgG 产量； 4.卵黄中抗原特异性抗体数量占IgY平均10%，范围是5%〔抗胰岛素抗体〕～28%〔抗
IgY纯化分三步： 第一步是粗提，将含有IgY的水溶性蛋白与水不溶的脂类和脂蛋白分别，即除去脂
质；方法有超滤、有机溶剂萃取、以及PEG、SDS沉淀脂蛋白等，经粗提的上清液 或水溶液中IgY含量占蛋白质的15%； 第二步用硫酸葡聚糖钠等进一步沉淀，提纯出纯度大于80%的IgY，此时的IgY要低 温或冻干保管；
3. IgY具有较强的抗热、抗酸、抗离子强度和一定的抗酶分解才干〔相对于IgG〕， 提纯后IgY在适宜条件储存10年滴度没有损失〔Olovson等，1993〕，幼畜可以口 服，经维护处置后成年动物也可以口服，提纯后可以肌注〔孙希琪，1995〕 ；
DA和FDA以为卵黄抗体是GRAS〔generally regarded as safe〕且已允许商业消 费用于人；
2.大肠杆菌导致仔猪腹泻及抗大肠杆菌菌毛IgY阻止其在小肠粘膜上 附着，体外粘着抑制实验支持这一假设〔Yokoyama等,1992〕。
3.李国平等〔2002〕证明：仔猪出生后头36小时内口服IgY不被分解， 和注射效果无差别。卵黄抗体与菌毛抗原的亲和力远远超越母乳 及高免血清中抗体与抗原的亲和力，对控制此病极为有利 。
续〔3〕
6.消费卵黄抗体典型的免疫程序〔Li-Chan等，2000〕： (1)首免，胸肌注射0.5～1mg/羽弗氏完全佐剂等体积乳化抗原； (2)首免后第3、5、7和25周用弗氏不完全佐剂乳化抗原进展2～4次加强免疫，剂量
逐渐放大1～2倍。这种多次注射加强剂量的抗原使之产生较高自动获得性免疫的 过程，称之为“超免疫作用〞。
3.经济、高效的分别纯化技术是关键。 4.缺陷及需求处理的问题。 5.开展趋势。
3.虽然可以经过遗传工程设计出HIV颗粒的许多抗原决议簇，由于HIV不断变异，使抗 HIV抗原决议簇的单克隆治疗AIDS病人缺乏长期效果；IgY是多抗，能同时识别几 个位点，提高了结合HIV颗粒的时机，使免疫系统除去HIV。
4.卵黄抗体维护免疫抑制病人或治疗先天性免疫缺陷患儿。 5.IgY作为分泌型IgA的替代物，为免疫抑制病人内脏外表提供维护。
5.普洛玛格公司的卵黄抗体纯化系统〔Promega's EGGstract IgY〕提供了快速和简 易的IgY分别方法。该系统能在约1小时内提取2～5mg/ml纯度75%的IgY。
续〔2〕
6.提纯方法的选择取决于IgY产量、纯度、费用要求和技术程度。 7.常用ELISA测定IgY活性。 8.提纯后抗体冷冻或冻干保管。50%〔w/v〕蔗糖能在热、酸和高压等加工条件下阻止
内容
〔一〕在家禽中的运用 〔二〕在水产养殖中的运用 〔三〕对仔猪和犊牛腹泻的防治 〔四〕在奶牛上的运用 〔五〕在人医上的运用
〔一〕在家禽中的运用
1.目前国内运用卵黄抗体防治的禽病有传染性法氏囊、鸡新城疫、鸭病毒性肝炎、小 鹅瘟、番鸭细小病毒、鸡减蛋综合征等。
2.用IgY治疗IBD和ND混合感染。 3.抗沙门氏菌LPS特异IgY阻止禽蛋和禽肉中沙门氏菌粘附、控制其增殖上发扬明显作
鼠IgG抗体〕，取决于免疫个体、免疫程序及抗原的免疫原性；
续〔2〕
5.影响IgY产量的要素包括： 〔1〕抗原的质与量〔颗粒/可溶性抗原、类毒素/菌体抗原、活菌/死菌，免疫麻木；
高免疫原性和平安〕 〔2〕机体方面，A包括产蛋鸡种类〔来航鸡、洛岛红鸡及其杂交后代的特异性IgY最
高平均浓度有显著差别〔D Carlander,2002)、B产蛋率和产蛋间歇与IgY浓度、C 蛋重及卵黄重、D营养影响免疫系统发育、免疫机能情况和消费性能、E安康情况 〔SPF鸡群，起码应无免疫抑制性疾病和垂直传播性疾病，对父母代IBD的免疫〕 〔3〕免疫途径、免疫程序、佐剂
续〔1〕
第三步是精提法：运用凝胶浸透层析、阴离子交换层析或超滤方法进一步纯化，获 得纯度96%～99%的IgY。
3.Akita等建立的水稀释法：先在微酸条件下用水稀释卵黄，分别出卵黄蛋白；再用 盐析、超滤、乙醇沉淀、凝胶过滤等进一步纯化IgY。
4.特异性抗体采用亲合色谱法纯化，离子交换层析法浓缩；或用免疫亲合法直接从水 溶液中提取。
续〔1〕
5.符合动物福利原那么。 因此，IgY具有可规模消费、本钱低、特异性抗体含量高、平安性好等优点,比
实验室条件下经过实验动物制备有限的高免血清更有适用性。
〔五〕IgY纯化、活性测定及保管
1.鸡蛋储存在+4℃条件下6个月IgY活性损失很小。用做食品和饲料添加剂，或兽医临 床上，IgY多以全卵黄或其水溶液的方式直接利用，或制成干粉利用。
4.如分别自家病原制备IgY用于本猪场腹泻防治，更有针对性，其效 果优于抗生素。
续〔1〕 5.卵黄抗体治疗仔猪黄痢的效果(肖驰，1997)
组别
治疗数
治愈数
卵黄抗体
131
128
庆大霉素
68
53
注土： 霉与 素其它三组相比，差别5极7 显著〔p<0.005〕 45
6.人痢工特攻灵毒实验证明，含特异性33牛冠状病毒〔BCV〕2或3 产
〔四〕 IgY相对IgG的优势
1.高度保守的哺乳动物蛋白质对禽有较强的免疫原性，且产生有效免疫反响所需抗原 量小〔Danielpour.D,1993〕，如IGF-1，且免疫应对快；
2.免疫反响具有交叉性，血缘越近，交叉反响程度越高；由于构造上差别，IgY 与 IgG几乎没有交叉免疫反响，减少了非特异结合和假阳性；减少非特异性结合使免 疫学检测灵敏性提高〔达50%〕；
〔三〕IgY构造特点
1.分子量160～180kDa，稍大于IgG〔 160kDa 〕； 2.多一稳定区而少一铰链区〔铰链区有较多脯氨酸，具有韧性，与抗体分子构型变
化有关〕；
续〔1〕
这种差别没有影响IgY的抗原-抗体结合特性和结合才干，结合价也是2〔Warr等, 1995〕，然而对于pH、温度及蛋白水解等引起构象变化的环境条件，IgY比IgG稳 定； 由于缺乏铰链区，两个抗原结合片段〔Fab〕严密陈列，使IgY短少韧性及功能种 类，在确定条件下沉淀及聚合反响才干降低〔Warr等，1995〕，这使其具有抵抗 幼龄动物胃酸屏障的才干。 3.IgY能介导过敏反响，与哺乳动物的IgE类似。
续〔1〕
6.与抗生素相比，IgY不会产生抗药性，是平安、有效、廉价的方式。人医上用IgY预 防小儿病毒性腹泻已获得理想的结果。开发功能性食品。
三、问题及展望
1.现代免疫技术、最新生化分别技术、鸡蛋的工业化加工综合利用技术相结合消费卵 黄抗体是处理我国鸡蛋消费供大于求、提高蛋鸡附加值有效措施。
2.IgY作为一种经济有效的消费多克隆抗体〔PcAb〕的方法，多种病毒、霉形体、棘 球绦虫、酶、激素、Ig、动物毒素等的特异性IgY已胜利制备〔罗函禄，1997〕。
卵黄抗体消费及运用技术进展 2003年6月
内容
一、消费技术 二、运用技术 三、问题及展望
一、 消费技术
(一) IgY产生过程 (二) IgY转移时间、产量及影响产量的要素 (三〕IgY构造特点 (四) IgY相对与IgG的优势 (五) IgY纯化、活性测定及保管
(一) IgY产生过程
1.腔上囊是禽类特有的控制体液免疫的淋巴器官； 2.腔上囊中B细胞遭到抗原刺激后分化成浆细胞，后者 分泌抗体进入血液； 3.经过血液循环和输卵管上皮层分泌滤泡，产蛋鸡将母 源抗体选择性分泌到卵黄内； 4.卵黄中Ig主要是IgG，叫IgY〔IgM和IgA转移到蛋清中〕； 5.小鸡经过IgY实现获得性被动免疫(猪、牛、马属经过初乳；兔经过胎盘)； 6.卵黄中含有多种不同抗体〔约200种，滴度取决于暴露程度；M.Coleman,2000)； 7.用某种病原菌免疫母鸡，可产生特异性IgY， Sugita等〔1996〕用26种甲醛灭活
吸收进入血液，仍能在循环中发扬活性作用。
〔五〕IgY在人医上的运用
1.经过口服病原特异性抗体建立人被动免疫维护，特别是对于胃肠道抗原。鸡蛋是正 常的食物组成，口服IgY没有毒副作用的风险，是人们喜欢的口服免疫治疗物品。
2.用抗链球菌卵黄抗体漱口能减少链球菌在牙齿珐琅质上的定居〔Hatta H等， 1997〕，有效预防龋齿。
IgY变性，在不能冷藏或在加工过程中维护IgY活性。 9. 对提纯的IgY进展微胶囊化处置能显著加强起抗胃蛋白酶和胃酸的才干。
二、 IgY运用技术
IgY上述优势及其对病原菌感染的防御无动物种属差 异使其在传染病的预防、诊断及治疗、免疫抗体监测、 免疫分析、酶联分析以及做为功能食品因子和抗生素替 代品都很有用，特别是用鸡高免卵黄抗体防治其他动物 和人的肠道疾病。
毒素大肠杆菌的卵黄和初乳具有类似防治犊牛腹泻的
效果。
治愈率
97.71 77.94 78.95 69.69
〔四〕IgY在奶牛上的运用
1.乳房炎给奶业带来宏大损失，在美国，1992年乳房炎呵斥十亿美圆损失； 3.SCC是衡量乳房感染与否及感染程度的目的，主要病原是葡萄球菌和链球菌； 4.日粮中特异性抗葡萄球菌和链球菌IgY显著降低了SCC； 5.IgY给量与产奶量和奶中无脂固型物添加相关； 6.M Coleman(2000推测)，IgY酶解片段〔Fab〕含9-11个氨基酸，能够不再降解而被
用〔H.H.Sunwoo等，2000〕。 4.IgY对雏鸡传染病的预防有独到优点；用于紧急预防接种见效快； 5.IgY替代血清抗体对禽传染病做出诊断和疫苗免疫后抗体程度监测。
〔二〕在水产养殖中的运用 1.经过饲料用IgY治疗鳗鱼爱德华氏菌症。
〔三〕IgY对仔猪和犊牛腹泻的防治
1.幼龄动物消化系统尚未发育完全，吸收初乳的同时口服特异性IgY， 维护作用将显著加强。这方面运用最多的是对仔猪大肠杆菌及仔 猪、羔羊轮状病毒腹泻的治疗。
病原菌免疫产蛋鸡，IgY 可预防多种疾病。
(二) IgY转移时间、产量及影响产量的因 素
1.用HI、ELISA、ID检查卵黄中IgY，抗体应对构成时间 晚于血清1～2周〔Theresa H P,1985；鸭腺病毒〕，以后与血清测得的HI滴度一致， 也有报道卵黄卵黄抗体具有累积作用；
2.经加强免疫，卵黄中特异性IgY效价能维持数月奶至1年； 3.一个卵黄约含100～400 mgIgY，一只产蛋鸡每年可获 得40～50gIgY〔D .Carlander,2002〕，相当与30只家兔同期内血清IgG 产量； 4.卵黄中抗原特异性抗体数量占IgY平均10%，范围是5%〔抗胰岛素抗体〕～28%〔抗