Western bloting 检测蛋白质含量变化

Western blotting 检测蛋白质含量变化
溶液配方注意事项细节
一、细胞收集、蛋白提取及浓度测定
1、细胞收集及蛋白提取
（1）培养瓶培养的细胞：以25cm2培养瓶培养细胞至90％汇合，加入各种药物处理后，用冷的PBS洗两遍，吸去瓶内培养液（可用枪头尽量吸干净），加入200ul冷的PBS在冰环境下用细胞刮刮下细胞收集到1.5mlEP管中，再用500ul冷的PBS洗培养瓶2遍，所有液体都转到EP管中，3500-4500rpm 4℃离心5min，去上清，弃净PBS，借助另一1.5mlEP管估计细胞体积。

向EP管中加入6-10倍体积细胞裂解液（碧云天强型RIPA裂解液495ulRIPA +5ul 100mM PMSF），在冰上裂解45-60min，期间弹打EP管几次或涡旋使细胞裂解充分，12000rpm 4℃离心30min，上清吸至新的EP管中。

（2）24孔板培养的细胞：去培养液，加冷的PBS冲洗2次，弃净PBS加细胞裂解液60-70ul，冰上裂解60min，期间可反复吹打，裂解后吸至EP管中，12000rpm 4℃离心30min，上清吸至新的EP管中。

2、蛋白浓度测定
BCA法测定蛋白浓度
（1）取10ul 5mg/mlBSA蛋白标准，加入90ulPBS，得0.5ug/ul BSA标准蛋白工作液（2）取2mlBCA试剂A，加入0.04mlBCA试剂B（50：1），得BCA工作液，此工作液室温24h内稳定。

（3）按下表制备标准曲线及测定样品蛋白浓度
编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9
0.5ug/ulBSA标准工作液（ul）0 1 2 4 8 12 16 20
PBS（ul）20 19 18 16 12 8 4 0 20-x 样品（ul）x BCA工作液（ul）200 200 200 200 200 200 200 200 200
蛋白含量（ug）0 0.5 1 2 4 6 8 10
OD570 0
以OD562为纵坐标，蛋白含量（ug）为横坐标，以1-8号管做标准曲线，从标准取线上查出样品的蛋白质含量（ug），除以测定样品的体积（ul）即的样品蛋白质浓度（ug/ul）。

（若用分光光度计测定时，反应体系增大5倍）
（3）样品保存
样品加样品缓冲液95-100℃煮沸5min，放于－20℃保存，上样时再95℃煮5min，用1ml注射器反复抽打样品打断染色体DNA，降低样品粘稠度。

上样样品蛋白浓度可以计算。

6×样品缓冲液储备液：300mM Tris-HCl(pH 6.8)、12％SDS、0.6％溴酚蓝、60％甘油、600mM DTT【配制方法：15ml 1M Tris-HCl(pH 6.8)、6gSDS、0.3g溴酚蓝、30ml甘油、4.63gDTT 加水定容至50ml】
【1×样品缓冲液：50mM Tris-HCl(pH 6.8)、2%SDS、0.1%溴酚蓝、10%甘油、100mMDTT】
二、SDS－PAGE
（一）试剂配制
1、30％丙烯酰胺单体贮液：称取29.2g丙烯酰胺，0.8gN,N’-甲叉丙烯酰胺，加三蒸水溶解至100ml，完全溶解后用滤膜过滤，4℃避光保存，最长时间一个月。

2、1.5M Tris-HCl pH8.8(分离胶缓冲液)：称取18.171gTri s加三蒸水至80ml溶解，用6N 盐酸调pH值至8.8，加水定容至100ml，4℃保存（可高压灭菌）
3、1.0M Tris-HCl pH6.8（浓缩胶缓冲液）：称取12.114gTris加三蒸水至80ml溶解，用6N盐酸调pH值至6.8，加水定容至100ml，4℃保存（可高压灭菌）
4、10％SDS：称取10gSDS，加90ml三蒸水溶解，定容至100ml，室温保存（可高压灭菌），冬天时可以在37℃水浴后再使用
5、10％过硫酸铵（APS）：称取100mg过硫酸铵，加三蒸水溶解至1ml，200ul/管分装，-20℃保存
6、TEMED：500ul/管4℃保存。

7、10×电泳缓冲液：称取30.3gTris（250mM）、144g甘氨酸（1.92M）、10gSDS（1%）加适量三蒸水溶解，定容至1L。

不要用酸或碱调pH值，使用时50ml 10×电泳缓冲液加450ml 去离子水（pH8.3），每次电泳前充分混匀后使用。

8、考马斯亮蓝染色液：称取1.0g考马斯亮蓝R－250、200ml甲醇、50ml冰醋酸，加三蒸水溶解至500ml
9、考马斯亮蓝脱色液：量取400ml甲醇、100ml冰醋酸，加水至1000ml
（二）实验步骤
1、准备步骤
（1）将凝胶玻璃板依次用自来水、蒸馏水、无水乙醇洗涤干净，然后使其自然风干或烘干。

（2）试样格（梳子）临用前用无水乙醇擦拭，让其挥发至干。

（3）灭菌枪头、eppendorf管
2、制备凝胶
（1）安装玻璃板、板条，并将玻璃板固定在制胶槽上
（2）按比例配制5-10ml左右分离胶，小心将分离胶注入准备好的玻璃板的间隙中（1.0mm厚的胶可加入4.5ml混合胶液，1.5mm胶需灌注7ml混合胶液），使分离胶距离矮玻璃板上缘2cm的高度，立即加入去离子水封闭，以阻止空气氧对凝胶聚合的抑制作用。

（加水封闭应迅速且温和，过猛对凝胶界面冲击过大造成界面不平）。

（3）约40min后分离胶凝固（以烧杯中的残余胶液体做参照），倒掉去离子水，用吸水纸吸干凝胶顶端残存的液体。

（4）配制2ml浓缩胶，先插入梳子，再注胶，应小心避免气泡。

（5）待浓缩胶凝固后，小心拔掉梳子，防止凝胶孔扭曲，将胶槽放入电泳槽中，加入
足量的电泳缓冲液（高于玻璃板矮板），保证相通，凹面相对。

3、上样电泳
（1）依据已经蛋白定量的样品浓度确定样品加样量，保证蛋白量一致，保证每孔的蛋白含量至少为20ug。

大梳子每孔最多可以加量30ul（1.0mm胶）、40ul（1.5mm胶）。

（2）按次序上样，一定要设定Marker（已知分子量的标准物），未使用的梳子孔加入5ul 1×样品缓冲液，避免样品孔中的样品在虹吸作用下向未加入样品的孔中扩散。

（3）接通电源，50v稳压电泳，待样品进入分离胶后增加至100v稳压电泳，至染料到达离凝胶底部1cm处，结束电泳。

（4）断开电源，小心将内槽取出，倒掉槽内电极缓冲液，将胶板从三明治槽中取出，用Tip头辅助剥胶，使胶和板分离开，割掉浓缩胶。

三、转膜
（一）试剂配制
10×转膜缓冲液（pH8.3）：称取15.15g Tris base(25mM)、72.05g甘氨酸（192mM）定容至500ml
1×转膜缓冲液：50ml 10×转膜缓冲液，加50ml甲醇，蒸馏水定容至500ml。

（二）实验步骤
1、备膜：根据SDS凝胶的大小（5.5cm×8.5cm）剪2块三层滤纸和一块NC膜。

注意：手触摸凝胶、滤纸、膜时应戴手套，因为皮肤上的油和分泌物会影响蛋白质从胶上转移到膜上。

将剪好的NC膜、滤纸、胶、海绵浸泡在转移缓冲液中。

2、安装转移装置
原则：SDS凝胶位于负极（黑板），膜位于正极（白板），蛋白质由负极向正极转移。

将塑料支架（白板面）平放在含有转移缓冲液的托盘中，在塑料支架白版面上放一块海绵，将3层滤纸对齐放在海绵上，然后依次放置NC膜、凝胶、另外3层滤纸及海绵，在放置每一层时，均要去除它们之间的气泡（用玻璃棒从中间向两边赶），若有气泡残留，则影响转移效果。

最后用塑料支架夹紧上述各层，放入电转移槽中，注意膜一侧靠近正极(白板)、胶一侧靠近负极（黑板），塑料支架夹在上。

3、转膜
接通电源，恒流电转，稳流400mA（电压下界100V）转移2h，转移结束后取出塑料支架，白板面朝下依次去掉各层，可见Marker条带已转移到膜上，把膜的左上角剪去，用于蛋白定位和分清正反面，膜的正面应该是左上角被剪掉，而且Marker颜色较鲜艳的一面为正面。

4、凝胶染色
转膜后的SDS凝胶可以放在大平皿中加入10倍体积的考马斯亮蓝染色液，旋转摇床中缓慢摇动染色20min以上。

倾去考马斯亮蓝染液并用双蒸水简单冲洗凝胶，加入10倍体积的脱色液缓慢摇动，直到溶液颜色变得和胶板颜色一样深，倾去脱色液，重复脱色数遍直到背景较为清晰。

四、封闭
（一）试剂
1、10×TBS溶液:称取12.1g Tris base(200mM)、43.85g NaCl(1.5M)，加水400ml去离子水溶解，用HCl调节pH至7.6，加水定容至500ml。

1×TBS溶液：称取2.42gTris base(20mM)、8.77gNaCl(150mM)，加800ml水溶解，用HCl调节pH到7.6，加水定容至1000ml （或者50ml 10×TBS 加水定容至500ml即可）
2、TBST溶液：500mlTBS溶液中加入0.5mlTween-20(0.1% v/v)
3、封闭液：用TBST溶液配制5％脱脂奶粉，或用TBST配制的2%的BSA。

（二）操作
将膜正面朝上放于大小合适的杂交小船中，置于平皿中，先用TBST漂洗2min，以洗去膜上的转膜液，加入适量封闭液，室温轻轻振荡1h，速度不可过快。

五、靶蛋白与一抗反应
1、一抗溶液的配制：用2%脱脂奶粉（加0.03%叠氮钠防腐）稀释第一抗体，抗体使用浓度：β-actin 稀释度1:2000；anti-HA（12CA5）1：2000；anti-GHR(AL-47) 1：4000 ；anti-GFP(GFP Ab)1：2000；anti-active-MAPK（1：1000）
2、加一抗溶液，4℃摇床下反应过夜（也可室温下反应2h），回收第一抗体溶液（可供半月内重复用），用TBST快速冲洗一次，再用TBST洗膜4次，每次15min
六、与二抗反应
所用第二抗体为辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗体，将膜放回杂交小船中，加入TBST 稀释的二抗，摇床室温作用1h，速度不可过快，二抗可以不回收，用洗膜液TBST洗4次，每次15min，（洗膜时间可延长）
羊抗mouse、羊抗rabbit二抗按1：5000稀释
【注：anti-β-actin 、anti-HA（12CA5）为mouse来源的单克隆抗体，因此二抗用羊抗mouse HRP antibody；
anti-GHR(AL-47)、anti-GFP(GFP Ab)、anti-active-MAPK为rabbit来源的多克隆抗体，因此二抗用羊抗rabbit HRP antibody】
七、显色
1、ECL配方
Stock solutions: 250mM Luminol (sigma cat # A 8511-5g): 0.44g/10ml DMSO;
90mM p-coumaric acid (sigma cat # C9008-10g): 0.15g/10ml DMSO; keep at 4℃ protected from light.
ECL solution: 1ml Luminol stock ; 0.44ml p-coumaric acid stock ; 20ml 1M Tris-HCl (pH 8.5) ; add H2O to final 200ml, keep at 4℃ protected from light.
2、ECL 反应
每1.5mlECL加入2ul30％H2O2，充分混匀，取PE手套，加ECL于手套上，膜正面向下反扣于ECL上，暗反应5min后曝光。

八、曝光（戴手套）
在暗室中操作，暗示中可安装红灯，操作时可开启红灯便于正确放置胶片。

曝光时间视情况而定，一般先曝光1min，视条带亮度调整曝光时间，曝光后放入显影液中1min（可在
红灯下观察待出现明显条带时即刻终止显影，过清水，在定影液中定影5-10min，以胶片透明为主，曝光或显影中取放X光片应迅速。

注：1、显影液、定影液使用天津冠桥x胶片高反差显影粉、定影粉按说明配制，避光保存。

2、新鲜的显影液为淡黄色，使用后逐渐变黄，待变黑时即不能使用，500ml显影液可显影约10张x胶片。

3、定影液使用时间可稍长
九、膜回收显影（Stripping）
1、stripping buffer：100mM β-mercaptoethanol (β-巯基乙醇)；2%（w/v）SDS；62.5mM Tris-HCl (pH 6.7)
【配制方法：β-巯基乙醇352ul，10%SDS 10ml，1M Tris-HCl 3.125ml，加水定容至50ml】
2、步骤：
先用TBST洗膜2min，加适量stripping buffer 55℃水浴5min，间断振荡，然后用TBST 洗膜3次×10min。

5％脱脂奶粉（封闭液）室温下封闭1h，一抗、二抗、显色、曝光步骤同上。