柠条组织培养体系的建立

柠条组织培养体系的建立
杨俊鸾
（山西省林木育种研究中心，山西太原030031）
摘要:为了建立柠条的组织培养体系，用KF/MS 加激素培养法，选择不同的消毒剂，对柠条茎段愈伤组织诱导，
并进行芽分化、芽的继代增殖和生根培养。

结果表明，次氯酸钠的消毒效果最好，最适浓度为2%，且浸泡外植体的最佳时间为8min ；诱导芽分化的基本培养基以KF ＋6-BA 0.8mg/L ＋NAA 0.3mg/L ＋蔗糖20g/L ＋琼脂7g/L 为宜，继代增殖最适培养基配方为KF ＋6-BA 1.2mg/L ＋NAA 0.3mg/L ＋蔗糖20g/L ＋琼脂7g/L ，适合生根的最佳培养基为1/2MS ＋NAA 0.3mg/L ＋蔗糖30g/L ＋琼脂7g/L ＋活性炭0.5g/L 。

关键词:柠条；组织培养；外植体；愈伤组织诱导中图分类号:S793.3
文献标识码:A
文章编号:1002-2481（2018）09-1440-04
Establishment of Tissue Culture System of
YANG Junluan
（Shanxi Forest Tree Breeding Research Center ，
Taiyuan 030031，China ）Abstract ：To establish tissue culture system of Caragana intermedia ,the stem section callus was induced by Murashige and Skoog （MS ）and KF Streptococcus Agar （KF ）culture medium supplemented with hormone and sterilized with the different disinfectants.The bud callus was carried on bud differentiation,bud subculture proliferation and root culture.The results indicated that the best method of disinfection for explant of Caragana intermedia tissue culture was treated with 2%Sodium Hypochlorite for 8min.The basic culture medium of callus induction was KF ＋6-BA 0.8mg/L ＋NAA 0.3mg/L ＋sucrose 20g/L ＋agar 7g/L.The effect of proliferation subculture in KF ＋6-BA 1.2mg/L ＋NAA 0.3mg/L ＋sucrose 30g/L ＋agar 7g/L of culture medium was better.The optimum rooting medium was 1/2MS ＋NAA 0.3mg/L ＋sucrose 30g/L ＋agar 7g/L ＋acticarbon 0.5g/L.
Key words ：Caragana intermedia ;tissue culture;explant;callus induction
收稿日期:2018-04-24
作者简介:杨俊鸾（1978-），女，山西太谷人，工程师，主要从事植物组培及林业育苗技术研究工作。

柠条（Caragana intermedia ）为豆科锦鸡儿属（Caragana ）落叶大灌木，适于生长在海拔约900～1300m 的阳坡、半阳坡，它耐寒、耐旱、耐高温，是干旱草原、荒漠地带的旱生灌丛[1-4]。

目前，柠条已经成为我国华北、西北及东北西部的固沙造林和水土保持的重要树种之一，是优良的固沙和绿化荒山植物[5-7]，可作饲草饲料[8-11]。

同时，它的根、花、种子均可入药[12-14]，对滋阴养血、通经、镇静及杀虫等有良好效果[15-17]。

柠条传统的繁殖方式主要为种子繁殖，但柠条苗木容易受温度、湿度、地形、地势、病虫害等因素的影响，表现为出苗率不高、出苗不整齐等现象[18-19]。

但随着我国经济发展，柠条植被在生态建设中越来越受到重视，以至于柠条苗木供不应求的矛盾日渐突出。

为了满足市场对柠条的需求，
在实际生产中降低育苗成本，故对柠条进行了组织培养研究。

本研究选用柠条茎段作为外植体，KF/MS 作为基本培养基加不同比例的激素进行组织培养，对柠条茎段愈伤组织诱导，并进行芽分化、芽的继代增殖和生根培养，产生新的植株。

通过研究其最佳的培养条件，旨在获得一套高效的柠条组织培养体系，为今后工厂化育苗奠定了理论基础。

1
材料和方法
1.1
试验材料
选用当年生的柠条嫩枝作为外植体，
柠条嫩枝采自山西省林木育种研究中心的苗圃地，剪取当年生无病虫害处于生长旺盛期的柠条嫩枝作为外植体。

1.2试验方法
1.2.1
外植体消毒方法和初代接种
选取当年生
山西农业科学2018，46（9）：1440-14431440··
2.3不同激素对不定芽分化的影响
激素种类和激素的浓度显著影响柠条不定芽的分化效果。

在柠条快速繁殖试验中常用的激素有6-BA ，NAA ，GA 3等[20]。

本试验用不同浓度的6-BA 和NAA 加入KF 和MS 培养基中，统计观察其不定
芽的分化以及扩繁能力（表3）。

以KF 为基本培养
基，当6-BA 为0.8mg/L ，NAA 为0.3mg/L 时，不定芽分化最多，
分化率为82.5%；以MS 为基本培养基时，不定芽分化率低于KF 作为基本培养基的分化
率，且分化出的芽颜色为浅绿色，
部分芽还有玻璃的柠条嫩枝用流水冲洗干净，将其剪成2cm 左右的茎段（一般要求保留2个左右的腋芽），放入烧杯中，在流水的环境下冲洗30min ，然后用75%的乙
醇浸泡摇晃20～25s ，将材料一分为二，一份用0.1%氯化汞浸泡6～8min ，另一份用2%的次氯酸钠浸泡6～8min 。

浸泡中不断用消毒镊子搅拌，
使外植体充分消毒，然后用无菌蒸馏水冲洗4～5次，即可对茎段进行初代接种，每瓶放1块外植体，接种15d 后统计污染数，查看消毒效果。

1.2.2
培养基的选择和培养条件柠条繁殖采用
KF ，MS ，1/2MS 为基本培养基，
培养条件为LED 灯光照培养，光照时间12h ，光照强度为2000lx ，温度（25±2）℃，湿度70%～80%。

1.2.3
芽诱导培养基中激素浓度的选择
KF 和
MS 基本培养基中分别加入不同质量浓度的6-BA （0.5，0.8，1.0mg/L ）和NAA （0.3，0.5mg/L ），接种30d
后，观察2种培养基中茎段诱导不定芽分化的情况。

1.2.4
丛生芽增殖培养基中激素浓度的选择将分化的不定芽分别接种在不同激素（6-BA 和NAA ）配比的KF 和MS 培养基中，6-BA 有0.6，1.2，1.5mg/L 等3个梯度，NAA 有0.2，0.3，0.5mg/L 等3个浓度梯度，参考资料设计最右组合[20]，
培养40d 后，观察不定芽的增殖情况。

1.2.5
根诱导培养基
生根培养基选择1/2MS ＋
NAA 0.3mg/L ＋蔗糖30g/L ＋琼脂7g/L ，并添加不同含量的活性炭，活性炭含量分别为0，0.3，0.5，1.0，2.0mg/L 。

当诱导苗长至5.0cm 时，转接于上述不同
活性炭含量的生根培养基中，研究其对柠条生根的影响。

2
结果与分析
2.1不同消毒剂和消毒时间对外植体消毒效果的
比较
外植体消毒的彻底与否直接影响初代的污染
率。

对于初代培养，虽然外植体进行了表面消毒，但污染仍在所难免。

为了提高无菌材料的获得率，
提高工作效率，初次接种每瓶一般放1块外植体。

由表1可知，2种不同消毒剂的消毒时间都为8min
时，均比消毒6min 的外植体污染率明显降低。

在相同的消毒时间下，用2%次氯酸钠处理的外植体污
染明显减少，污染率降低；而用0.1%氯化汞处理的外植体污染率较次氯酸钠处理高。

由此可知，
柠条外植体用2%次氯酸钠消毒效果比较好，消毒时间以8min 为宜。

2.2不同培养基对柠条茎段诱导不定芽与不定芽生长的影响
接种后的柠条茎段培养30d 后观察其形成的
不定芽数和生长状况（表2）。

接种于MS 培养基上有不定芽的形成，诱导率为50%；1/2MS 培养基接种的茎段只有少量的不定芽生成，诱导率只有
16%，而且不定芽生长状态较差，主要是由于培养基中大量元素的减少使植物生长所需的各种元素不足所导致；接种于KF 培养基上的有大量不定芽生成，诱导率达到了96%，且长势良好。

所以，选择KF 为最佳诱导培养基。

表1不同消毒剂尧消毒时间对柠条外植体消毒效果比较
污染的外植体数/个
2113
2617
外植体污染率/%
4226
5234
接种外植体数/个
5050
5050
消毒剂
2%次氯酸钠0.1%氯化汞
消毒时间/min
68
68
培养时间/d
1515
1515
表2不同培养基对柠条茎段生成不定芽的影响
生长状态一般差良好
诱导率/%
501696
基本培养基
MS 1/2MS KF
接种茎段数
262626
形成不定芽数
131025
杨俊鸾：柠条组织培养体系的建立
1441··
表36-BA 和NAA 组合对柠条不定芽分化的影响
不定芽分化数/个
282233263020
161429262416
分化率/%70.055.082.565.075.050.040.035.072.565.060.040.0
接种茎段数/个
404040404040
404040404040
基本培养基
KF
MS
6-BA/（mg/L ）
0.5
0.81.0
0.50.81.0
NAA/（mg/L ）
0.30.50.30.50.30.5
0.30.50.30.50.30.5
化现象的发生。

所以，柠条不定芽分化的最佳培养基是KF ＋6-BA 0.8mg/L ＋NAA 0.3mg/L ＋蔗糖
20g/L ＋琼脂7g/L 。

表4柠条茎段丛生芽增殖试验统计结果
2.5活性炭对柠条试管苗生根的影响
当柠条无根苗生长至5cm 左右时，将其接种
至含有不同含量活性炭的生根培养基中。

试验所用
的培养基为1/2MS ＋NAA 0.3mg/L ，经过约20d 培养后，统计柠条生根情况。

表5活性炭对柠条试管苗生根的影响
根系生长情况
根系长，
但发根晚根系较好，
但发根晚根系好且粗壮，发根早根系短，
发根早根系短，
晚发根生根率/%
5264948046
活性炭含量/（g/L ）
00.30.51.02.0
接种瓶苗数
5050505050
生根瓶苗数
2632474023
由表5可知，活性炭含量为0时，生根率为
52%，根系长，但发根晚，且容易褐化，移栽时容易伤根；活性炭含量为0.5g/L 时，生根率为94%，
发根早，且根系好、粗壮，移栽利于成活；活性炭为2g/L 时，根系短、发根晚，
生根率最低，为46%。

这表明活性炭的含量对柠条生根有明显影响。

由此可知，低含量的活性炭不仅能促进试管苗的生根，而且又能吸附培养基中的矿物质和无机盐，
改善培养基的透气性，有利于根的诱导和生长。

所以，柠条生根的最适培养基为1/2MS ＋NAA 0.3mg/L ＋蔗糖30g/L ＋琼脂7g/L ＋活性炭0.5g/L 。

3结论
本研究结果表明，柠条茎段培养用2%次氯酸
钠浸泡外植体8min 为消毒最佳时间；诱导愈伤、芽分化和增殖的基础培养基为KF ，愈伤诱导率为
转接丛生芽数量/个
404040404040
丛生芽数量/个
273623152217
NAA/（mg/L ）
0.20.30.50.20.30.5
编号
123456
基本培养基
KF KF KF MS MS MS
6-BA/（mg/L ）
0.61.21.50.61.21.5
丛生芽增殖率/%
67.590.057.537.555.042.5
2.4
不同激素配比对丛生芽增殖的影响
以柠条不定芽为试验材料，在KF 基本培养基
中加入不同的激素配比进行试验，
对柠条丛生芽分化增殖最佳条件进行筛选。

培养40d 后统计产生的丛生芽数量（表4）。

结果表明，MS 培养基上丛生芽分化个数较少，且萌生慢；KF 培养基上丛生芽分
化个数较同等浓度的MS 培养基多，且植株生长健壮，所以，KF 是最佳培养基。

诱导丛生芽效果较好的激素组合为6-BA 1.2mg/L ＋NAA 0.3mg/L 。

由上述结果可知，适合柠条丛生芽增殖的最佳培养基和激素组合为KF ＋6-BA 1.2mg/L ＋NAA 0.3mg/L ＋蔗糖20g/L ＋琼脂7g/L ，增殖率为90%。

山西农业科学2018年第46卷第9期
1442··
(上接第1436页)
白菜种子的萌发没有受到影响，但子叶的黄化率随之增加，下胚轴和主根的长度变短，鲜质量减轻，侧根数减少。

此外，不同大白菜品系对Kan的敏感程度不同，7#大白菜的Kan最佳筛选质量浓度为150～175mg/L，9#大白菜则为200mg/L。

这些结果可为其他大白菜品种的抗性浓度筛选提供参考。

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杨俊鸾：柠条组织培养体系的建立
96%；芽分化的最佳激素配比培养基为KF＋6-BA 0.8mg/L＋NAA0.3mg/L＋蔗糖20g/L＋琼脂7g/L；丛生芽继代增殖培养基为KF＋6-BA1.2mg/L＋NAA0.3mg/L＋蔗糖20g/L＋琼脂7g/L，增殖率为90%；生根培养基为1/2MS＋NAA0.3mg/L＋蔗糖30g/L＋琼脂7g/L＋活性炭0.5g/L，生根率为94%。

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