亚罗解脂假丝酵母脂肪酶的高水平重组表达、分子体外进化研究及其在手性拆分中的应用

亚罗解脂假丝酵母脂肪酶的高水平重组表达、分子体外进化研究
及其在手性拆分中的应用
脂肪酶(lipase, EC3.1.1.3)是一种重要的工业酶类,广泛应用于食品、油脂化工、制药和有机合成工业中,酶催化的反应具有条件温和、耗能低、原料要求低、成品质量高等优点,具有巨大的应用潜力。

本实验室培育的亚罗解脂假丝酵母Candida sp.99-125所生产的胞外脂肪酶Lip2(YlLip2)活性高、催化活性强,已经被成功应用于油脂改性、多元醇酯合成、手性化合物拆分和可替代能源(生物柴油)合成等等,是工业生产中重要的催化剂。

为了进一步促进和拓展假丝酵母脂肪酶YlLip2的商业化应用和生产,本文主要进行了如下工作：1、研究了固定化假丝酵母脂肪酶YlLip2用于外消旋α-苯乙胺的动力学拆分。

本实验中,本文首次利用了含有机助剂的介质作为脂肪酶催化外消旋β-苯乙胺发生选择性酰基化反应的体系,实现了外消旋α-苯乙胺两种对映体的拆分。

在动力学拆分的过程中,脂肪酶YlLip2具有R型对映体优先选择性且对映体过量值由于3%(v/v)极性有机助剂DMSO的加入得到了显著增长,对映体过量值(e.e.p)由0.35增长到了0.96,对映体比率(E)提高约20倍,最终达到190；而E值大于50一般即认为具有工业应用价值。

这是该酶首次应用于手性胺类的拆分。

2、由于芽孢杆菌具有高效、功能性表达外源蛋白的优势,本文研究了假丝酵母脂肪酶YlLip2在枯草芽孢杆菌(Bacillus su btilis)体系中的重组表达策略。

首先,构建了基于游离型质粒的表达平台。

通过分离、克隆了多个枯草芽胞杆菌内的表达元件,包括组成型启动子(PdegQ、PglpD和PaprE)和诱导型启动子(PamyE、 PsacB),以及α-淀粉酶的信号肽和终止子序列,构建了一系列新的分泌型表达质粒。

质粒中插入脂肪酶基因YlLip2后,转化蛋白酶缺失型的枯草芽胞杆菌DL3p
菌株,实现了重组脂肪酶的分泌性表达,胞外酶活表达水平达到0.2-4.5U/mg总
蛋白。

另一方面,本文研究并建立了一种新的枯草芽孢杆菌内染色体整合方法。

以全长的单链DNA为电转化底物,利用枯草芽胞杆菌自身的同源整合机制,实现
了简单、高效的在枯草芽孢杆菌染色体上进行外源基因的整合及目标基因的替换。

以脂肪酶YlLip2为验证对象,通过多重融合PCR构建了两端具有同源臂的融合蛋白表达框,并通过不对称PCR、5’端硫代磷酸化修饰等手段制备了全长型的单链DNA表达框作为底物,电转化后实现了该脂肪酶表达框在染色体上amyE位点的基因替换(即双交换整合),且重组脂肪酶rYlLip2实现了功能性表达,酶活约
为0.91U/mg总蛋白。

该方法对枯草芽孢杆菌内重组蛋白表达、基因功能研究等都具有很大的意义。

3、为了提高假丝酵母脂肪酶的表达水平,进一步降低其生产成本,本文研究了假丝酵母脂肪酶在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)宿主中
的高效表达。

重组表达质粒pPICZαA-Lip2转化毕赤酵母GS115菌株后整合于染色体中,在100μg/mL Zeocin平板上筛选得到的重组菌株#0-8号经甲醇诱导后,在5升
发酵罐内产酶水平可达到4580U/mL发酵液,且发酵液中rYlLip2的表达量达到1.05g/L发酵液,重组蛋白含量可以占到总蛋白的50%以上。

为了进一步提高重组蛋白的表达水平,本文又对重组毕赤酵母进行了多拷贝子的筛选。

在500μg/mL Zeocin高抗生素浓度下成功筛选得到脂肪酶高产菌株#2-8号和#3-5号两个多拷贝菌株,摇瓶产酶实验证实#2-8号菌株胞外重组脂肪酶活性可达到350U/mL,与
单拷贝子#0-8号菌相比提高了30%；而在5升发酵罐内发酵液中酶活达到
11000U/mL,与#0-8号相比提高了150%。

重组蛋白含量达到了2.3g/L发酵液,时空产量达到67900U/L/h。

由此,重组假丝酵母脂肪酶YlLip2的表达量得到了显著提高,实现了重组脂肪酶的高水平表达。

经Southern blot印迹杂交分析确定脂肪酶高产菌株#2-8和#3-5为多拷贝转化子,拷贝数约为3。

4、亚罗解脂假丝酵母脂肪酶作为一种具有广泛应用价值的脂肪酶,其热稳定性却较差,妨碍了该酶的应用和产业化。

在本实验中,我们以提高脂肪酶YlLip2的热稳定性为目标,分别利用分子定向进化技术、半理性设计方法B-FIT对酶进行改造,获得了多个热稳定性提高的突变酶,包括单点突变体F237C、A103S和
T117G,将酶在50℃下的半衰期tl/2由2min提高至了5.5min。

而后通过定点突变技术构建了多位点组合突变体并进行了分析、鉴定。

其中,热稳定性最高的组合突变体T117G/F237C在50℃下的半衰期达到14.4min,与原始酶相比提高了7倍以上。

通过蛋白质结构模拟,本文探讨了突变酶热稳定性提高的机制,为更深入揭示亚罗解脂假丝酵母脂肪酶的结构与功能关系提供了理论基础。