黄连多糖抗蛋白质非酶糖基化活性初步研究

黄连多糖抗蛋白质非酶糖基化活性初步研究
李敏;金晶;叶新;刘秋爽;唐晓宇;钱铭;曹妍;张良栓
【摘要】初步研究了黄连多糖对体外蛋白质非酶糖基化过程的抑制作用.应用化学方法建立蛋白质非酶糖基化反应模型,以氨基胍为阳性对照,考察黄连多糖对蛋白质非酶糖基化过程中Amadori产物、二羰基化合物及蛋白质非酶糖基化终产物(AGEs)的生成这三个阶段的影响.实验结果表明,黄连多糖可以从糖基化反应的三个阶段来抑制AGEs的生成,在不同浓度下均具有很强的抑制作用,且对Amadori产物生成的抑制作用强于阳性对照氨基胍(p ＜0.05,n=3).这提示黄连多糖可能为中药黄连中抑制糖尿病的活性物质.根据糖尿病并发症的产生机制,黄连多糖有可能成为价廉、无毒的糖尿病并发症抑制或治疗药物.
【期刊名称】《黑龙江大学自然科学学报》
【年(卷),期】2014(031)002
【总页数】5页(P223-227)
【关键词】黄连;多糖;蛋白质非酶糖基化;糖尿病
【作者】李敏;金晶;叶新;刘秋爽;唐晓宇;钱铭;曹妍;张良栓
【作者单位】哈尔滨医科大学药学院,哈尔滨150081;哈尔滨医科大学药学院,哈尔滨150081;哈尔滨医科大学药学院,哈尔滨150081;哈尔滨医科大学药学院,哈尔滨150081;哈尔滨医科大学药学院,哈尔滨150081;哈尔滨医科大学药学院,哈尔滨150081;哈尔滨医科大学药学院,哈尔滨150081;哈尔滨医科大学药学院,哈尔滨150081
【正文语种】中文
【中图分类】R587.1
0 引言
在非酶促条件下,蛋白质的游离氨基可与还原糖的羰基缩合成一不稳定的醛亚胺,然
后经过环化、异构化重排形成稳定的1-氨基-1-去氧-D-酮糖,即Amadori产物。

Amadori产物经过氧化、降解、脱水及重排产生醛类、二羰基化合物等中间产物。

这些中间产物可以继续与氨基缩合,而且糖化后的蛋白质分子之间、糖化的蛋白质
分子与未被糖化的蛋白质分子之间都可以相互交联,最终形成复杂的糖基化终产物(Advanced glycation end products,AGEs),这一过程被称为蛋白质的非酶糖基化反应,是糖尿病慢性并发症的重要发病机制之一[1]。

据报道,AGEs可以引起糖尿病
血管病变、糖尿病足、糖尿病肾病及眼病等糖尿病并发症,对人体造成严重危害[2]。

很多药物通过对蛋白质非酶糖基化反应的抑制发挥对糖尿病并发症的治疗作用[3-5]。

黄连(Coptis Chinensis French)为毛茛科黄连属植物黄连、三角叶黄连、或云连
的干燥根茎,习称味连、雅连、云连。

黄连具有较高的药用价值,最早记载于《神农
本草经》,其治疗消渴(即糖尿病)的功能较为显著,古方中记载,黄连可被单独或复方
入药以治疗消渴[6]。

现代研究表明,黄连中小檗碱成分具有良好的降血糖和降血脂
的作用[7],但其水溶性多糖成分的抗糖尿病活性研究尚未见报道。

本论文初步研究了黄连多糖的抗蛋白质非酶糖基化活性,为研究黄连多糖治疗及抑
制糖尿病及其并发症的机制、扩大黄连的药理药效作用提供参考。

多糖类药物具有价格低廉、低毒、无副作用的特点,因此,黄连多糖将有很大的社会效益和广泛的开
发前景。

1 实验部分
1.1 仪器与材料
37 ℃恒温培养箱(上海福玛实验设备有限公司);岛津UV-2550紫外分光光度计(日本岛津公司);岛津F-5301荧光分光光度计(日本岛津公司);其他实验室常规仪器。

氨基胍、叠氮化钠、牛血清白蛋白(BSA)、葡萄糖、氯化硝基四氮唑蓝(NBT)及吉拉德试剂购自美国Sigma公司；其他试剂均为国产分析纯。

实验所用药材购自黑龙江省千行健中药饮片有限公司,为毛茛科(Ranunculaceae)黄连属(Coptis)植物黄连(Coptis Chinensis Franch)的干燥根茎,称为味连,又名鸡爪连。

1.2 实验方法
1.2.1 黄连多糖的制备
将鸡爪黄连粉碎,称取其干燥的粉末100 g,用5倍无水乙醇回流脱脂4 h。

待滤渣干燥后,加入5倍0.1 mol·L-1 NaOH溶液,80 ℃水浴回流提取1 h。

提取液调至中性,抽滤,旋转蒸发浓缩至原液的1/4体积。

向浓缩液中加入纤维素蛋白酶和胃蛋白酶各0.05 g,40 ℃水浴2 h。

按Sevag法(提取液∶氯仿∶正丁醇=25∶5∶1),搅拌20 min后,以4 000 r·min-1的转速离心5 min,静置分层,弃去氯仿层。

依此法除5次蛋白即可。

旋转蒸发除去剩余的正丁醇和氯仿,加无水乙醇沉淀得粗多糖。

以超纯水作为洗脱剂,分别用DEAE纤维素色谱柱和Sephadex G-100色谱柱将再次溶解的粗多糖进行脱色纯化,将洗脱液浓缩至原液体积的1/4后,冷冻干燥,得到纯化黄连多糖,命名为CP。

用硫酸苯酚法测定其含量。

1.2.2 体外蛋白质非酶糖基化体系的建立
在无菌条件下,向无菌细胞培养瓶中加入20 mg·mL-1牛血清白蛋白溶液(用孔径为0.2 μm的除菌膜除菌)和1 mol·L-1葡萄糖溶液各20 mL,以及含0.02%叠氮化钠的磷酸盐缓冲液(200 mmol·L-1,pH=7.4)10 mL,建立完整的糖基化体系对照组a,同时设立不加药物、不含糖的对照组b。

设置终浓度分别为0.1、0.5和1.0
mg·mL-1的黄连多糖干预组,以氨基胍为阳性对照,在37 ℃恒温培养后进行下述实验。

1.2.3 黄连多糖对Amadori产物生成的影响
参照Bake等人[8]的方法略做改动,培养30 d时,取0.5 mL糖基化物质和2.0 mL 0.3 mmol·L-1 NBT 在碳酸钠缓冲溶液(100 mmol·L-1,pH=10.35)中于室温测定
孵化15 min。

在530 nm处测定吸光度A。

用碳酸钠缓冲溶液代替糖基化物质作为空白，按照式(1)计算黄连多糖对Amadori产物生成的抑制率IE。

IE(%)%
(1)
1.2.4 黄连多糖对二羰基化合物生成的影响
参照Wells-Knecht方法[9],培养30 d时,取0.4 mL培养液、0.2 mL 500 mmol·L-1吉拉德-T(N-氯-N-吡啶基乙酰肼)储备液和3.4 mL甲酸钠溶液(500 mmol·L-1,pH=2.9)，在室温下孵化1 h,在294 nm处测定吸光度A。

以甲酸钠溶液替代糖基化物质为空白,按照式(1)计算黄连多糖对二羰基化合物生成的抑制率IE。

1.2.5 黄连多糖对蛋白质非酶糖基化终产物生成的影响
分别于培养0、3、6、12、18、24、30 d时,取出0.5 mL培养液,稀释至10 mL,
测定终产物在激发波长370 nm、发射波长440 nm处的荧光强度值F,按照式(2)
计算黄连多糖对非酶糖基化的抑制率IE。

IE(%)%
(2)
用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)验证黄连多糖(1.0 mg·mL-1)对蛋白质非酶糖基化终产物生成的干预作用,利用Quantity One图像分析软件计算糖
基化BSA光密度/原BSA光密度。

1.2.6 数据统计
所有实验数据均以三次实验结果的平均值±标准差(mean±SD)表示。

所有数据采用配对t检验的方法进行统计,以p<0.05作为显著性差异标准。

用GraphPad Prism 5.0软件处理。

2 结果
2.1 黄连多糖的制备
冷冻干燥后得到乳白色絮状黄连多糖纯品1.13 g,用苯酚硫酸法测得此黄连多糖含量为95.6%。

2.2 黄连多糖对Amadori产物生成的影响
蛋白质非酶糖基化过程早期产生的Amadori产物可与NBT在碱性条件下进行反应且发生颜色变化,在530 nm处有最大吸收。

不同浓度的黄连多糖对该过程的干预情况如表1所示。

在葡萄糖/BSA体系中,黄连多糖对Amadori产物的生成有较强的抑制作用,随着浓度的增加抑制作用增强,且抑制作用要强于阳性对照氨基胍组(p<0.05,n=3)。

2.3 黄连多糖对二羰基化合物生成的影响
蛋白质非酶糖基化过程中期产生的二羰基化合物可与吉拉德-T试剂(酰肼类化合物)作用,生成的腙类化合物在294 nm处有最大吸收。

黄连多糖对二羰基化合物生成的干预作用测定结果如表2所示。

表1 黄连多糖对Amadori产物生成的影响Table 1 Effect of Coptis chinensis polysaccharide onthe formation of Amadori products样品浓度(mg·mL-1)抑制率(%) 0.128.4±0.8∗黄连多糖0.537.3±0.2∗1.054.1±0.9∗ 0.116.3±0.3 氨基胍0.519.5±0.11.024.0±0.5
注：*p<0.05
表2 黄连多糖对二羰基化合物生成的影响Table 2 Effect of Coptis chinensis polysaccharide onthe generation of two carbonyl compounds样品浓度
(mg·mL-1)抑制率(%) 0.129.5±2.1∗黄连多糖0.543.5±1.5∗ 1.058.8±2.2∗
0.137.3±2.4 氨基胍0.559.1±3.3 1.072.4±4.2
注：*p<0.05
黄连多糖对二羰基化合物的生成有较强的抑制作用,随着浓度的增加抑制作用增强。

在浓度为1.0 mg·mL-1时,黄连多糖对二羰基化合物生成的抑制作用最强,抑制率大于50%,但抑制作用要弱于阳性对照氨基胍组(p<0.05,n=3)。

2.4 黄连多糖对蛋白质非酶糖基化终产物生成的影响
葡萄糖/BSA体系在孵育过程中会产生具有荧光性质的糖基化终产物,取各组样品分别于0、3、6、12、18、24、30 d在激发波长370 nm、发射波长440 nm处,
测定其荧光吸收情况，结果如图1(a)所示。

图1 黄连多糖对蛋白质非酶糖基化终产物生成的影响:(a)糖基化终产物荧光活性测定;(b)SDS-PAGE凝胶电泳,*p<0.05
Fig. 1 Effect of Coptis chinensis polysaccharide on the formation of protein non enzymatic glycosylation endproducts: (a)Fluorescence of AGEs;
(b)SDS-PAGE gel electrophoresis, *p<0.05
在葡萄糖/BSA体系中,糖基化终产物的荧光强度随着孵育时间的增长而增强。

对照组a的荧光强度增强最为迅速。

加入黄连多糖和氨基胍的糖基化体系中,荧光强度
的增强速度与完整的糖基化体系相比明显降低。

各浓度多糖都对糖基化终产物的生成具有明显的抑制作用,但黄连多糖的抑制作用弱于阳性对照氨基胍组(见表
3,p<0.05,n=3)。

在SDS-PAGE实验中,在分子量Mw=90 kDa处,可以见到明显的糖基化蛋白条带,这表明在糖基化终产物形成期间,葡萄糖与蛋白质发生了交联,黄连多糖对糖基化蛋
白的生成有很强的抑制作用,但其抑制作用稍弱于阳性对照氨基胍组(见图
1(b),p<0.05,n=3),这与荧光强度测定的实验结果相符。

表3 黄连多糖对蛋白质非酶糖基化终产物生成的影响Table 3 Effect of Coptis chinensis polysaccharide onthe formation of protein non enzymaticglycosylation end products样品浓度(mg·mL-1)抑制率(%)
0.126.6±2.8∗黄连多糖0.543.7±0.9∗ 1.058.3±2.0∗ 0.130.9±1.1 氨基胍
0.553.0±1.51.069.8±2.6
注：*p<0.05
3 讨论
AGEs是非酶糖基化反应的终产物,在糖尿病患者体内蓄积,可引起多种慢性糖尿病并发症。

研究证明,通过抑制AGEs的生成可以有效地防治糖尿病并发症。

随着中药学的发展,许多具有糖尿病并发症治疗作用的中药被相继发现。

这些中药中多糖成分可通过抑制蛋白质非酶糖基化终产物的生成来抑制糖尿病并发症的发生[10-11]，但多糖类成分究竟作用在AGEs形成的初期、中期或者晚期尚不确定。

蛋白质非酶糖基化不同于糖蛋白的合成,不需要糖基供体和酶的催化,也不形成糖苷键。

在蛋白质非酶糖基化的早期,人体内的葡萄糖与蛋白质或氨基酸游离的氨基发生反应,生成Schiff碱,然后经过环化、异构化重排生成酮胺类化合物,即Amadori 产物。

本研究证明,黄连多糖在此阶段有显著作用,其效果强于阳性对照氨基胍。

在非酶糖基化的中期,对于半衰期较长的蛋白质如胶原蛋白,Amadori产物再经过Maillaid反应即氧化、水解反应降解生成乙二醛、甲基乙二醛和脱氧葡萄糖醛酮等二羰基化合物。

非酶糖基化的晚期,这些化合物比葡萄糖更易与游离的氨基发生反应,通过氧化、水解和环化反应形成不可逆的具有荧光性质的AGEs[12]。

另外,Amadori产物的氧化反应首先产生超氧阴离子,继而由超氧阴离子生成过氧化氢和羟基自由基,羟基自由基可引发脂质过氧化反应,从而促进AGEs的生成。

因此,氧化反应参与了AGEs形成的全过程。

前期研究表明,黄连多糖具有良好的抗氧化及清除自由基的能力[13],黄连多糖对二羰基化合物及AGEs形成的抑制作用可能主
要得益于此。

4 结论
本研究以糖尿病发病机理蛋白质非酶糖基化学说为理论基础，考察了临床及民间验方确定的对糖尿病有抑制和治疗作用的中药黄连中多糖成分对该过程的作用机制，证明黄连多糖可以抑制Amadori产物、二羰基化合物及蛋白质非酶糖基化终产物的形成，且作用机制与氨基胍有所不同。

因此，黄连多糖可能具有潜在的治疗糖尿病并发症的功能，本研究为开发价廉、无毒的可抑制或治疗由糖基化终产物引发的糖尿病并发症的药物开拓了新视野。

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