HPLC法测定连翘中的连翘苷

HPLC法测定连翘中的连翘苷
第一部分前言
1.连翘药材
连翘是中国临床常用传统中药之一，为木犀科连翘属植物连翘的干燥果实。

主产于我国的山西、河南、陕西。

连翘有清热解毒，散结消肿之功效。

连翘的化学成分主要有挥发油类，苯乙醇苷类、木脂素类、三萜及黄酮类等化合物。

木脂素分为木脂内酯和双环氧木脂素。

2.连翘苷
而连翘苷（Phillyrin），是双环氧木脂素类化合物的葡萄糖苷，化学式为C27H34O11，分子量534.56，熔点181℃，难溶于水，溶于乙醇、甲醇等有机溶剂。

《中国药典2010年版一部》将连翘苷作为控制连翘质量的重要指标，规定按干燥品计算，含连翘苷不得少于0.15%。

3.研究目的
据文献报道连翘苷含量测定方法有薄层扫描法、HPLC-UV法、毛细管区带电泳法、拉曼光谱法、近红外漫反射光谱法、近红外光谱法。

我们考虑到实际情况，拟采用HPLC法对连翘中连翘苷的含量进行测定，建立起连翘药材中连翘苷的含量测定方法。

第二部分实验
一、条件的选择
1、提取条件的选择
对同一连翘药材，我们采用甲醇为溶剂，回流提取、超声波提取、索氏提取三种方法对药材进行处理，结果发现，在三种提取方法中以超声波法从连翘中提取连翘苷的提取率较高，且能将有效成分进行分离。

而且这种方法进行提取操作简单，便于实际操作。

2、检测波长的选择
配制好的连翘苷对照品，我们拿到紫外室，使用紫外扫描检测器在190～400nm范围内对其进行扫描，发现在波长230nm和270nm处均有最大吸收峰，在后面的进一步实验验证，结果表明，在230nm处吸光度较大，灵敏度高。

因此确定选择检测波长为230nm，效果较好。

3、色谱流动相的选择
实验中，我们分别比较了多种比例的流动相，曾选用甲醇—水（40：60）、乙腈—水（30：70）、乙腈—水（21：79）、乙腈—甲醇（25：75）等，结果显示峰形较好的流动相比例乙腈—水（21：79），在此比例的流动相条件下，可以有效的改善峰形，分离效果明显。

4、标准品溶剂的选择
在实验中，我们首先按照药典中配制标准品的方法，使用甲醇溶解标准品后测定，发现溶剂峰过高，影响实验效果；于是就采用乙腈为溶剂溶解标准品测定，发现又会出现前延峰；因此我们选择改变溶剂的浓度大小，使其和流动相比例相近，使用25%乙腈溶解标准品后测定，发现可改善峰形，出峰效果较好。

最终，经过一系列的前期准备与实验条件摸索，我们确定下来的色谱条件为：色谱柱为C18色谱柱(4.6 mm×150 mm，5μｍ)，流动相为乙腈-水(体积比为21∶79)，流速1.0mL/min，柱温为室温，检测波长:230nm；进样量：20μl，理论塔板数不低于3000。

二、方法学考察
1、方法的专属性
按照确定下来的色谱条件，我们先吸取连翘苷标准品溶液、供试品溶液各20μl，进样，记录色谱图，结果见图所示。

在本色谱条件下，连翘苷保留时间约为10.38min。

本方法具有较高的专属性，在此条件下所测得的结果能代表连翘苷的含量。

2、线性关系考察
精密吸取连翘苷标准品稀释溶液4，8，12，16，20μL，分别进样进行分析，按色谱条件测定峰面积，以峰面积为纵坐标，以连翘苷标准品进样量(μg)为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。

3、精密度试验
精密吸取连翘苷标准品重复进样5次，每次进样20μl，以测得的峰面积为指标，连翘苷的相对标准偏差RSD为1.69%（n=5），表明仪器精密度良好。

4、稳定性试验
精密吸取同一供试品溶液，在放置 2，4，6，8，10h后进样，每次进样20μl，测定峰面积值，结果表明连翘苷在10h内稳定性良好，RSD为1.70%。

5、重复性试验
精密称取同一连翘样品5份，按上述供试品溶液制备方法和色谱条件进行测定，结果连翘苷RSD=1.65%（n=5）。

6、样品含量测定
精密吸取供试品溶液按上述色谱条件进行测定，结果连翘药材中连翘苷的含量为1.152mg/g。

7、加样回收率试验
三、结论
本实验标准曲线，连翘苷的线性范围0.264～1.32μg，线性关系良好，相关系数均达到0.999以上；日内精密度RSD%均小于2%；样品稳定性试验表明样品在10h内稳定性良好。

此法简便快捷，准确度高，可用于连翘药材的质量控制。