药物特殊毒性评价
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人类基因库是指人群生殖细胞所具有的能传给下一代的 全部基因总和。 基因组是指单一个体所具有全部基因 在人群中每个个体新携带的有害基因的平均水平叫做人 群的遗传负荷（Genntic load）或突变负荷（mutation
load)
突变后果
体细胞突变的后果
体细胞突变的后果中令人最关心的是致癌问题 其次是致畸 体细胞的突变可能与动脉硬化有关 体细胞突变是老化的起因
一、Ames试验
菌株鉴定
③uvrB缺失的鉴定（紫外线敏感试验） uvrB缺失，即切除修复系统缺失 ④R因子的鉴定：带有R因子的菌株具有抗氨苄 青霉素的特性
一、Ames试验
菌株鉴定
（2）自发回变数测定 受试菌株在保存或培养过程应 经过体外代谢活化系统后的自发回变数，要比不 经体外代谢活化系统的自发回变数略高。
和TA102四种标准菌株。
一、Ames试验
一、Ames试验
[菌株鉴定]
基因型鉴定
A. 组氨酸需求试验 B. 深粗糙型(rfa)鉴定 C. urvB缺失的鉴定 D. R因子的鉴定(抗生素抗性试验)
自发回变数测定 对鉴别性致突变物的反应
菌株鉴定
一、Ames试验
（1）基因型鉴定 ①组氨酸营养缺陷型鉴定（组氨酸需求试验） 组氨酸营养缺陷型菌株只能在补充有组氨酸的培养皿上 生长 ②深粗糙型（rfa）鉴定（结晶紫抑菌试验） 深粗糙型突变细菌，缺乏脂多糖屏障，一些大分子能进 入菌体
二、染色体畸变 在诱变因素的作用下，染色体从
长轴上断下一个片段
2.染色体结构的畸变 断裂是造成染色体结构变 染色体的断片未与断裂端连接 化的根本原因，根据断片不同的重接方式，形 结果：失去一个片段及所携带的遗 成以下四种畸变： 传密码 （1）缺失 断片与同源染色体连接 结果：使部分遗传密码重复出现 （2）重复 断片作180°倒转后，再接到断端 （3）倒位 结果：所携带的遗传密码紊乱 两条非同源染色体同时断裂，两个 （4）易位
第4节 药物遗传毒性评价
国际经济合作发展组织（OECD）推荐方法
1 鼠伤寒沙门氏杆菌回复突变试验 2 4 5 大肠杆菌回复突变试验 微核试验 哺乳动物体内骨髓细胞遗传试验
3 体外哺乳动物细胞染色体畸变试验
6 哺乳动物体外细胞基因突变试验
7 果蝇隐性伴性致死试验 8 啮齿动物显性致死试验
一些国家新药遗传毒性试验的项目
突变后果
生殖细胞突变的后果 致死性的 非致死性的-----遗传病（显性或隐性） 在遗传疾病增多的同时，突变的基因（及染色体） 损伤将造成下一代的基因库的遗传负荷
可遗传的突变都是坏事？
第4节 药物遗传毒性评价
符合下列情况者应优先考虑检测
• 已知的或可疑的诱变剂有关的化合物
• • • • • •
在动物实验中表现出某些毒性反应的化合物 临床疗程长，尤其是用于儿童和青年人的药物 在大部分人群中使用的药物 一般用于预防的药物 普遍滥用的药物 以高浓度与精子接触起作用的药物
毒理学
一般毒性评价 特殊毒性评价 遗传毒性 致癌性 生殖毒性 依赖性
急性毒性
长期毒性
局部毒性
目 了解毒性反应剂量、时间、强度、症状、靶器官及可逆性等， 的 为临床方案提供参考、预测出现的毒性反应，制订临床防护
措施、保证受试者用药安全
先天愚型
海豹肢畸形
第1节 药物致遗传损伤的类型
突变（mutation）指生物体遗传物质发生急剧的遗 传学变化，导致可遗传的表型变异，其表型变异为不 可逆的，这种现象称为突变作用。
二、不以DNA为靶的间接诱变 凡干扰有丝分裂的物质，不管是抑制纺锤体的功 能，或扰乱染色体分离，称之为干扰剂 1.秋水仙效应有丝分裂（细胞分裂完全抑制） 秋水仙碱 长春新碱 2对酶促过程的作用 对DNA合成和复制有关的 酶系统作用也可间接影响遗传物质
第3节 药物致遗传损伤的影响因素及后果
对人类基因库的影响
微核试验
[试验设计]
1. NIH小鼠，6只/组（雄性）或10只/组（雌雄各半） 。
2.动物体重差异应在平均体重的20%之内。 3.至少三个剂量组；高剂量以LD50/2为基准；低剂量应结 合药效学及临床用量。 4.设阳性对照组（环磷酰胺）和阴性对照组（溶剂） 5.两次染毒或多次染毒
6.每组选100个染色体分散良好的中期分裂相细胞进行染色体畸变分析
哺乳动物胞染色体畸变试验
[结果及判定]
镜检：每种浓度至少观察100个中期分裂相细胞和染色体结 构，计算结构突变及多倍体出现率。 阳性结果判定标准： 1 染色体畸变数增加与药物剂量有关，单剂量组按下表判定
畸变率
<5% >5%
结果
－ ±
（3）移码突变
定义：指DNA多核苷酸链上碱基序列中丢失一个 或几个碱基，或插入一个或几个化合物分子，结 果使突变位点以下的碱基序列发生变更，以致使 三联密码转录和翻译时，发生较多遗传信息的改 变。 多环芳香烃类、等能引起插入性移码突变
一、基因突变
（三）同义突变、错义突变和无义突变
二、染色体畸变
（二）染色体畸变 定义：一个或几个染色体结构或数目发生变化， 用光学显微镜可以直接进行观察。 1.染色体数目的畸变 突变细胞中，染色体可以成倍地发生变化，也可 以不成倍的增减
构改变改变
一、基因突变
（二）碱基置换与移码突变
（1）转换型突变：指DNA多核苷酸链上的碱基 中，嘌呤互相取代或嘧啶互相取代所引起的突 变。如：亚硝酸可引起这种突变 （2）颠换型突变：只DNA多核苷酸链上的碱基 中，嘌呤取代嘧啶或嘧啶取代嘌呤所引起的突 变。如：二乙基亚硝酸胺
一、基因突变
（二）碱基置换与移码突变
断片交换位置后相接 结果：所携带的遗传密码紊乱
第二节 突变作用的分子机理
一、直接作用于DNA
1.碱基类似物取代 如：5-溴脱氧尿嘧啶核苷与胸腺嘧啶（T）相似 2.烷化剂的影响 一般认为，鸟嘌呤的N-7位置最易接受烷化剂给予 的烷化基团，当N-7位受到烷化后，分子的内部 电子和质子位置重新排列，鸟嘌呤由酮式异构体 变为烯醇式异构体，引起碱基错误配对，最终产 生转换型碱基置换
传毒性 [试验设计]
1.试验至少设4个剂量组 2.最高剂量组的细胞存活率为10%-20% 3.无毒性受试物最高剂量组不超过10mmol/L或5mg/ml 4.应设空白对照、阳性对照和S9对照
体外哺乳动物细胞染色体畸变试验
[方法]
1.在培养72小时的细胞中一次加入一定浓度的受试物、S9混合液（不加
S9混合液时，需用培养液不足）及一定量不含血清的培养液，混匀后 继续培养24h收获细胞 2.收获细胞前加入秋水仙碱作用4小时 3.用胰蛋白酶溶液消化并收集细胞，加入KCL溶液低渗处理10min 4.离心后，用甲醇/冰醋酸液固定2次 5.常规底片，染色，清洗，晾干
试验项目 日本 欧共体 加拿大 中国
微生物回复突变试验
+ + +
+ + +
+ + +
+ + +
哺乳动物培养细胞染 色体畸变试验
啮齿动物微核试验 体外真核细胞基因突 变试验
+
-
一、鼠伤寒沙门菌回复突变试验（ Ames试验）
1.[原理]
组氨酸缺陷型鼠伤寒沙门氏菌在缺乏组氨酸的培养基
上不能生长，但在加有致突变原的培养基上培养，则可使 突变型产生回复突变成为野生型，即恢复合成组氨酸的能 力，于是就能在缺乏组氨酸的培养基上生长成为菌落，通 过计数菌落出现的数目估计药物诱变性的强弱。同时在检 测系统中还包括大鼠肝微粒体酶（S9）体外代谢活化系统， 使药物在体外受到与体内类似的氧化活化作用，因此可测 出间接诱变原。
一、Ames试验
对照组 阴性对照组 阳性对照组 对需使用间接诱变物作对照时，应注意平行 加S9 与不加S9的对照
代谢活化
一、Ames试验
S9代谢活化系统：经诱导的大鼠肝脏匀浆，离心后所上清即为 S9上清液，再向其中加入一些辅助因子，如辅酶II（NADP）、
应用诱导剂处理后的S9进行体外代谢活化试 6-磷酸葡萄糖、 K+/Mg2+等，组成混合液，从而构成还原型 验 ，即在加 S9和不加 S9混合物平行条件下测试。 辅酶II再生系统。肝 S9的成分主要是混合功能氧化酶，大多
一、Ames试验
2.[试验菌株]
一、Ames试验
各种鼠伤寒沙门氏菌株对不同的致突变物敏感性不同 TA100和TA98可推荐用于大多数致突变物和致癌物的 检测。 试验前必须进行菌株的基因型鉴定、自发回变数鉴定及 对鉴别性致突变物的反应鉴定，合格后才能用于致突变 试验 TA97、TA98 、TA100 我国《新药审批办法》中推荐使用
突变作用可视为DNA结构在任一水平上受到破坏，并 由此改变了体细胞或生殖细胞中的遗传信息，DNA是 大分子物质，它决定了生命现象的基本属性
碱基的排列顺序决定着蛋白质肽链的长短及其氨 基酸的顺序 基因是DNA分子上最简单而已完整的功能单位， 每一个基因产生一种功能产物，几乎所有的基因 功能产物是多肽（蛋白质） 一个基因在伸直的DNA链上约500-1000个碱基对 结果可造成细胞或机体的死亡、或细 胞、机体结构形态或功能的改变 染色体畸变（chromosome aberration） 基因突变（gene mutation）
二、 体外哺乳动物细胞染色体畸变试验
中国仓鼠肺（CHL）细胞（推荐）、卵巢（CHO）细胞
[原理]
具有遗传毒性的物质作用于靶细胞引起较大范围的DNA损伤，可出现染 色体水平变化。制备中期分裂相染色体标本，在光镜下可直接观察染色 用细胞遗传学方法检测受试物是否影响DNA结构 体数目和形态的改变。通过检测受试物诱发体外培养的哺乳动物细胞染 或改变遗传信息的实验过程，从而判定受试物的遗 色体畸变能力，从而评价受试物的遗传毒性及其强度
数化合物在体内经过其代谢。
为何要制备S9 ？
为何要诱导制备S9 ？
一、Ames试验
一、Ames试验
4.[方法]
(1)掺入法： (2)点试法：
5.[结果评价]
报告的试验结果应是2次独立实验的重复结果。 判断是否是致突变物？
一、Ames试验
（1）掺入法： Rt/ Rc=诱发回变菌落数/自发回变菌落数 >2为阳性 (2)点试法：凡在滤纸周围长出一圈密集的回 变菌落，该药物即为致突变物质。 如在平皿上出现少数散在的自发菌落，则为 阴性
一、Ames试验
3.[试验设计]
决定药物最高剂量的标准是药物对细菌的毒性和
溶解度。 西药最大剂量可达5mg/皿，中药可超过5mg/皿 DMSO≤0.4 ml；乙醇≤0.1 ml 最低剂量0.2 μ g/ 皿. 至少5个不同剂量
每剂量间隔不差过5倍
每个剂量应做3个皿 可用水、二甲基亚砜(DMSO)或乙醇做溶剂
微核试验
[动物]
NIH小鼠，6只/组（雄性）或10只/组（雌雄各半）， 。
[给药剂量及途径]
高、中、低三个剂量；高剂量以LD50/2为基准；低 剂量应结合药效学及临床用量；一般单次给药。
[对照]
阴性（溶媒）对照；阳性（环磷酰胺）。
环磷酰胺不同途径给药对小鼠微核出现率的影响
剂量（mg/kg） 50 100 60 60 100 100 给药途径 腹腔注射 腹腔注射 皮下注射 肌内注射 肌内注射 经口给药 平均微核率（‰） 24.60 78.00 36.10 17.00 33.00 21.00
二、基因突变与染色体畸变
（一）基因突变 定义：组成一个染色体的一个或几个基因发生变 化，这种变化不能用光学显微镜直接观察到。
一、基因突变
（一）自发突变与诱发突变 自发突变--------在自然状态下基因结构发生的改变 ，与生物适应环境变化的进化有关
诱发突变--------在外界因素影响下所产生的基因结
>10%
>20%
＋
＋＋
>50%
＋＋＋
2 某一测试点呈现可重复的并有统计学意义的增加
三、微核试验
[原理]
骨髓细胞经致突变物作用，其染色体可发生畸变以致 断裂。其断裂的碎片在分裂间期留在子代细胞内形成规则 的一个或几个圆形或椭圆形结构的小块物质，由于它比普 通细胞核小，故称之为微核（micronucleus）。观察骨髓 细胞中的微核率，有助于检验药物是否具有致突变作用。 虽然骨髓和外周血各种有核细胞中均可见到微核，但 只有在无核的红细胞中才易辩认。在骨髓中无核红细胞有 嗜多染红细胞（晚幼红细胞）和成熟红细胞两种，正常情 况下，嗜多染红细胞占多数。由于毒性物质影响了骨髓红 细胞尤其是嗜多染红细胞，使二者比例失衡，故在骨髓涂 片中一般均在嗜多染红细胞中进行观察。
load)
突变后果
体细胞突变的后果
体细胞突变的后果中令人最关心的是致癌问题 其次是致畸 体细胞的突变可能与动脉硬化有关 体细胞突变是老化的起因
一、Ames试验
菌株鉴定
③uvrB缺失的鉴定（紫外线敏感试验） uvrB缺失，即切除修复系统缺失 ④R因子的鉴定：带有R因子的菌株具有抗氨苄 青霉素的特性
一、Ames试验
菌株鉴定
（2）自发回变数测定 受试菌株在保存或培养过程应 经过体外代谢活化系统后的自发回变数，要比不 经体外代谢活化系统的自发回变数略高。
和TA102四种标准菌株。
一、Ames试验
一、Ames试验
[菌株鉴定]
基因型鉴定
A. 组氨酸需求试验 B. 深粗糙型(rfa)鉴定 C. urvB缺失的鉴定 D. R因子的鉴定(抗生素抗性试验)
自发回变数测定 对鉴别性致突变物的反应
菌株鉴定
一、Ames试验
（1）基因型鉴定 ①组氨酸营养缺陷型鉴定（组氨酸需求试验） 组氨酸营养缺陷型菌株只能在补充有组氨酸的培养皿上 生长 ②深粗糙型（rfa）鉴定（结晶紫抑菌试验） 深粗糙型突变细菌，缺乏脂多糖屏障，一些大分子能进 入菌体
二、染色体畸变 在诱变因素的作用下，染色体从
长轴上断下一个片段
2.染色体结构的畸变 断裂是造成染色体结构变 染色体的断片未与断裂端连接 化的根本原因，根据断片不同的重接方式，形 结果：失去一个片段及所携带的遗 成以下四种畸变： 传密码 （1）缺失 断片与同源染色体连接 结果：使部分遗传密码重复出现 （2）重复 断片作180°倒转后，再接到断端 （3）倒位 结果：所携带的遗传密码紊乱 两条非同源染色体同时断裂，两个 （4）易位
第4节 药物遗传毒性评价
国际经济合作发展组织（OECD）推荐方法
1 鼠伤寒沙门氏杆菌回复突变试验 2 4 5 大肠杆菌回复突变试验 微核试验 哺乳动物体内骨髓细胞遗传试验
3 体外哺乳动物细胞染色体畸变试验
6 哺乳动物体外细胞基因突变试验
7 果蝇隐性伴性致死试验 8 啮齿动物显性致死试验
一些国家新药遗传毒性试验的项目
突变后果
生殖细胞突变的后果 致死性的 非致死性的-----遗传病（显性或隐性） 在遗传疾病增多的同时，突变的基因（及染色体） 损伤将造成下一代的基因库的遗传负荷
可遗传的突变都是坏事？
第4节 药物遗传毒性评价
符合下列情况者应优先考虑检测
• 已知的或可疑的诱变剂有关的化合物
• • • • • •
在动物实验中表现出某些毒性反应的化合物 临床疗程长，尤其是用于儿童和青年人的药物 在大部分人群中使用的药物 一般用于预防的药物 普遍滥用的药物 以高浓度与精子接触起作用的药物
毒理学
一般毒性评价 特殊毒性评价 遗传毒性 致癌性 生殖毒性 依赖性
急性毒性
长期毒性
局部毒性
目 了解毒性反应剂量、时间、强度、症状、靶器官及可逆性等， 的 为临床方案提供参考、预测出现的毒性反应，制订临床防护
措施、保证受试者用药安全
先天愚型
海豹肢畸形
第1节 药物致遗传损伤的类型
突变（mutation）指生物体遗传物质发生急剧的遗 传学变化，导致可遗传的表型变异，其表型变异为不 可逆的，这种现象称为突变作用。
二、不以DNA为靶的间接诱变 凡干扰有丝分裂的物质，不管是抑制纺锤体的功 能，或扰乱染色体分离，称之为干扰剂 1.秋水仙效应有丝分裂（细胞分裂完全抑制） 秋水仙碱 长春新碱 2对酶促过程的作用 对DNA合成和复制有关的 酶系统作用也可间接影响遗传物质
第3节 药物致遗传损伤的影响因素及后果
对人类基因库的影响
微核试验
[试验设计]
1. NIH小鼠，6只/组（雄性）或10只/组（雌雄各半） 。
2.动物体重差异应在平均体重的20%之内。 3.至少三个剂量组；高剂量以LD50/2为基准；低剂量应结 合药效学及临床用量。 4.设阳性对照组（环磷酰胺）和阴性对照组（溶剂） 5.两次染毒或多次染毒
6.每组选100个染色体分散良好的中期分裂相细胞进行染色体畸变分析
哺乳动物胞染色体畸变试验
[结果及判定]
镜检：每种浓度至少观察100个中期分裂相细胞和染色体结 构，计算结构突变及多倍体出现率。 阳性结果判定标准： 1 染色体畸变数增加与药物剂量有关，单剂量组按下表判定
畸变率
<5% >5%
结果
－ ±
（3）移码突变
定义：指DNA多核苷酸链上碱基序列中丢失一个 或几个碱基，或插入一个或几个化合物分子，结 果使突变位点以下的碱基序列发生变更，以致使 三联密码转录和翻译时，发生较多遗传信息的改 变。 多环芳香烃类、等能引起插入性移码突变
一、基因突变
（三）同义突变、错义突变和无义突变
二、染色体畸变
（二）染色体畸变 定义：一个或几个染色体结构或数目发生变化， 用光学显微镜可以直接进行观察。 1.染色体数目的畸变 突变细胞中，染色体可以成倍地发生变化，也可 以不成倍的增减
构改变改变
一、基因突变
（二）碱基置换与移码突变
（1）转换型突变：指DNA多核苷酸链上的碱基 中，嘌呤互相取代或嘧啶互相取代所引起的突 变。如：亚硝酸可引起这种突变 （2）颠换型突变：只DNA多核苷酸链上的碱基 中，嘌呤取代嘧啶或嘧啶取代嘌呤所引起的突 变。如：二乙基亚硝酸胺
一、基因突变
（二）碱基置换与移码突变
断片交换位置后相接 结果：所携带的遗传密码紊乱
第二节 突变作用的分子机理
一、直接作用于DNA
1.碱基类似物取代 如：5-溴脱氧尿嘧啶核苷与胸腺嘧啶（T）相似 2.烷化剂的影响 一般认为，鸟嘌呤的N-7位置最易接受烷化剂给予 的烷化基团，当N-7位受到烷化后，分子的内部 电子和质子位置重新排列，鸟嘌呤由酮式异构体 变为烯醇式异构体，引起碱基错误配对，最终产 生转换型碱基置换
传毒性 [试验设计]
1.试验至少设4个剂量组 2.最高剂量组的细胞存活率为10%-20% 3.无毒性受试物最高剂量组不超过10mmol/L或5mg/ml 4.应设空白对照、阳性对照和S9对照
体外哺乳动物细胞染色体畸变试验
[方法]
1.在培养72小时的细胞中一次加入一定浓度的受试物、S9混合液（不加
S9混合液时，需用培养液不足）及一定量不含血清的培养液，混匀后 继续培养24h收获细胞 2.收获细胞前加入秋水仙碱作用4小时 3.用胰蛋白酶溶液消化并收集细胞，加入KCL溶液低渗处理10min 4.离心后，用甲醇/冰醋酸液固定2次 5.常规底片，染色，清洗，晾干
试验项目 日本 欧共体 加拿大 中国
微生物回复突变试验
+ + +
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哺乳动物培养细胞染 色体畸变试验
啮齿动物微核试验 体外真核细胞基因突 变试验
+
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一、鼠伤寒沙门菌回复突变试验（ Ames试验）
1.[原理]
组氨酸缺陷型鼠伤寒沙门氏菌在缺乏组氨酸的培养基
上不能生长，但在加有致突变原的培养基上培养，则可使 突变型产生回复突变成为野生型，即恢复合成组氨酸的能 力，于是就能在缺乏组氨酸的培养基上生长成为菌落，通 过计数菌落出现的数目估计药物诱变性的强弱。同时在检 测系统中还包括大鼠肝微粒体酶（S9）体外代谢活化系统， 使药物在体外受到与体内类似的氧化活化作用，因此可测 出间接诱变原。
一、Ames试验
对照组 阴性对照组 阳性对照组 对需使用间接诱变物作对照时，应注意平行 加S9 与不加S9的对照
代谢活化
一、Ames试验
S9代谢活化系统：经诱导的大鼠肝脏匀浆，离心后所上清即为 S9上清液，再向其中加入一些辅助因子，如辅酶II（NADP）、
应用诱导剂处理后的S9进行体外代谢活化试 6-磷酸葡萄糖、 K+/Mg2+等，组成混合液，从而构成还原型 验 ，即在加 S9和不加 S9混合物平行条件下测试。 辅酶II再生系统。肝 S9的成分主要是混合功能氧化酶，大多
一、Ames试验
2.[试验菌株]
一、Ames试验
各种鼠伤寒沙门氏菌株对不同的致突变物敏感性不同 TA100和TA98可推荐用于大多数致突变物和致癌物的 检测。 试验前必须进行菌株的基因型鉴定、自发回变数鉴定及 对鉴别性致突变物的反应鉴定，合格后才能用于致突变 试验 TA97、TA98 、TA100 我国《新药审批办法》中推荐使用
突变作用可视为DNA结构在任一水平上受到破坏，并 由此改变了体细胞或生殖细胞中的遗传信息，DNA是 大分子物质，它决定了生命现象的基本属性
碱基的排列顺序决定着蛋白质肽链的长短及其氨 基酸的顺序 基因是DNA分子上最简单而已完整的功能单位， 每一个基因产生一种功能产物，几乎所有的基因 功能产物是多肽（蛋白质） 一个基因在伸直的DNA链上约500-1000个碱基对 结果可造成细胞或机体的死亡、或细 胞、机体结构形态或功能的改变 染色体畸变（chromosome aberration） 基因突变（gene mutation）
二、 体外哺乳动物细胞染色体畸变试验
中国仓鼠肺（CHL）细胞（推荐）、卵巢（CHO）细胞
[原理]
具有遗传毒性的物质作用于靶细胞引起较大范围的DNA损伤，可出现染 色体水平变化。制备中期分裂相染色体标本，在光镜下可直接观察染色 用细胞遗传学方法检测受试物是否影响DNA结构 体数目和形态的改变。通过检测受试物诱发体外培养的哺乳动物细胞染 或改变遗传信息的实验过程，从而判定受试物的遗 色体畸变能力，从而评价受试物的遗传毒性及其强度
数化合物在体内经过其代谢。
为何要制备S9 ？
为何要诱导制备S9 ？
一、Ames试验
一、Ames试验
4.[方法]
(1)掺入法： (2)点试法：
5.[结果评价]
报告的试验结果应是2次独立实验的重复结果。 判断是否是致突变物？
一、Ames试验
（1）掺入法： Rt/ Rc=诱发回变菌落数/自发回变菌落数 >2为阳性 (2)点试法：凡在滤纸周围长出一圈密集的回 变菌落，该药物即为致突变物质。 如在平皿上出现少数散在的自发菌落，则为 阴性
一、Ames试验
3.[试验设计]
决定药物最高剂量的标准是药物对细菌的毒性和
溶解度。 西药最大剂量可达5mg/皿，中药可超过5mg/皿 DMSO≤0.4 ml；乙醇≤0.1 ml 最低剂量0.2 μ g/ 皿. 至少5个不同剂量
每剂量间隔不差过5倍
每个剂量应做3个皿 可用水、二甲基亚砜(DMSO)或乙醇做溶剂
微核试验
[动物]
NIH小鼠，6只/组（雄性）或10只/组（雌雄各半）， 。
[给药剂量及途径]
高、中、低三个剂量；高剂量以LD50/2为基准；低 剂量应结合药效学及临床用量；一般单次给药。
[对照]
阴性（溶媒）对照；阳性（环磷酰胺）。
环磷酰胺不同途径给药对小鼠微核出现率的影响
剂量（mg/kg） 50 100 60 60 100 100 给药途径 腹腔注射 腹腔注射 皮下注射 肌内注射 肌内注射 经口给药 平均微核率（‰） 24.60 78.00 36.10 17.00 33.00 21.00
二、基因突变与染色体畸变
（一）基因突变 定义：组成一个染色体的一个或几个基因发生变 化，这种变化不能用光学显微镜直接观察到。
一、基因突变
（一）自发突变与诱发突变 自发突变--------在自然状态下基因结构发生的改变 ，与生物适应环境变化的进化有关
诱发突变--------在外界因素影响下所产生的基因结
>10%
>20%
＋
＋＋
>50%
＋＋＋
2 某一测试点呈现可重复的并有统计学意义的增加
三、微核试验
[原理]
骨髓细胞经致突变物作用，其染色体可发生畸变以致 断裂。其断裂的碎片在分裂间期留在子代细胞内形成规则 的一个或几个圆形或椭圆形结构的小块物质，由于它比普 通细胞核小，故称之为微核（micronucleus）。观察骨髓 细胞中的微核率，有助于检验药物是否具有致突变作用。 虽然骨髓和外周血各种有核细胞中均可见到微核，但 只有在无核的红细胞中才易辩认。在骨髓中无核红细胞有 嗜多染红细胞（晚幼红细胞）和成熟红细胞两种，正常情 况下，嗜多染红细胞占多数。由于毒性物质影响了骨髓红 细胞尤其是嗜多染红细胞，使二者比例失衡，故在骨髓涂 片中一般均在嗜多染红细胞中进行观察。