哺乳动物细胞中异位表达线粒体基因MT-ND3

哺乳动物细胞中异位表达线粒体基因MT-ND3
张长发，罗世明
【摘要】线粒体DNA(mitochondrial DNA, mtDNA)突变是导致线粒体疾病的重要因素，目前针对这一类疾病还没有有效的治疗方案。

在细胞质中表达线粒体基因称为线粒体基因的异位表达，被认为是一种潜在的治疗mtDNA疾病的方法，但并没有一种统一的信号肽能够将所有线粒体基因导入至线粒体中。

本研究探讨了利用异位表达将线粒体蛋白ND3定位至线粒体的可行性，主要发现：(1) 在无信号肽的情况下，ND3蛋白自身并不能定位至线粒体，而是定位在内质网上；(2) Rg9mtd1的信号肽可以将ND3蛋白成功导入线粒体中；
(3) 定位至线粒体的ND3蛋白对线粒体膜电位、活性氧的产生以及细胞增殖均无显著影响，但对线粒体基因的表达方式有调整作用。

以上结果表明，异位表达ND3质粒能正确表达和定位，并具有一定的功能性，这为MT-ND3异位表达治疗相关疾病提供了理论支持和技术方案。

【期刊名称】《青岛农业大学学报（自然科学版）》
【年(卷),期】2019(036)004
【总页数】8
【关键词】线粒体；MT-ND3；线粒体疾病；异位表达
基金项目：青岛农业大学高层次人才基金(6631113337)
线粒体复合体Ⅰ(NADH泛醌氧化还原酶)是细胞内最大的膜结合酶之一，其大部分嵌入于线粒体内膜中，部分突出于线粒体基质之中，通过利用NADH的还原电位来驱动质子穿过线粒体内膜，从而为哺乳动物线粒体中ATP的合成提供动力[1]。

复合体Ⅰ(Complex I, CⅠ)也是线粒体呼吸链(mitochondrial
respiratory chain, MRC)中最大的一个多蛋白酶复合物[2]，其至少含有45个多肽，其中有7个亚基(MT-ND1、ND2、ND3、ND4、ND5、ND6、ND4L)是由线粒体基因组所编码，并且均是CⅠ催化“核心”的一部分，而其余的至少38个亚基则由核基因组所编码，在CⅠ的组装、催化、稳定与调控中起到重要作用[3]。

因此相应的线粒体DNA(Mitochondrial DNA, mtDNA)或核DNA(Nuclear DNA, nDNA)的突变则会造成CⅠ功能的缺失，导致线粒体呼吸链紊乱，最终引发线粒体疾病。

线粒体疾病是由于编码呼吸链复合体蛋白的mtDNA或nDNA的缺陷引起的多样化的遗传性疾病[4]。

其中CⅠ缺陷最为常见，而且高达30%儿童的线粒体疾病是由CⅠ缺陷而引起的。

CⅠ缺陷引发的疾病在临床上可能存在各种症状与体征，从孤立性的肌病或肝病到致命性的多系统疾病[5]。

MT-ND3突变越来越被认为是造成CⅠ缺陷最常见的原因，其中MT-ND3的m.10191T>C突变可以导致Leigh综合征(Leigh syndrome，LS)，并伴有广泛的临床表现[6]。

而且MT-ND3突变(m. 10197G>A)也可以造成LS与肌张力障碍[7]，m.10158T>C(MT-ND3)突变则可以导致MELAS综合征(Mitochondrial encephalopathy, lactic acidosis, and stroke-like episodes)，同时还出现了持续癫痫的症状[8]。

人的MT-ND3的10398位核苷酸位点具有高度的多态性，m.10398A>G可能造成CⅠ效率降低，而且在阿尔茨海默病(Alzheimer’s)和帕金森病(Parkinson’s disease)等神经退行性疾病中存在m.10398A>G多态性,该突变也作为乳腺癌的风险因素而被研究[9]。

MT-ND3突变也会导致严重的婴儿线粒体脑病，甚至会造成婴儿死亡。

随着人们对线粒体疾病的不断重视与研究，越来越多新的MT-ND3突变被发现，而对相应mtDNA突变引发的
疾病病因与发病机制也有了更深入的理解。

尽管随着科学技术的进步获得基因诊断的能力正不断的提高，但是能够有效治疗线粒体疾病的方法却没有[10]。

目前，针对线粒体疾病的治疗主要是利用药物缓解相关症状，而无法真正治愈[11]。

考虑到线粒体疾病本质上是由于mtDNA突变所引起的，因此，基因治疗被认为是治疗线粒体疾病的有效途径。

其中利用核基因来异位表达(Allotopic expression)mtDNA编码的蛋白就是基因治疗策略之一，该策略是在细胞核中表达野生型的mtDNA蛋白编码基因，新合成的蛋白在信号肽的引导下进入线粒体中，将突变的蛋白进行替换[12]。

已经有研究表明，在患有Leber遗传性视神经病变的大鼠模型中，眼部注射含有人类ND4基因的重组腺相关病毒载体后，其视网膜神经节细胞变性得到了明显的预防[13]，这无疑为利用异位表达策略来治疗线粒体疾病提供了可能。

目前，只有仅限的几种mtDNA疾病通过利用异位表达策略来进行治疗研究，其中研究最多的是通过该策略对Leber遗传性视神经病变(MT-ND4突变)的治疗，而利用此策略对MT-ND3基因突变引起的线粒体疾病的治疗研究还未有报道。

因此，本研究在哺乳动物细胞中初步探讨了异位表达MT-ND3基因的可能性。

1 材料与方法
1.1 试验材料
Hela细胞(Sangon)、DMEM/F12(1:1)基础培养基(HyClone)、胎牛血清(PAN)、青链霉素(Sangon)、PBS (Sangon)、质粒mEmerald-Mito-7(Addgene)、质粒mCherry-Vimentin-N-18(Addgene)、质粒mEGFP- ER-5a(Addgene)、EcoRV(NEB)、BglII(NEB)、NheI(NEB)、Lipofectamine
3000 Transfection Reagent(Invitrogen)、2 × Phanta Max Master Mix (Vazyme)、ClonExpress II One Step Cloning Kit (Vazyme)、LB Agar Powder, Miller (Sangon)、Total RNA Extractor (Sangon)、AceQ qPCR SYBR Green Master Mix (Vazyme)、Rhodamine 123 (碧云天)、G418 sulfate (Sangon)、Trypsin-EDTA Solution (Sangon)、活性氧检测试剂盒(碧云天)、Hoechst 33342(碧云天)、TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix (TransGen)、Agarose (TransGen)、50X TAE Buffer (Sangon)、SanPrep 柱式质粒DNA 小量抽提试剂盒(Sangon)、SanPrep 柱式 PCR 产物纯化试剂盒(Sangon)、SanPrep 柱式 DNA 胶回收试剂盒(Sangon)等。

1.2 试验方法
1.2.1 细胞培养
用含10%胎牛血清与1%的青链霉素的DMEM/F12培养基于37 ℃培养箱(含5% CO2)正常培养Hela细胞，当细胞密度在90%左右时进行细胞传代，首先用1X PBS洗一遍细胞，用胰酶消化液对Hela细胞进行消化2～3 min，去除胰酶消化液并用含血清的培养基轻轻吹打培养皿底，使Hela细胞从皿底部脱落下来，于离心机1 200 r/min离心3 min，去除上清并用培养液重悬细胞沉淀，按60%密度接种细胞并培养。

1.2.2 质粒构建
质粒pla-mCherry的构建：以质粒mEmerald-Mito-7(Addgene, #54160)为模板进行PCR(F1，R1)，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳并将目的条带(4 821 bp) 进行切胶回收。

以mCherry-Vimentin-N-18(Addgene, #55158)为
模板进行PCR扩增(F2，R2)，将红色荧光蛋白(mCherry)序列扩增出来，将PCR产物进行切胶回收。

用重组试剂盒(ClonExpress II One Step Cloning Kit)将上述两种纯化的PCR产物进行重组，将重组产物用DH5α感受态细胞进行转化，并用含有卡那霉素的LB固体培养基进行平板接种，在37 ℃生化培养箱中培养12～16 h，最后挑菌测序鉴定。

质粒pla-R1-mCherry的构建：基因片段Rg9mtd1 (105 bp) 在生工生物公司合成，并用引物(F3，R3)对Rg9mtd1核酸序列PCR扩增，将PCR产物进行产物纯化。

用NheI与BglII对质粒pla-mCherry进行双酶切，并对酶切产物进行胶回收。

用重组试剂盒将上述产物进行重组，后续步骤同上。

质粒pla-R1-ND3与pla-ND3-mCherry的构建：用EcoRV对质粒pla-R1-mCherry进行单酶切并纯化。

用通用密码子优化过的MT-ND3(348 bp)核酸序列在生工生物公司合成，并用引物(F4，R4)对MT-ND3核酸序列进行PCR 扩增与纯化，将酶切载体(pla-R1-mCherry)与MT-ND3基因片段重组获得质粒pla-R1-ND3。

用BglII对质粒pla-mCherry进行酶切并纯化，用引物(F5，R5)对MT-ND3核酸序列进行PCR扩增与纯化，将酶切载体(pla-mCherry)与MT-ND3基因片段进行重组获得质粒pla-ND3-mCherry。

1.2.3 稳转细胞系筛选
利用转染试剂Lipofectamine 3000 Transfection Reagent将质粒pla-R1-ND3转入Hela细胞内，转染24 h后将细胞培养液更换成含有G418的细胞培养液(不含青链霉素)并及时更换液培养，培养约12 d左右(当在荧光显微镜下观察到大部分细胞死亡，绝大多数存活的细胞都含红色荧光时)，再将培养液更换至正常培养液继续培养，当含有红色荧光的细胞形成足够大的细胞克隆时，
挑取细胞克隆吹散培养。

用上述方法本实验共筛选了两株稳转细胞系(R1-ND3与Mito-GFP)，其中R1-ND3细胞系自带红色荧光。

Mito-GFP细胞系是用质粒mEmerald-Mito-7转染Hela细胞而筛选出来的自带绿色荧光的稳转细胞系，并且绿色荧光能够定位于线粒体上。

1.2.4 线粒体膜电位、ROS水平及细胞增殖情况的测定
将稳转细胞系R1-ND3细胞与正常Hela细胞等比例混合，将细胞混合液按20%～30%的细胞密度传于8孔腔室盖玻片中，在37 ℃培养箱(含5%的CO2)中培养，直至有克隆细胞团长出。

用染料Rhodamine 123与活性氧检测试剂盒分别对各腔室中的混合细胞克隆团进行孵育，最后用共聚焦显微镜进行活细胞观察，检测R1-ND3细胞与正常Hela细胞的线粒体膜电位与ROS水平。

用染料Hoechst 33342对8孔腔室中的混合细胞克隆团进行孵育，在荧光显微镜下进行观察，根据R1-ND3细胞与正常Hela细胞的单细胞克隆团中的细胞核数目对克隆细胞团进行计数，最后用SPSS统计软件对数据进行统计分析。

1.2.5 荧光定量PCR(qPCR)
细胞样品的总RNA用Trizol法(Total RNA Extractor)来进行提取，并用反转录试剂盒(TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix)来进行第一链cDNA的合成，随后用AceQ qPCR SYBR Green Master Mix 来进行qPCR检测各目的基因(MT-ND5, MT-ATP6, MT-CO1, MT-CYB, ACTB)的相对表达情况。

其中各组实验进行3次重复，用比较CT法来进行目的基因的相对定量分析，最后用SPSS统计软件对数据进行统计分析。

2 结果与分析
2.1 异位表达的ND3蛋白定位于内质网
为了在Hela细胞中验证在无信号肽引导的情况下异位表达的ND3蛋白的定位情况，我们构建了重组质粒pla-ND3-mCherry，将MT-ND3基因序列通过一小段核苷酸序列(linker)与mcherry基因序列连接起来(图1 A)，在活细胞中观察ND3蛋白表达与定位情况。

在用质粒pla-ND3-mCherry转染Mito-GFP 稳转细胞系(Mito)24 h后，发现没有信号肽引导的ND3蛋白并不能成功定位于线粒体(图1 B)，我们进一步验证ND3蛋白的定位情况，将质粒pla-ND3-mCherry与质粒mEGFP-ER-5a(ER)共转染Hela细胞24 h后，发现绝大多数的ND3蛋白成功定位到了内质网上(图1 C)。

2.2 信号肽Rg9mtd1可以引导ND3蛋白成功定位于线粒体
为了能够让ND3蛋白成功定位到线粒体上，我们筛选出了一条由35个氨基酸组成的线粒体靶向序列(Mitochondrial target sequence, MTS)，该靶向序列(R1-MTS)由基因Rg9mtd1所编码，因此构建了重组质粒pla-R1-mCherry，将质粒pla-R1-mCherry转染Mito-GFP稳转细胞系24 h后，发现R1-MTS 可以引导着红色荧光蛋白定位于线粒体中(图2 B)，对线粒体形态没有影响。

随后又构建了质粒pla-R1-ND3，通过linker的DNA序列将MTS的DNA序列、mCherry的DNA序列与MT-ND3的DNA序列连在一起(图2 A)。

将质粒pla-R1-ND3转染Mito-GFP稳转细胞系24 h后，发现R1-MTS可以成功将ND3蛋白定位于线粒体上(图2 C)，并且线粒体形态正常。

2.3 基因MT-ND3的异位表达没有改变线粒体膜电位及细胞内ROS水平
由于在Hela细胞内基因MT-ND3的异位表达对线粒体的形态没有明显影响，因此我们对R1-ND3稳转细胞系进行了线粒体膜电位的检测，结果表明：相较于正常Hela细胞的线粒体膜电位，R1-ND3稳转细胞系的线粒体膜电位没有
显著差异(图3 A, 3 C)。

我们又对R1-ND3稳转细胞内的ROS水平进行了检测，结果发现与正常Hela细胞相比，其细胞内的ROS水平差异也不显著(图3 B, 3 D)。

而且我们对培养5 d的R1-ND3稳转细胞与Hela细胞的单克隆细胞团进行了细胞数检测，结果发现这两种细胞的单克隆细胞团的细胞数目没有显著性差异(图4)，表明两种细胞的增值速度基本相同。

2.4 基因MT-ND3的异位表达对其他mtDNA蛋白编码基因表达的影响
为了验证在Hela细胞中基因MT-ND3的异位表达是否对其他mtDNA蛋白编码基因的表达有影响，分别挑选了一个编码线粒体呼吸链不同复合体亚基的mtDNA蛋白编码基因(MT-ND5, CO1, ATP6, CYB)来进行检测。

结果表明：与正常Hela组相比，在R1-ND3稳转细胞内基因MT-ND5的表达水平显著降低(图5 A)，而基因MT-ATP6 与MT-CYB的表达水平则显著升高(图5 B, D)，基因MT-CO1在R1-ND3稳转细胞内的表达水平与在正常Hela细胞内的表达水平相似，差异不显著(图5 C)。

3 讨论
线粒体C I的亚基是由mtDNA与nDNA同时编码的，而其绝大多数的亚基由nDNA所编码，所以组成C I的大部分蛋白质需要在其氨基末端前的线粒体靶向序列(MTS)的引导下由细胞质导入线粒体中[2]，或者在不同内部靶向信号的引导下进入线粒体[14]。

因此在没有定位于线粒体信号肽的引导下，蛋白很难被导入线粒体中，所以在本试验中单纯的在细胞质内表达的ND3蛋白并不能成功定位于线粒体中，而是定位在了内质网中。

在对mtDNA蛋白编码基因进行异位表达时，除了用通用密码子来对相应的线粒体基因进行优化外，最重要的是找到合适的MTS来将相应的蛋白正确导入到线粒体中[15]。

在本试验中，
我们成功利用Rg9mtd1的信号肽将ND3蛋白成功导入线粒体中。

本研究在细胞核内稳定表达基因MT-ND3并没有引起线粒体形态的明显变化，这意味着Rg9mtd1将蛋白ND3导入线粒体中并没有引起线粒体内能量代谢的异常，因为线粒体功能状态的改变往往与其外部形态改变同时发生[16]，虽然线粒体形态变化与其功能状态相关的代谢信号还未能研究明确[17]，但是越来越多的研究指出线粒体形态变化与生物能学的改变紧密相关。

这也与我们后续的试验结果相印证，即MT-ND3的异位表达并没有对细胞内ROS水平、线粒体膜电位以及细胞的增殖速度产生明显的影响，这说明我们对于基因MT-ND3的异位表达策略是成功的。

在基因MT-ND3异位表达的细胞中发现基因MT-ND5的mRNA表达量降低，我们猜测这可能是由于异位表达的ND3蛋白与线粒体C I的相应蛋白的频繁更换有关；而基因MT-ATP6与MT-CYB的mRNA表达量升高可能是nDNA调控的结果。

正如在ATP6合成缺陷的细胞中异位表达基因ATP6可以增加ATP的合成，但并不清楚异位表达基因ATP6是否会对细胞产生意想不到的影响一样[18]，造成mtDNA蛋白编码基因表达变化的原因还需进一步研究。

尽管对于大多数线粒体基因的异位表达极具挑战性，但是已经有研究表明，通过优化异位表达方法可促进LHON成纤维细胞中线粒体复合体I活性的恢复与线粒体整体功能的改善[19]。

而且在LHON的大鼠模型中异位表达优化的线粒体基因ND4能够有效缓解视觉功能的下降，这也为因其他mtDNA突变造成的破坏性线粒体疾病的临床研究开辟了道路[20]。

我们的研究结果对线粒体基因的异位表达策略提供了一定的理论基础，将有助于利用异位表达治疗MT-ND3突变的相关线粒体疾病。

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