磁性微球固定化酶工艺研究进展

磁性微球固定化酶工艺研究进展
卢燕燕;王宝维
【摘要】磁性微球固定化酶就是利用磁性微体作为裁体进行酶的固定化,由于其具有环保、酶重复利用效果好和降低生产成本等优点,近几年已经成为研究的焦点.本文重点对磁性微球固定化酶制备工艺的研究现状、应用及发展前景进行阐述,为同行们今后开展研究提供参考.
【期刊名称】《肉类研究》
【年(卷),期】2010(000)005
【总页数】5页(P78-82)
【关键词】磁性微球载体;固定化酶;制备工艺
【作者】卢燕燕;王宝维
【作者单位】青岛农业大学,食品科学与工程学院,山东,青岛,266109;青岛农业大学,食品科学与工程学院,山东,青岛,266109
【正文语种】中文
【中图分类】TS201.2
酶参与体内各种代谢反应，而且反应后其数量和性质不发生变换。

作为一种生物催化剂，酶可以在常温常压等温和条件下高效地催化反应，一些难以进行的化学反应在酶的催化作用下也可顺利地进行反应，而且反应底物专一性强、副反应少等优点大大促进了人们对酶的应用和酶技术的研究。

但在实际应用中，酶对环境敏感、反应后难以回收等缺点限制了酶制剂产品的开发和应用，在这种情况下，固定化酶应
运而生[1]。

所谓酶的固定化是指利用化学或物理手段将游离的酶定位于限定的空间区域并使其保持活性和可反复使用的一种基本技术[2]。

在理论及实际应用上，酶固定化技术
克服了游离酶的许多缺点，但是固定化酶技术目前还存在固定效率低、载体的有毒性、成本高、稳定性差、不能大规模生产等问题，这些都限制了固定化酶技术的发展与应用。

在固定化酶技术中，载体材料的结构和性能对酶的活性保持及应用至关重要，因此对固定化酶载体的研究成为该领域研究的热点。

本文主要从其中的一种新型载体——磁性高分子微球的特点出发，就磁性微球固
定化酶工艺的研究现状、应用及前景进行综述，为新型载体的选择提供理论依据，以期随着生物技术及材料、化工等各相关学科的不断发展，固定化酶的工作会有新的突破。

功能团的微球[3，4]。

磁性高分子微球具备良好的磁效应、含有多种活性功能基团、良好的生物兼容性以及良好的表面效应和体积效应等特点，当作为固定化酶载体，也有其独特的优点，可以用来弥补传统方法的不足：
①可以很好地保持它的活性和稳定性，通过磁分离使得体系中酶的回收更加方便，提高了酶的稳定性及使用效率；
②提高酶的生物相容性和免疫活性，并且对于双酶反应体系来说，当一种酶的失活较快时，就可以用磁性材料来固载另一种酶，回收后反复使用，降低成本；
③磁性载体固定化酶放入磁场稳定的流动床反应器中，可以减少反应体系的操作，适合大规模连续化生产。

④利用外部磁场可以控制磁性材料固定酶的运动方式和方向，替代传统的械搅拌，操作简便，可降低成本，还可以提高固定化酶的催化效率。

磁性微球固定化酶是将游离酶的催化活动完全或基本上限制在一定空间范围内的过程，基本原理为：将该磁性微球直接放入含有一定量酶的混合溶液中，使酶与微球
表面活性基团充分交联。

固定化反应结束后，利用外部磁场对其进行分离，然后再进行纯化，其方法可分为物理吸附法、交联法和共价偶合法[5]。

2.1 物理吸附法
通过氢键、电子亲和力等把酶固定在磁性微球表面的方法称为物理吸附法。

此法制备固定化酶，操作简便，条件温和，酶活力部位及其空间构象不易被破坏，但酶以离子键、氢键、偶极键及疏水健吸附在载体上，存在易失活和易脱落等缺点。

Guo(2004)等[6]通过物理吸附法将脂肪酶CCL固定Fe3O4/(DVB-VA)磁性微球上，并研究了该固定化脂肪酶在各种反应体系下的催化酯化反应，结果表明固定化脂肪酶显示了较强的活性和优良的重复利用性。

D Qi(2008)等[7]以包被Fe3O4/SiO2复合纳米磁球为核，使用硅烷偶联剂GLYMO制备了磁性微球，并对胰蛋白酶进行了固定化研究，结果表明：酶蛋白载量最大为188mg/g，与以前的磁性载体相比有较大程度的提高，并且在微辐射波的作用下，蛋白质能较快的消化。

2.2 交联法
交联法是用双官能团试剂或多官能团试剂与游离酶的氨基酸残基交联，使酶分子和官能团之间形成共价键，制得三向的交联网状结构。

除了酶分子之间发生交联外，还存在一定的分子内交联。

常用的交联剂有戊二醛、双重氮联苯胺-2，2-二磺酸
和环氧氯丙烷等，其中应用最广泛的是戊二醛。

用交联法制备的固定化酶结合牢固，可长时间使用。

但是交联反应较激烈，酶活可能损失较大。

实际上交联法往往与其他固定化方法联合使用，这种采用两种或多种方法进行固定化的技术，称为双重或多重固定化法，用此法制备的固定化酶活性高，机械强度好。

Peniche (2005)等[8]以超顺磁性脱乙酰壳聚糖微球为载体，用戊二醛交联法固定
酪氨酸酶，结果表明，用此方法制得固定化酶的活性回收率可达70%。

Ma(2005)等[9]用改进的悬浮聚合法制备了表面含环氧基的磁性聚合微球，该微球
在高温下可在氨水溶液中发生开环反应，从而制得了表面含羟基和氨基的磁性微球，然后与戊二醛进行交联，再共价结合蛋白酶。

Zeng(2006)等[10]利用单体硅酸四乙酯与氨丙基三甲硅烷在磁性微粒表面的共聚
反应，制得了MS-type树脂，再分别用吸附法和戊二醛交联法固定脂肪酶PPL，并对其理化性质进行了对比，结果表明，利用交联法固定脂肪酶PPL的各种理化
性质最为理想。

陈姗姗(2007)等[11]以阴离子交换树脂为载体，戊二醛为交联剂，对果胶酶进行先吸附后交联的固定化，结果表明，最佳固定化条件为：温度40℃，pH 5.5，固定化6h，加酶量0.75mL/g树脂(浓度为1%酶液)，戊二醛交联浓度0.1%，交联温
度4℃，交联时间4h，酶学特性研究表明，固定化果胶酶在最适温度60℃，最适pH4.0下具有较好的操作稳定性。

李鸿玉(2008)等[12]以壳聚糖复合Fe3O4为载体，采用吸附-交联法固定化果胶酶，结果表明，结果表明，脱乙酰度为95%、分子量为20万的壳聚糖浓度为3%、
Fe3O4的加量与壳聚糖质量比为1∶3、戊二醛浓度为3%、酶加量为0.3ml时，
固定化果胶酶活力最高，其酶活保存率为79%。

杨婉身(2008)等[13]以包被Fe3O4/SiO2复合纳米磁球为核，使用硅烷化试剂(APTES)制备了氨基磁性微球，结果表明，其粒径大小约为40nm，饱和磁化强度50emu/g，具有超顺磁性；粒子表面富含氨基，并将此微球进行了葡聚糖内切酶
和木瓜蛋白酶的固定化，其酶学性质和动力学参数都有改观。

Toru Mizuki (2010) 等[14]将α-淀粉酶固定在超顺磁性离子的表面，并探讨了旋
转磁场对酶活性的影响，结果表明，在旋转磁场中，固定化酶的活性有一定的增加，并且在适当的频率下，酶的活性能达到最高值。

2.3 共价偶联法
共价偶联法是磁性微球表面活性功能基团通过共价键与酶的活性侧键基团偶联的方
法，该方法有利于保持酶的活性，而且磁响应性较强，但载体的活化操作比较复杂。

Huang(2003)等[15]在过量的氨水溶液中，利用共沉淀法制备了表面含氨基的磁
性纳米颗粒，然后将酶分子中的羧基经碳二亚胺活化后，与颗粒表面的氨基连接形成酰胺键，从而得到了磁性颗粒固定化脂肪酶。

与游离酶相比，该固定化脂肪酶的活性提高了0.4倍，稳定性增加了30倍。

Lei(2004)等[16]将表面含羧基的磁性高分子微球经亚硫酰氯活化后，在其表面形
成酰氯基，该基团可以很容易地与酶分子中的氨基结合形成肽键，从而制得磁性微球固定化酶。

Qiu(2005)等[17]以Fe3O4颗粒和邻苯二甲酸钠的混合物作为种子，利用种子乳
液聚合法制备了表面含酸酐基的具有荧光性的磁性高分子微球，酸酐基化的磁性微球由于其表面酸酐基非常活泼，可以不需连接剂活化而可直接与酶通过酰胺键交联，该方法具有操作方便和成本低廉的优点。

Yang(2006)等[18]以聚乙烯醇为稳定剂，以异丁烯酸脱水甘油酯、苯乙烯和乙二
醇二甲基丙烯酸为单体，通过喷淋悬浮聚合法，制得了表面富含羟基和环氧基的磁性聚合微球。

由于酶表面的亲核基团(如-NH2)易与环氧基发生开环反应，因此该
微球可用于共价结合酶。

Deniz(2006)等[19]先制备了表面含酯基的Fe3O4/ PHEMA微球，通过聚已丙啶
活化，使其表面的酯基转化为亚氨基，然后再与Cu2+螯合，利用铜的剩余配位基与酶表面的氨基螯合来固定化酶。

Y Li (2007) 等[20]制备一种纳米磁性微粒，并用共价结合法对胰蛋白酶进行了固
定化，对其消化蛋白质的速率进行了研究，结果表明，磁性固定化胰蛋白酶在消化过程中容易操作，并且消化时间有明显减少。

W Xie (2010) 等[21]以EDAC作为活化剂，用共价结合法进行果胶酶的磁性固定化，并用于催化植物油产生脂肪酸的反应，结果表明，固定化酶比与游离酶相比，
具有更广泛的温度和pH适用范围，并且酶用量明显减少。

Y Yong (2008)等[22]用悬浮聚合法制备磁性微粒，并借助甲氧基对假丝酵母脂肪酶进行了固定化，研究表明：固定化酶与游离酶相比具有更广泛的pH适用范围、可循环使用性和贮藏稳定性。

L Lei (2009) 等[23]用悬浮聚合法制备磁性微球，并通过共价法进行猪胰脂肪酶的固定，结果表明，与游离酶相比，固定化酶具有更广泛的pH、温度适用范围，并且具有更好的操作稳定性。

刘瑶(2009)等[24]以木瓜蛋白酶为模拟生物蛋白分子，利用共价结合法固定化木瓜蛋白酶，通过对比溶液酶和固定化酶的酶学性质，结果表明大小两种粒径的磁性微球固定化酶后，酶蛋白载量分别为21.3mg/g和23.5mg/g，表观米氏常数Kmapp分别为0.16mg/ mL和0.12mg/mL，磁性固定化酶的最适温度、热稳定性和贮存稳定性等都明显优于溶液酶，溶液酶经固定化后可连续重复使用提高利用效率，稳定性得到提高。

陈文颖(2009)等[25]用将无机磁性粒子Fe3O4与有机材料海藻酸钠结合起来制成一种复合的磁性微粒，并将其进行表面修饰，通过化学共价法来固定青霉素G酰化酶，重复催化研究结果表明，固定化酶具有比游离酶更广泛的温度及pH值适用范围，并且具有良好的热稳定性、可循环使用性和贮存稳定性。

3.1 磁性微球固定化酶在化工生产上的应用
磁性微球固定化酶可催化多种化学反应，在化工过程中具有显著的优点，可以提高对应选择性及重复利用率。

例如，Guo(2004)等[26]用磁性微球固定化脂肪酶CCL 催化水解橄榄油，研究发现该固定化脂肪酶具有一定的催化活性；Bai(2006)等[27]以超顺磁性颗粒Fe3O4作为载体，经碳二亚胺活化共价结合脂肪酶CRL，并研究此固定化脂肪酶催化酯化拆分外消旋薄荷醇的反应，实验证实固定化脂肪酶具有较高的对映选择性和良好的重复利用性。

并且在皮革的生产过程中采用磁性固定化酶
技术，在酶处理达到预期目的之后，可以将其中的酶完全回收，这样不仅提高了经济效益，而且有利于皮革产品质量的控制。

3.2 磁性微球固定化酶在食品工业上的应用
由于固定化酶具有较好的稳定性，磁性微球固定化酶技术在食品、发酵工业、淀粉糖工业和乳制品工业方面具有好的应用前景。

例如，Qiu(2005)等[28]采用粒径为0.08-0.8μm的Fe3O4/P(St-MA)微球为载体，用共价偶联法固定α-淀粉酶，并
用其催化淀粉转化为葡萄糖，研究结果表明，固定化淀粉酶的总活力达113800U，最高固载量为544.3mg/g，活性回收率为47.2%，与游离酶相比该固定化酶具有较高的稳定性。

3.3 磁性微球固定化酶在环保方面上的应用
随环境污染的日趋严重及其治理的日益迫切，磁性微球固定化酶在环境科学领域也将具有重要用途。

Arica(2000)等[29]对Fe3O4/P(MMA)微球固定化葡萄糖淀粉酶处理淀粉废水和造纸废水的催化处理效果进行了研究，探讨了反应时间和酶活力对反应的影响，结果显示固定化酶处理废水具有较大的优越性。

用磁性微球作为固定化酶载体是固定化载体材料发展的必然趋势。

作为一种新型载体，磁性高分子微球具有良好的应用前景，它受到了各国学者的高度重视，得到了广泛的研究。

由于目前应用于固定化酶载体的材料各有优缺点，如天然高分子材料作为载体材料时具有无毒性、传质性能好等优点，但材料强度较低；合成有机高分子材料在作为载体材料时具有很强的灵活性，但传质性能较差；无机材料稳定性好、机械强度高、成本低，但用于固定化酶时，固定化率均比较低。

与这些固定化材料相比，磁性微球具有在分离上的巨大优势，易回收、操作简便、成本较低，从经济效益方面来讲，磁性微球载体是工业化生产的最优选择。

但是，对于磁性微球固定化酶的研究，现在仍处于起步阶段，对磁性微球固定化酶的基础理论研究仍略显不足。

如磁性高分子微球和磁性微球固定化酶的形成机理、
磁性高分子微球的磁性起源、结构和性能的关系等，因此限制了磁性微球固定化酶的工业应用[30]。

因此在以下方面有待进一步探索：一是完善不同结构的磁性高分子微球的形成机理，如制备方法和反应参数间的关系等；二是探讨磁性高分子微球的磁性起源、结构和性能的关系；无机物间、无机物与聚合物间的磁相互作用；三是深入研究磁性高分子微球的物理性质，尤其是磁性能；四是探索针对不同类型的酶，选用什么磁性载体、哪种固定化方法效果最好。

由此可见，更深入地研究磁性微球固定化酶的基础理论及尽快使已取得的成果由实验阶段进入应用阶段，将成为今后磁性微球固定化酶研究的重点。

【相关文献】
[1] 毛跟年,李丽维,齐凤．固定化酶应用研究进展[J]．中国酿造．2009(8):17-19．
[2] 高振红,田利岳．磁性壳聚糖复合微球固定化果胶酶及反应动力学研究[D],陕西：西北农林科技大学,2007．
[3] 漆红兰．磁性微粒的制备方法和研究进展[J]．生命的化学,2002,22:586-589．
[4] 徐辉,张国亮,张凤宝．免疫磁性微球的研究进展[J]．化学工业与工程,2003,20:27-32．
[5] 马宁,谢文磊．磁性高分子微球固定化酶的制备及应用[J]．现代化工,2007,6(7):364-369．
[6] Guo Z, Sun Y． Characteristics of immobilized lipase on hydrophobic superparamagnetic microspheres to catalyze esterification[J]． Biotechnol Prog, 2004, 20: 500-506．
[7] Dawei Qi et al, Development of Core-shell Magnetic Mesoporous SiO2 Microspheres for the Immobilization of Trypsin for Fast Protein Digestion[J], Journal of Proteomics & Bioinformatics, 2008, (7):346-358．
[8] Peniche H, Osorio A, Acosta N, et al． Preparation and characterization of superparamagnetic chitosan microspheres: Application as a support for the immobilization of tyrosinase[J]． J Appl Polym Sci, 2005, 98:651-657．
[9] Ma Z Y, Guan Y P, Liu X Q, et al． Covalent immobilization of albumin on micron-sized magnetic poly (methyl methacrylate-divinylbenzene-glycidyl methacrylate) microspheres prepared by modified suspension polymerization[J]． Polym Adv Technol, 2005, 16: 554-558．
[10] Li Z, Luo K K, Gong Y F． Preparation and characterization of dendritic composite magnetic particles as a novel enzyme immobilization carrier [J]．J Mol Catal B: Enzym,
2006, 38: 24-30．
[11]陈姗姗,仇农学．阴离子交换树脂固定化果胶酶及其酶学性质的研究[J]．广西农业生物科
学,2007(26),4:339-343．
[12] 李鸿玉,厉重先,李祖明．磁性壳聚糖微球固定化果胶酶的研究[J]．食品科学． 2008(9):399-403．
[13] 杨婉身,杨可可．硅烷化氨基磁性微球的制备及其固定化酶应用研究[D]．四川：四川农业大学,2008．
[14] Toru Mizuki, Noriyuki Watanabe, Yutaka Nagaoka, Tadamasa Fukushima． Activity of an enzyme immobilized on superparamagnetic particles in a rotational magnetic
field[J]． Biochemical and Biophysical Research Communications, 2010,393(4):779-782．[15] Li X H, Sun Z H． Synthesis of magnrtic polymermicrospheres and application for immobilization of proteinase[J]． J Appl Polym Sci, 1999, 58: 1991-1997．
[16] Lei H, Wang W, Chen L L, et al． The preparation and catalytically active characterization of papain immobilized on magnetic composite microspheres[J]．Enzyme Microb Techno, 2004, 35:15-21．
[17] Qiu G M． Novel fluorescent magnetic polysaccharidebased microsphere for orientation tracing and anticoagulation: Preparation and
characterization[J]．Biomacromolecules, 2005 (6): 1041-1047．
[18] Yang C L, Guan Y P, Xing J M, et al． Synthesis and protein immobilization of monodisperse magnetic spheres with multifunctional groups[J]． React Funct Polym, 2006, 66:267-273．
[19] Deniz T, Handan Y, Adil D． Synthesis of tentacle type magnetic beads as immobilized metal chelate affinity support for cytochrome c adsorption[J]． Int J Biol Macro, 2006, 38: 126-133．
[20] Yan Li, Xiuqing Xu, Chunhui Deng, Pengyuan Yang, and Xiangmin Zhang Immobilization of Trypsin on Superparamagnetic Nanoparticles for Rapid and Effective Proteolysis[J]． J． Proteome Res, 2007, 6 (9): 3849-3855．
[21] W Xie, N Ma． Enzymatic transesterification of soybean oil by using immobilized lipase on magnetic nano-particles[J]． Biomass and Bioenergy, 2010．
[22] Yang Yong, Yong-Xiao Bai, Yan-Feng Li．Characterization of Candida rugosa lipas immobilized onto magnetic microspheres with hydrophilicity[J]．Process Biochemistry, 2008,43(11): 1179-1185 ．
[23] Lin Lei, Yongxiao Ba, Yanfeng Liet al． Study on immobilization of lipase onto magnetic microspheres with epoxy groups[J]． Journal of Magnetism and Magnetic Materials, 2009,321(4): 252-258 ．
[24] 刘瑶,韩德艳,张海丽．葡聚糖磁性微球的制备及固定化木瓜蛋白酶的研究[D]．湖北:华中师范大学,2007,5．
[25] 陈文颖,赵敏,韩旭等．磁性微粒对青霉素G酰化酶的固定化研究[J]．化学工程,2009,7(8): 39-42．
[26] Guo Z, Sun Y． Characteristics of immobilized lipase on hydrophobic superparamagnetic microspheres to catalyze esterification[J]． Biotech Prog, 2004,20:500-506．
[27] Bai S, Guo Z, Liu W, et al． Resolution of (+)-menthol by immobilized Candida rugosa． lipase on superparamagnetic nanoparticles[J]． Food Chem, 2006, 96: 1-7．[28] Qiu G M, Zhu B K, Xu Y Y．α-Amylase immobilized by Fe3O4 /poly(styreneco-maleic anhydride) magnetic composite microspheres: Preparation and charaterization[J]． J Appl Polym Sci, 2005, 95: 328-335．
[29] Arica M Y, Han dan Y, Süleyman P, et al．Immobilization of glucoamylase onto spacerarm attached magnetic poly (methylmethacrylate) microspheres: Characterization and application to a continuous flow reactor[J]． J Molec Catal B: Enzym, 2000, 11: 127-138．
[30] 李黎,马力,李鹤．磁性微球研究进展及其在固定化酶中的应用[J]．现代食品科技,2007(11):94-98．。