中华鳖裙边胶原蛋白的提取及其特征_陆剑锋
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第 34 卷第 6 期 2010 年 6 月
水
产
学
报
JOURNAL OF FISHERIES OF CHINA
Vol. 34 ，No. 6 June， 2010
文章编号： 1000 － 0615 （ 2010 ） 06 － 0981 － 08
DOI： 10. 3724 / SP. J. 1231. 2010. 06800
馏水反复洗涤， 充分沥干后备用。 1. 6 裙边胶原蛋白的提取 胃蛋白酶只对胶原蛋白的非螺旋区域起作 用， 对螺旋区不进行水解， 采用胃蛋白酶制备胶原 蛋白是目前应用效果比较好的一种方法
［ 11 ］Biblioteka 。由11. 1
材料与方法
实验材料 中华鳖购于合肥马鞍山路周谷堆农贸批发市
需在酸性环境下 于胃蛋白酶的最适 pH 为 2 ～ 3 ， ， 1% 柠檬酸作为酶解 才能提取 因此本实验采用 它除了有助于提取酸溶性胶原外 ， 还可 提取介质， 使裙边变得更加溶胀 （ 或使其结构更加蓬松 ） ， 更 有利于蛋白酶的水解提取。本实验考察了酶添加 底物浓度、 酶解时间对胶原蛋白提取的影响 量、 （ 测定水解液中羟脯氨酸含量， 以羟脯氨酸含量 较高为好 ） ， 并在单因素的基础进行正交优化实 进一步确定了裙边胶原蛋白最佳提取工艺 。 验， 1. 7 提取液中裙边胶原蛋白含量的测定 羟脯胺酸是胶原蛋白中一种特征氨基酸， 在 它是由相应的脯氨酸残 其它蛋白质中含量较少， 基经羟基化反应生成的， 因此通过羟脯氨酸的测 定可确定胶原蛋白的含量
［ 13 ］
电泳系统对纯化的胶原蛋白
6期
陆剑锋， 等： 中华鳖裙边胶原蛋白的提取及其特征
983
PAGE 垂直电泳（ DYY11 型电 样品溶液进行 SDS北京市六一仪器厂 ） 。分离胶浓度为 10% ， 泳仪， 200 V 电泳 30 min， 浓缩胶浓度为4% ， 用考马司 250 染色液 （ 考马斯亮蓝 R250 0. 5 g， 甲 亮蓝 R醇 225 mL， 蒸馏水 225 mL， 冰醋酸 50 mL） 染色 15 min， 脱色液（ 甲醇 100 mL， 冰醋酸 100 mL， 蒸馏水 800 mL） 脱色并拍照。 1. 11 裙边胶原蛋白的氨基酸（ AA） 测定 称取冷冻干燥后的纯化样品 1 mg 放入安瓿 瓶中， 加 2 mL 6 mol / L HCl（ 色氨酸测定采用 KOH 水解） ， 并充入少量氮气， 在酒精喷灯下迅速封管 后置于 110 ℃ 烘箱中水解 24 h。水解结束冷却后 移至坩埚， 在 70 ℃ 水浴锅中挥发剩余盐酸， 再加 入少量双蒸水蒸干， 重复 3 次， 用适量 pH 2. 20 的 缓冲液溶解后定容， 最后用 0. 22 μm 微孔滤膜抽 滤， 滤 液 采 用 氨 基 酸 全 自 动 分 析 仪 （ HITACH L8800 ， 日本 HITACH 公司） 进行测定。 1. 12 胶原蛋白的热变性温度测定
［ 14 ］ 样品制备参照 Kittiphattanabawon 等 的 方 法。将冷冻干燥后的纯化样品用 50 mmol / L 的乙
表 1 中华鳖的基本营养成分（ 以湿基计） Tab. 1 Content of basic nutrition in Pelodiscus 珚 sinensis（ on wet basis） X ± SD
收稿日期： 2010 01 14 修回日期： 2010 03 23
060110 ） 资助项目： 安徽省重大科技攻关项目（ 08010301078 ） ； 合肥工业大学学生创新基金资助项目（ 113Email： lujf@ sibs. ac. cn 通讯作者： 陆剑锋，
982
水
产
学
报
34 卷
技术等加工处理， 将有助于找到一些具有独特生理 。 功能的活性肽 本实验通过生物酶法研究中华鳖 纯化条件， 并分析了裙边胶 裙边胶原蛋白的提取、 原蛋白的基本特征， 旨在为今后进一步综合开发利 用有关鳖类的裙边胶原多肽提供科学的理论依据。
胶原（ collagen ） 是细胞外基质的一种结构蛋 白质， 它含有一个或几个由 α － 链组成的三螺旋 ［ 1］ 结构的区域， 即胶原域 。 胶原具有保护机体和 支撑器官的作用， 主要存在于动物肌腱、 韧带、 软 血管壁、 皮肤及结缔组织中， 占哺乳动物体内 骨、 ［ 2］ 蛋白质总量的 25% ～ 30% 。 胶原蛋白及其水 解得到的多肽产物不仅具有良好的消化吸收特 ［ 3 － 4］ ， 而且还具有许多重要的生理活性功能 在 性， 生物制药 （ 或医学 ） 、 医疗保健、 食品工业、 皮革产 业、 感光材料、 美容化妆品行业等方面都已得到广 泛应用。 长期以来， 工业胶原蛋白的来源仅限于猪、 牛 等陆 生 动 物， 但 随 着 疯 牛 病 （ bovine spongiform andmouth encephalopathy，BSE ） 、口 蹄 疫 （ footdisease， FMD ） 、 AI ） 及 其 禽流感 （ avian Influenza， （ zoonosis ） 的爆发和盛行， 人们 它一些人畜共患病 逐渐对牲畜等胶原制品的安全性产生了质疑 。 此 习惯等原因， 有些地区也不能使用来 外由于宗教、
。 吸取 0. 5 mL 裙边
加入 1 mL 6 mol / 胶原蛋白粗提液放入安瓿瓶中， L 的 HCl， 在酒精喷灯上迅速封管， 置于 130 ℃ 的 水 解 后 的 液 体 经 稀 释 后， 移入 烘箱中水 解 3 h， 100 mL 容量瓶中定容。 取 4 mL 滤液， 按羟脯氨 酸标准曲线法（ GB 9695 23 － 1990 ） 测定水解液中 的羟脯氨酸含量。 1. 8 裙边胶原蛋白的纯化 用最优方案提取胶原蛋白， 溶出物经过滤后 4 ℃ 冷冻离心 20 min， 倾出上清 以 6 000 r / min、 4 ℃ 盐析 液， 加 NaCl 至其最终浓度为 0. 9 mol / L， 4 ℃ 冷冻离心 20 过夜； 盐析后再以 6 000 r / min、 min， 沉淀用 0. 5 mol / L 乙酸溶解， 重复盐析和溶 解操作 1 次， 将得到的蛋白液移入透析袋， 用蒸馏 水透析 3 d， 每天更换透析水 2 ～ 3 次， 透析后进行 1 型真空冷冻干燥机， 北京博 真空冷冻干燥 （ FD医康实验仪器有限公司） 。 1. 9 胶原蛋白的紫外扫描 纯化的胶原蛋白样品溶液采用紫外分光光度 1600 全波段紫外扫描分光光度计， 计（ UV北京瑞 利分析仪器有限公司 ） 进行扫描， 波长间隔1 nm， 波长范围为 190 ～ 400 nm。 1. 10 胶原蛋白的 SDS － 聚丙烯酰氨凝胶电泳 （ SDSPAGE） 参照 Laemmi
裙边胶原蛋白的提取胃蛋白酶只对胶原蛋白的非螺旋区域起作用对螺旋区不进行水解采用胃蛋白酶制备胶原蛋白是目前应用效果比较好的一种方法11于胃蛋白酶的最适ph3需在酸性环境下才能提取因此本实验采用1柠檬酸作为酶解提取介质它除了有助于提取酸溶性胶原外还可使裙边变得更加溶胀或使其结构更加蓬松更有利于蛋白酶的水解提取
中华鳖裙边胶原蛋白的提取及其特征
1* 2 1 1 1 1 1 陆剑锋 ， 万 全 ， 殷章敏 ， 林 琳 ， 翁世兵 ， 叶应旺 ， 姜绍通
（ 1. 合肥工业大学生物与食品工程学院， 安徽 合肥 230009 ； 2. 安徽农业大学动物科技学院， 安徽 合肥 230036 ）
摘要： 胶原蛋白是生物体内一种重要的蛋白质， 也是结缔组织的主要蛋白成分。 与陆生动物 （ 如猪、 ） ， 牛等 比较 水生动物胶原蛋白具有优良的理化性质和生理活性功能 ， 已引起人们的广 泛关注。中华鳖是我国传统的名贵水产品 ， 其裙边胶原蛋白含量丰富， 具有极高的药用价值和 营养价值。采用胃蛋白酶酶解法在酸性条件下提取中华鳖裙边胶原蛋白 ， 研究酶添加量、 底物 提 取 时 间 对 提 取 效 果 的 影 响， 确 定 了 制 备 裙 边 胶 原 蛋 白 的 最 适 条 件 为： 酶 添 加 量 浓度、 4 mg / mL， 底物浓度 4% ， 提取时间 14 h。粗提胶原蛋白通过盐析、 透析等纯化步骤， 再经 SDSPAGE 电泳、 热变性温度测定、 紫外及傅立叶变换红外扫描等技术方法分析了胶原蛋白的生化 结果显示提取到的裙边胶原蛋白具有较高的纯度 ， 含有两条 α 链和 1 条 β 链， 属于典型 特征， 的 I 型胶原蛋白。研究表明： 中华鳖裙边胶原蛋白可以作为猪皮、 牛皮胶原蛋白的有效替代 品， 这为今后进一步综合开发利用鳖类裙边胶原多肽提供了科学的理论依据 。 关键词： 中华鳖； 裙边； 胶原蛋白； 提取； 纯化 中图分类号： TS 254. 4 文献标识码： A 因此寻找新的胶原蛋 源于牲畜的胶原蛋白制品， ［ 5 － 6］ 。而以水产动物为原 白来源显得愈来愈迫切 料制备的胶原产品是近年来被世界公认的一种安 全性较高的胶原蛋白来源， 备受国内外消费市场 的青睐。 中华鳖 （ Pelodiscus sinensis Wiegmann ） 是我国 俗称甲鱼、 团鱼、 水鱼、 王八、 神 传统的名贵水产品， 守等， 隶属爬行纲（ Repitlia） 、 鱼鳖目（ Testudinata） 、 ［ 7］ 鳖科（ Tironychidae ） 、 鳖属 （ Pelodiscus ） 。 鳖类的 生理活性物质及其抗癌药品、 保健食品的开发是研 滋补强身 究的热点。中医药认为鳖类有活血消淤， 可作为重病或手术后身体虚弱者的保健食 的功效， ［ 8］ 品 。鳖甲 周 围 的 结 缔 软 组 织 通 常 被 称 为“裙 ， 边” 裙边胶原蛋白含量丰富， 是最具滋补的部分， ［ 7 － 8］ 。目前对鱼 具有极高的药用价值和营养价值 类等水产动物胶原蛋白（ 如鱼皮、 鱼骨、 鱼鳞、 鱼鳍 ［ 9 － 10］ ） 的研究有很多， 或鱼翅 但有关鳖类裙边胶原 蛋白方面的报道较少。对裙边胶原蛋白采用水解
［ 12 ］
选用 2 ～ 3 年 生 长 期 的 中 华 鳖， 体重范围为 场， 550 ～ 600 g。先将中华鳖去头 （ 放血 ） 后致死， 然 裙边等分割后装入密封保鲜袋中 ， 于 后将其肌肉、 － 20 ℃ 下冷藏备用。所用试剂均为分析纯， 胃蛋 白酶活力为 1 200 IU / g。 1. 2 中华鳖裙边基本营养成分测定 水分的测定采用直接干燥法 （ GB / T 5009. 3 － 2003 ） ； 粗 蛋 白 含 量 的 测 定 采 用 凯 氏 定 氮 法 （ GB / T 5009. 5 － 2003 ） ； 粗脂肪含量的测定采用 索氏抽提法 （ GB / T 5009. 6 － 2003 ） ； 灰分的测定 采用干法灰化法（ GB / T 5009. 4 － 2003 ） 。 1. 3 中华鳖裙边胶原蛋白的提取工艺 中华鳖裙边原料预处理→去除非胶原蛋白 →去除脂肪 → 胃蛋白酶提取 → 盐析、 透析 纯化→低温冷冻干燥→胶原蛋白。 1. 4 L － 羟脯氨酸标准曲线的绘制 称取 50. 0 mg L － 羟脯氨酸用少量水溶解， 加 一滴 6 mol / L 盐酸， 定容至 100 mL 容量瓶中， 吸 取该溶液 1. 00 mL 于 100 mL 容量瓶中定容， 获得 浓度为 5 μg / mL 羟脯氨酸标准工作液。 分别吸 5、 10 、 15 、 20 、 25 mL， 定容至 取上述标准工作液 0 、 50 mL 容量瓶中， 0. 5 、 1. 0 、 1. 5 、 2. 0 、 2. 5 获得 0 、 μg / mL 的羟脯氨酸标准溶液。6 种不同浓度的羟 脯氨酸标准溶液经过氯胺 T 氧化， 生成含有吡咯 以对二甲基氨基苯甲醛进行显色 ， 在 环的氧化物， 558 nm 处比色测定吸光度， 并绘制相应的标准曲 线（ GB 9695 23 － 1990 ） 。 1. 5 裙边非胶原蛋白成分的去除 取出中华鳖裙边解冻， 称取 10 g 后， 用 2. 5% 的 NaCl 溶液（ 1∶ 30 W / V， 下同） 于 20 ℃ 下连续磁 力搅拌 24 h， 以去除水溶性和盐溶性杂蛋白 （ 非 胶原蛋白成分） ， 然后用蒸馏水反复洗涤， 充分沥 干后备用。再加入与 NaCl 溶液同量的 10% 异丙 醇溶液于 20 ℃ 浸泡 24 h， 以去除脂肪， 然后用蒸
水
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JOURNAL OF FISHERIES OF CHINA
Vol. 34 ，No. 6 June， 2010
文章编号： 1000 － 0615 （ 2010 ） 06 － 0981 － 08
DOI： 10. 3724 / SP. J. 1231. 2010. 06800
馏水反复洗涤， 充分沥干后备用。 1. 6 裙边胶原蛋白的提取 胃蛋白酶只对胶原蛋白的非螺旋区域起作 用， 对螺旋区不进行水解， 采用胃蛋白酶制备胶原 蛋白是目前应用效果比较好的一种方法
［ 11 ］Biblioteka 。由11. 1
材料与方法
实验材料 中华鳖购于合肥马鞍山路周谷堆农贸批发市
需在酸性环境下 于胃蛋白酶的最适 pH 为 2 ～ 3 ， ， 1% 柠檬酸作为酶解 才能提取 因此本实验采用 它除了有助于提取酸溶性胶原外 ， 还可 提取介质， 使裙边变得更加溶胀 （ 或使其结构更加蓬松 ） ， 更 有利于蛋白酶的水解提取。本实验考察了酶添加 底物浓度、 酶解时间对胶原蛋白提取的影响 量、 （ 测定水解液中羟脯氨酸含量， 以羟脯氨酸含量 较高为好 ） ， 并在单因素的基础进行正交优化实 进一步确定了裙边胶原蛋白最佳提取工艺 。 验， 1. 7 提取液中裙边胶原蛋白含量的测定 羟脯胺酸是胶原蛋白中一种特征氨基酸， 在 它是由相应的脯氨酸残 其它蛋白质中含量较少， 基经羟基化反应生成的， 因此通过羟脯氨酸的测 定可确定胶原蛋白的含量
［ 13 ］
电泳系统对纯化的胶原蛋白
6期
陆剑锋， 等： 中华鳖裙边胶原蛋白的提取及其特征
983
PAGE 垂直电泳（ DYY11 型电 样品溶液进行 SDS北京市六一仪器厂 ） 。分离胶浓度为 10% ， 泳仪， 200 V 电泳 30 min， 浓缩胶浓度为4% ， 用考马司 250 染色液 （ 考马斯亮蓝 R250 0. 5 g， 甲 亮蓝 R醇 225 mL， 蒸馏水 225 mL， 冰醋酸 50 mL） 染色 15 min， 脱色液（ 甲醇 100 mL， 冰醋酸 100 mL， 蒸馏水 800 mL） 脱色并拍照。 1. 11 裙边胶原蛋白的氨基酸（ AA） 测定 称取冷冻干燥后的纯化样品 1 mg 放入安瓿 瓶中， 加 2 mL 6 mol / L HCl（ 色氨酸测定采用 KOH 水解） ， 并充入少量氮气， 在酒精喷灯下迅速封管 后置于 110 ℃ 烘箱中水解 24 h。水解结束冷却后 移至坩埚， 在 70 ℃ 水浴锅中挥发剩余盐酸， 再加 入少量双蒸水蒸干， 重复 3 次， 用适量 pH 2. 20 的 缓冲液溶解后定容， 最后用 0. 22 μm 微孔滤膜抽 滤， 滤 液 采 用 氨 基 酸 全 自 动 分 析 仪 （ HITACH L8800 ， 日本 HITACH 公司） 进行测定。 1. 12 胶原蛋白的热变性温度测定
［ 14 ］ 样品制备参照 Kittiphattanabawon 等 的 方 法。将冷冻干燥后的纯化样品用 50 mmol / L 的乙
表 1 中华鳖的基本营养成分（ 以湿基计） Tab. 1 Content of basic nutrition in Pelodiscus 珚 sinensis（ on wet basis） X ± SD
收稿日期： 2010 01 14 修回日期： 2010 03 23
060110 ） 资助项目： 安徽省重大科技攻关项目（ 08010301078 ） ； 合肥工业大学学生创新基金资助项目（ 113Email： lujf@ sibs. ac. cn 通讯作者： 陆剑锋，
982
水
产
学
报
34 卷
技术等加工处理， 将有助于找到一些具有独特生理 。 功能的活性肽 本实验通过生物酶法研究中华鳖 纯化条件， 并分析了裙边胶 裙边胶原蛋白的提取、 原蛋白的基本特征， 旨在为今后进一步综合开发利 用有关鳖类的裙边胶原多肽提供科学的理论依据。
胶原（ collagen ） 是细胞外基质的一种结构蛋 白质， 它含有一个或几个由 α － 链组成的三螺旋 ［ 1］ 结构的区域， 即胶原域 。 胶原具有保护机体和 支撑器官的作用， 主要存在于动物肌腱、 韧带、 软 血管壁、 皮肤及结缔组织中， 占哺乳动物体内 骨、 ［ 2］ 蛋白质总量的 25% ～ 30% 。 胶原蛋白及其水 解得到的多肽产物不仅具有良好的消化吸收特 ［ 3 － 4］ ， 而且还具有许多重要的生理活性功能 在 性， 生物制药 （ 或医学 ） 、 医疗保健、 食品工业、 皮革产 业、 感光材料、 美容化妆品行业等方面都已得到广 泛应用。 长期以来， 工业胶原蛋白的来源仅限于猪、 牛 等陆 生 动 物， 但 随 着 疯 牛 病 （ bovine spongiform andmouth encephalopathy，BSE ） 、口 蹄 疫 （ footdisease， FMD ） 、 AI ） 及 其 禽流感 （ avian Influenza， （ zoonosis ） 的爆发和盛行， 人们 它一些人畜共患病 逐渐对牲畜等胶原制品的安全性产生了质疑 。 此 习惯等原因， 有些地区也不能使用来 外由于宗教、
。 吸取 0. 5 mL 裙边
加入 1 mL 6 mol / 胶原蛋白粗提液放入安瓿瓶中， L 的 HCl， 在酒精喷灯上迅速封管， 置于 130 ℃ 的 水 解 后 的 液 体 经 稀 释 后， 移入 烘箱中水 解 3 h， 100 mL 容量瓶中定容。 取 4 mL 滤液， 按羟脯氨 酸标准曲线法（ GB 9695 23 － 1990 ） 测定水解液中 的羟脯氨酸含量。 1. 8 裙边胶原蛋白的纯化 用最优方案提取胶原蛋白， 溶出物经过滤后 4 ℃ 冷冻离心 20 min， 倾出上清 以 6 000 r / min、 4 ℃ 盐析 液， 加 NaCl 至其最终浓度为 0. 9 mol / L， 4 ℃ 冷冻离心 20 过夜； 盐析后再以 6 000 r / min、 min， 沉淀用 0. 5 mol / L 乙酸溶解， 重复盐析和溶 解操作 1 次， 将得到的蛋白液移入透析袋， 用蒸馏 水透析 3 d， 每天更换透析水 2 ～ 3 次， 透析后进行 1 型真空冷冻干燥机， 北京博 真空冷冻干燥 （ FD医康实验仪器有限公司） 。 1. 9 胶原蛋白的紫外扫描 纯化的胶原蛋白样品溶液采用紫外分光光度 1600 全波段紫外扫描分光光度计， 计（ UV北京瑞 利分析仪器有限公司 ） 进行扫描， 波长间隔1 nm， 波长范围为 190 ～ 400 nm。 1. 10 胶原蛋白的 SDS － 聚丙烯酰氨凝胶电泳 （ SDSPAGE） 参照 Laemmi
裙边胶原蛋白的提取胃蛋白酶只对胶原蛋白的非螺旋区域起作用对螺旋区不进行水解采用胃蛋白酶制备胶原蛋白是目前应用效果比较好的一种方法11于胃蛋白酶的最适ph3需在酸性环境下才能提取因此本实验采用1柠檬酸作为酶解提取介质它除了有助于提取酸溶性胶原外还可使裙边变得更加溶胀或使其结构更加蓬松更有利于蛋白酶的水解提取
中华鳖裙边胶原蛋白的提取及其特征
1* 2 1 1 1 1 1 陆剑锋 ， 万 全 ， 殷章敏 ， 林 琳 ， 翁世兵 ， 叶应旺 ， 姜绍通
（ 1. 合肥工业大学生物与食品工程学院， 安徽 合肥 230009 ； 2. 安徽农业大学动物科技学院， 安徽 合肥 230036 ）
摘要： 胶原蛋白是生物体内一种重要的蛋白质， 也是结缔组织的主要蛋白成分。 与陆生动物 （ 如猪、 ） ， 牛等 比较 水生动物胶原蛋白具有优良的理化性质和生理活性功能 ， 已引起人们的广 泛关注。中华鳖是我国传统的名贵水产品 ， 其裙边胶原蛋白含量丰富， 具有极高的药用价值和 营养价值。采用胃蛋白酶酶解法在酸性条件下提取中华鳖裙边胶原蛋白 ， 研究酶添加量、 底物 提 取 时 间 对 提 取 效 果 的 影 响， 确 定 了 制 备 裙 边 胶 原 蛋 白 的 最 适 条 件 为： 酶 添 加 量 浓度、 4 mg / mL， 底物浓度 4% ， 提取时间 14 h。粗提胶原蛋白通过盐析、 透析等纯化步骤， 再经 SDSPAGE 电泳、 热变性温度测定、 紫外及傅立叶变换红外扫描等技术方法分析了胶原蛋白的生化 结果显示提取到的裙边胶原蛋白具有较高的纯度 ， 含有两条 α 链和 1 条 β 链， 属于典型 特征， 的 I 型胶原蛋白。研究表明： 中华鳖裙边胶原蛋白可以作为猪皮、 牛皮胶原蛋白的有效替代 品， 这为今后进一步综合开发利用鳖类裙边胶原多肽提供了科学的理论依据 。 关键词： 中华鳖； 裙边； 胶原蛋白； 提取； 纯化 中图分类号： TS 254. 4 文献标识码： A 因此寻找新的胶原蛋 源于牲畜的胶原蛋白制品， ［ 5 － 6］ 。而以水产动物为原 白来源显得愈来愈迫切 料制备的胶原产品是近年来被世界公认的一种安 全性较高的胶原蛋白来源， 备受国内外消费市场 的青睐。 中华鳖 （ Pelodiscus sinensis Wiegmann ） 是我国 俗称甲鱼、 团鱼、 水鱼、 王八、 神 传统的名贵水产品， 守等， 隶属爬行纲（ Repitlia） 、 鱼鳖目（ Testudinata） 、 ［ 7］ 鳖科（ Tironychidae ） 、 鳖属 （ Pelodiscus ） 。 鳖类的 生理活性物质及其抗癌药品、 保健食品的开发是研 滋补强身 究的热点。中医药认为鳖类有活血消淤， 可作为重病或手术后身体虚弱者的保健食 的功效， ［ 8］ 品 。鳖甲 周 围 的 结 缔 软 组 织 通 常 被 称 为“裙 ， 边” 裙边胶原蛋白含量丰富， 是最具滋补的部分， ［ 7 － 8］ 。目前对鱼 具有极高的药用价值和营养价值 类等水产动物胶原蛋白（ 如鱼皮、 鱼骨、 鱼鳞、 鱼鳍 ［ 9 － 10］ ） 的研究有很多， 或鱼翅 但有关鳖类裙边胶原 蛋白方面的报道较少。对裙边胶原蛋白采用水解
［ 12 ］
选用 2 ～ 3 年 生 长 期 的 中 华 鳖， 体重范围为 场， 550 ～ 600 g。先将中华鳖去头 （ 放血 ） 后致死， 然 裙边等分割后装入密封保鲜袋中 ， 于 后将其肌肉、 － 20 ℃ 下冷藏备用。所用试剂均为分析纯， 胃蛋 白酶活力为 1 200 IU / g。 1. 2 中华鳖裙边基本营养成分测定 水分的测定采用直接干燥法 （ GB / T 5009. 3 － 2003 ） ； 粗 蛋 白 含 量 的 测 定 采 用 凯 氏 定 氮 法 （ GB / T 5009. 5 － 2003 ） ； 粗脂肪含量的测定采用 索氏抽提法 （ GB / T 5009. 6 － 2003 ） ； 灰分的测定 采用干法灰化法（ GB / T 5009. 4 － 2003 ） 。 1. 3 中华鳖裙边胶原蛋白的提取工艺 中华鳖裙边原料预处理→去除非胶原蛋白 →去除脂肪 → 胃蛋白酶提取 → 盐析、 透析 纯化→低温冷冻干燥→胶原蛋白。 1. 4 L － 羟脯氨酸标准曲线的绘制 称取 50. 0 mg L － 羟脯氨酸用少量水溶解， 加 一滴 6 mol / L 盐酸， 定容至 100 mL 容量瓶中， 吸 取该溶液 1. 00 mL 于 100 mL 容量瓶中定容， 获得 浓度为 5 μg / mL 羟脯氨酸标准工作液。 分别吸 5、 10 、 15 、 20 、 25 mL， 定容至 取上述标准工作液 0 、 50 mL 容量瓶中， 0. 5 、 1. 0 、 1. 5 、 2. 0 、 2. 5 获得 0 、 μg / mL 的羟脯氨酸标准溶液。6 种不同浓度的羟 脯氨酸标准溶液经过氯胺 T 氧化， 生成含有吡咯 以对二甲基氨基苯甲醛进行显色 ， 在 环的氧化物， 558 nm 处比色测定吸光度， 并绘制相应的标准曲 线（ GB 9695 23 － 1990 ） 。 1. 5 裙边非胶原蛋白成分的去除 取出中华鳖裙边解冻， 称取 10 g 后， 用 2. 5% 的 NaCl 溶液（ 1∶ 30 W / V， 下同） 于 20 ℃ 下连续磁 力搅拌 24 h， 以去除水溶性和盐溶性杂蛋白 （ 非 胶原蛋白成分） ， 然后用蒸馏水反复洗涤， 充分沥 干后备用。再加入与 NaCl 溶液同量的 10% 异丙 醇溶液于 20 ℃ 浸泡 24 h， 以去除脂肪， 然后用蒸