生物制药学——第十三章 生化药物制造工艺

配方模式：
有人乳、全蛋白、FAO（联合国粮食组织）、 FAO-WHO（世界卫生组织）以及血浆游离氨基酸模 式。
不同类型的AA输液
氨基酸 营养输 液 代血浆 用输液 止血用 氨基酸 输液 婴幼儿 用氨基 酸输液 是一种给人体补充蛋白质营养的静脉注射液， 其氨基酸组成的配比依 其模式不同而不同，如 FAO 模式、FAO/WHO 参考模式、人乳和鸡 蛋蛋白模式、土豆-鸡蛋模式等。 此类氨基酸输液以及补充维持患者血容量为目的，通常采用 11 种氨 基酸组成，输液中加入右旋醣酐等作为血容量补充剂。 这种氨基酸输液由普通氨基酸输液与止血剂如氨基己酸组成， 它一方 面补充因失血引起的蛋白质损失，同时阻止继续出血。
碱水解法：
方法： 6 mol/L 氢氧化钠或4 mol/L氢氧化钡，100 ℃ 水解6 h。
产物：多种氨基酸混合物。
优点：水解迅速而彻底，色氨酸不被破坏；
缺点：含羟基或巯基的氨基酸全被破坏，且产生消旋， 工业上多不采用。
酶水解法：
方法：在一定pH和温度条件下，经蛋白水解酶作用 产物：氨基酸和小肽 优点：反应条件温和，无需特殊设备；氨基酸不被 破坏，无消旋作用；
第一节 氨基酸类药物
本节内容
一、氨基酸类药物概述及分类 二、氨基酸类药物的制造方法 三、氨基酸输液
3
一、氨基酸类药物概述及分类
（一）氨基酸的分类
1.蛋白质氨基酸：编码氨基酸（20种）
脂肪族、芳香族、杂环族； 酸性、中性、碱性
2.非蛋白氨基酸：不是蛋白质组分（450种以上）
D型氨基酸、β-氨基酸、γ-氨基酸等 （瓜氨酸、鸟氨酸→精氨酸 ）
吸附法： 离子交换法：
（3）氨基酸的精制
结晶、重结晶、溶解度与重结晶结合
2、用水解法生产氨基酸的品种及工艺
L-胱氨酸的制备
HOOC CH NH2 CH2 S S CH2 CH NH2 COOH
L-Cys2的特点：pI 5.05，不溶于乙醇、乙醚和丙酮，可溶于 无机酸或无机碱。
工艺路线：
毛或发 水解液 粗品Ⅰ
L-赖氨酸的制备（发酵法）
赖氨酸的性质：
pI 10.56，不溶于乙醇、乙醚，可易溶于水。 作用与用途：
L-Lys为必需氨基酸，也是复方氨基酸输液的重 要成份之一。近来有关研究发现赖氨酸对人的脑 部神经中枢细胞有很好的修复作用，还可以治疗 癫痫病、老年性痴呆、脑出血等。
发酵法的工艺：
①菌种：黄色短杆菌、谷氨酸棒杆菌、乳糖发酵 短杆菌、诺卡杆菌 ②碳源：淀粉水解糖、葡萄糖、醋酸、乙醇等。 ③氮源：硫酸铵、尿素等。 ④工艺流程 ⑤工艺控制要点
缺点：水解不彻底，产物中除氨基酸外，尚含有多 肽。工业上主要用于生产蛋白及蛋白胨。
（2）氨基酸分离
溶解度法：溶解度的差异 特殊试剂法：
邻二甲苯 4 磺酸 亮氨酸 盐 氨水 游离的亮氨酸 HgCl2 组氨酸 汞盐 处理 游离的组氨酸 苯甲醛 精氨酸 苯亚甲基精氨酸 HCl 游离的精氨酸
2、在转化反应Ⅱ中为什么要加磷酸吡哆醛？
⑤产品纯化与精制
结晶与重结晶
（四）化学合成法
以酸、醛、酯及某些氨基酸为原料，经氨
解、水解、缩和、取代及氢化还原等化学反应
合成α-氨基酸的方法称为化学合成法。
*理论上所有氨基酸均可由化学合成法制造，但
在目前只有当采用其他方法生产很不经济时才 采用化学合成法生产。
大肠杆菌AS1.881（含天冬氨酸酶）
德阿昆哈假单胞68变异株（含L-天冬氨酸-β-脱羧 酶） ②细胞固定： 凝胶包埋，加戊二醛交联
③生物反应堆的制备（分Ⅰ和Ⅱ）
④转化反应（温度、pH值、催化剂）
两个反应堆的温度：37℃
两个反应堆的pH值：反应堆Ⅰ：8.5；反应堆Ⅱ：
6.0
1、制备中为什么要调pH值？
CH 2
CH H2N
COOH
L-Asp粗品
L-Asp精品
固定化 L-Asp脱羧酶 L-Asp脱羧酶
H3 C
CH H2N
COOH +CO 2
转化液B
L-Ala粗品
L-Ala精品
工艺路线
延胡索 酸氨盐
固定化酶 柱子a 离心机
泵 储
母 液 回 收
罐
反应产物
L-Asp
晶体 L-Asp
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工艺控制要点
①菌种的培养：
P394， 图13-1
发酵的基本过程
菌 种 诱 变 选 育 产 物 分 离 纯 化
种 子 培 养
发 酵 培 养
25
碳源：淀粉水解糖、糖蜜、干薯粉、甲醇、乙醇等。 氮源：硫酸铵、尿素或豆饼水解液等。
菌种：细菌、酵母菌（野生型或人工诱变营养缺陷性）
*绝大部分氨基酸可通过发酵法生产 • 缺点 产物浓度低，设备投资大，工艺管 理要求严格，生产周期长，成本高。
工艺路线：
工艺控制要点
A、灭菌发酵：发酵温度（前期32℃、中后期
30℃）、发酵pH值（6.5～7.0） B、发酵液的处理：先除去菌体和杂质离子， 再对发酵液进行提取 除菌体和杂质方法：离心分离、加絮凝剂法 发酵液的提取方法：离子交换树脂法、沉淀法、 有机溶剂抽提法 问题：为什么可以用阳离子交换树脂法提取？ C、浓缩结晶（加活性炭脱色）
根据婴幼儿旺盛生长期体内保留氮及能量极少， 婴幼儿肾功能尚未发 育完全， 肝脏等组织对营养素处理能力较差这一特点， 配方选用高含 量的支链氨基酸（Leu、Ile、Val）和精氨酸，而将谷氨酸和甘氨酸 适当减少，并配合适量葡萄糖、维生素和电解质等。 治疗用 如用于肝病的氨基酸输液， 是根据肝硬化病人图谱表现为支链氨基酸 氨基酸 含量偏低，而芳香族氨基酸偏高，血清中支/芳比下降特点而设计的。 输液 此类输液要求富含支链氨基酸。 又如肿瘤患者氨基酸输液， 是针对不 同肿瘤患者特殊的氨基酸图谱，配合治疗药物而设计的。
酸水解 NaOH中和（ pH 4.8）
粗制： HCl、活性炭 滤液 NaOH中和（4 粗品Ⅱ pH .8） 精制： HCl、活性炭 滤液 氨水中和（ p5 L 胱氨酸 H 3. ～4.0）
含量测定：滴定法
作用与用途：p393
生化药物发展概况
有机溶剂分级分离、等电点沉淀等 --------粗提物
离子交换层析、凝胶层析、超滤等技术 --------提高了产品的纯度和收率
多种层析技术、超速离心等 --------高纯度的生化药物
分 类
氨基酸类药物 多肽类药物 蛋白质类药物
核苷酸与核酸类药物 酶类药物
多糖类药物
脂类药物
维生素与辅酶类药物
1
药理活性高，针对性强 毒副作用少，营养价值高 生理副作用常有发生
免疫原反应，过敏反应
2
3
2．理化特性：
1
有效物质含量低，杂质多，工艺 复杂，收率低，技术要求高。
2
结构复杂，生物活性受空间结构 严格限制，稳定性差。
生物材料易染菌，腐败。
3
3．天然生物药物是新型药物的先导物
通过合理的药物设计，可以创造 出疗效更高，作用更专一，更易为机 体接受，副作用与不良反应更小的新 药。
三、氨基酸输液
氨基酸输液：
多种结晶L-氨基酸依特定比例混合制成的静脉
内输注液称为氨基酸输液。 当由于疾病等原因，不能经口摄取的时候，
把纯度高的氨基酸混合液作为最合适的氮源，从
静脉注入身体是比较合理的营养补给方法。
氨基酸输液的组方原理与配方模式
氨基酸输液的组方原理和原则：
一种优良的氨基酸输液注入人体后，各种氨 基酸能得到最有效地利用，其组成平衡，使临床症 状得到改善，体重增加而无代谢并发症，血浆游离 的氨基酸谱无显著变化。
D、 精制（重结晶）
（三）酶转化法
基本原理： 又称酶工程技术，是在特定酶的作用下 使某些有机物转化成相应氨基酸的技术。
* 主要过程
前体合成
菌体培养 转化反应 产品纯 化与精 制
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* 优点
工艺简单，产物浓度高，转化率及生产效率 较高，副产物少，固定化酶或细胞可进行连续操 作，节省能源和劳务，并可反复使用。
等电点
性 质 酸性 AA 中性 AA
溶解性
溶于水和盐酸， 不溶于乙醇和 乙醚 在水中有一定 溶解性，不溶 于丙酮及乙醚
2.77
L-Asp
L-Ala
H3 C
CH H2N
COOH
89.09
6.0
酶转化反应
HOOC CH CH COOH
工艺路线
延胡索酸+ NH3 固定化 天冬氨酸酶
天冬氨酸酶 转化液A
HOOC
（三）合成或半合成生物药物
生化药物的定义、特点、分类
定义： 具体运用生物化学研究方法，从
生物体中经提取、分离、纯化等手段获得
的天然存在的生化活性物质或将上述这些
物质加以结构改造或人工合成创造出的自
然界没有的新的活性物质，通称生化药物
（Biochemical medicine）。
生化药物的特性
1．药理学特性：
细胞生长调节因子---在体内和体外对效应细胞的生
长、增殖和分化起调控作用的一类物质。
许多生长因子在靶细胞上有特异性受体，仅微量就
有较强的生理活性。
微生物植物细胞动物细胞化学合成生物合成天然存在底底物aa前体生物反应器含含laa反应液laa酶转化法生产laa流程结结构分子量等电点性性质溶解性lasp1331277酸性aa溶于水和盐酸不溶于乙醇和乙醚lala890960中性aa在水中有一定溶解性不溶于丙酮及乙醚hoocchnh2coohch2chnh2coohh3cllasp和llala的结构与性质ll天冬氨酸及ll丙氨酸的制备hoocchcoohchhoocchnh2coohch2chnh2coohh3cco2天冬氨酸酶lasp脱羧酶酶转化反应工艺路线固定化lasp脱羧酶转化液b延胡索酸nh3固定化天冬氨酸酶转化液alasp粗品lasp精品lala粗品lala精品泵泵储罐反应产物离心机母液回收收固定化酶柱子a晶体lasplasp延胡索酸氨盐工艺路线36菌种的培养
经分离纯化获得各种药用氨基酸的方法称
为水解法。 * 主要过程：水解、分离和结晶精制。
（1）蛋白质水解
酸水解法：
方法：6~10 mol/L 盐酸或8 mol/L 硫酸，110~120℃ 水解12~24 h。 产物：多种氨基酸混合物。
优点：水解迅速而彻底；无消旋作用；
缺点：色氨酸全部被破坏；丝氨酸、络氨酸部分破 坏；天冬酰胺、谷胺酰胺脱酰胺基；产生大量废 液污染环境。
第二节 多肽与蛋白质类药物
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本节内容 一、多肽与蛋白质类药物概述 二、多肽与蛋白质类药物的制造方法 三、重要的多肽与蛋白质类药物的制备
一、多肽与蛋白质类药物概述
多肽类生化药物是以多肽激素和多肽细胞生长因
子为主的一大类内源性活性成分。
1953年，人工合化学修饰
谷氨酰胺、5-羟色胺酸、硫酸甘氨酸、磷葡精 氨酸等
4.必需氨基酸和非必需氨基酸：
8种必需AA（人）: 亮、异亮、赖、苯丙、甲硫、 苏、色、缬。 半必需氨基酸：精氨酸、组氨酸 非必需氨基酸：能自身合成
（二）氨基酸及其衍生物在医药中的应用
1. 氨基酸的营养价值及其与疾病的关系 2. 治疗消化道疾病的氨基酸及其衍生物 3. 治疗肝病的氨基酸及其衍生物 4. 治疗脑及神经系统疾病的氨基酸及衍生物 5. 用于肿瘤治疗的氨基酸及其衍生物 6. 其他氨基酸类药物的临床应用
（二）发酵法
发酵的基本原理：
利用微生物酶的作用，将培养基中有机物转化 为细胞或其他有机物的过程。
初生氨基酸：微生物利用固氮作用、硝酸还原及自 外界吸收氨使酮酸氨基化成相应的氨基酸。或微生 物通过转氨酶作用，将一种氨基酸的氨基转移至另 一种α-酮酸上，生成新的氨基酸。
次生氨基酸：以初生氨基酸为前体转化成的其他氨 基酸。
* 缺点
固定化细胞或固定化酶代价高。
酶转化法生产L-AA流程
化学合成，生物合 成，天然存在 底 物 （AA前体） 微生物 植物细胞 动物细胞
生物反应器
含L-AA反应液
L-AA
L-天冬氨酸及L-丙氨酸的制备
L-Asp和L-Ala的结构与性质
结
HOOC CH 2
构
CH H2N
分子量
COOH 133.1
20世纪五十年代---脑垂体分泌的多肽激素
60年代---控制脑垂体激素分泌的各种多肽激素 70年代---神经肽，胃肠道激素。
蛋白质生化药物包括蛋白质类激素、蛋白质细胞生
长调节因子、血浆蛋白质类、黏蛋白、胶原蛋白、 蛋白酶抑制剂等。
作用方式：从对机体各系统和细胞生长的调节，扩
展到被动免疫、替代疗法和抗凝血等。
2005版中国药典收载的氨基酸原料药
二、氨基酸类药物的制造方法
（一）蛋白质水解法
L-胱氨酸、L-半胱氨酸
（二）发酵法 苏、异亮、缬、精、组、脯、鸟、瓜、赖、亮 （三）酶转化法 丙、天冬、色
（四）化学合成法
甘、蛋、丙、丝
（一）水解法 1、基本原理与过程
以毛发、血粉及废蚕丝等蛋白质为原料，
通过酸、碱或酶水解成多种氨基酸混合物，
第 三 篇
重要生物药物制造工艺
第十三章 生化药物制造工艺
生物药物的类别
（一）天然生物药物 1.微生物药物 microbiol medicine 2.天然生化药物 Biochemical medicine 3. 海洋生物药物 marine medicine
（二）生物技术药物（新生物制品） 1.DNA重组药物（DNA recombinant medicine）——基因工程与蛋白质工程药物 2. 基因药物