（精选）均匀设计在紫球藻培养基优化中的应用

均匀设计在紫球藻培养基优化中的应用
孙利芹1, 2
，林剑2
，王长海2
，江涛
1
中国海洋大学，山东青岛；烟台大学海洋生化工程研究所，山东烟台
( 1. 266071 2.. 264005 )摘要 ：将均匀设计的方法应用于紫球藻 (
Porphyridium cruentum 培养基的优化。

在单因素实验的基础 ) 上，采用 U 12 (123
×均匀设计表对影响紫球藻生长显著的种主要营养因素进行了优化，获得了以海水6) 4 为基础的优化培养基配方：NaHCO 3，: 2.755 g/L NaNO 3，: 3.224 g/L KH 2PO 4，: 0.035 g/L VB 12: μ，2.772 g/L VB 1，，有效地提高了紫球藻的生物量产量和生长速率。

: 0.9 mg/L Fe-EDTA: 0.11 mg/L 关键词：紫球藻；培养条件优化；均匀设计
中图分类号：； Q949.29+2.1Q945.3 文献标识码：A 文章编号：1001-6392(2004)06-0066-05
均匀设计是我国著名数学家王元、方开泰创立的一种将数论与多元统计相结合的实验设计方法，与正交设计相比，它具有许多突出优点，如：每个因素每个水平只做一次试( 1 ) 验，而且试验次数与水平数相同；水平数增加时，试验次数按水平数增加的量而增( 2 ) 加；可以用计算机给出定量方程式，便于分析条件对结果的影响，减小误差；可( 3 ) ( 4 ) 以大大地减少试验次数，提高工作效率，降低成本；便于对有交互作用的因素进行实( 5 ) 验研究。

均匀设计在军事科学、航空航天上应用极广，在生化、微生物工程方面也有较多的
报道[1-3]。

紫球藻 (
P orphyridium cruentun 是一种比较原始的单细胞红藻，它广泛地分布在海 ) 水、淡水、咸水及潮湿的土地中，有较强的抗盐性。

紫球藻生长过程中能合成藻红蛋白、高不饱和脂肪酸和紫球藻多糖等多种具有广阔前景及巨大潜在市场的生物活性物质，有很高的
经济价值。

紫球藻的生长过程中不利用有机碳源，HCO 3-和 CO 2均有利于它的生长，培养基 中和微量元素的浓度大小对其生长也有很大的影响 C, N, P [4]。

对于紫球藻培养基的优化已有相关报道 [5]
，但仅限于运用正交设计方法，考虑到均匀设计能够用最少的试验次数获得科学结论，这对于海洋微藻培养基的筛选具有重要的意义。

因此本文将这种新型的设计方法用在紫球藻培条件的优化上，以较少的实验次数，借助计算机的统计回归软件，寻找到最优的培养基配方。

材料与方法
１ 藻种
1.1 实验所用紫球藻 (
P orphyridium cruentun 藻种是由烟台大学海洋生化工程研究所提 ) 供，经分离与纯化所得。

培养液、培养条件
1.2 原始培养基配方原为：
( 1) NaHCO 3, 3.0 g/L; NaNO 3, 1.5 g/L; KH 2PO 3, 0.03 g/L; VB 12,
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6 67μ0.5 g/L; VB 1和, 0.9 mg/L Fe-EDTA, 0.11 mg/L [5]。

配制培养基用的海水为经海水过滤系统过滤的无菌海水，自然。

pH 藻类培养在恒温振荡培养箱中进行，设定温度为：℃±１℃，光照强度：，23 3 500 lx 转速：。

140 r/min 测试方法
1.3 用比色法测定生物量[6]
，建立细胞个数与吸光度的关系曲线及细胞干重与吸光度的关系曲线。

取新鲜培养液，离心，弃上清液，以无菌海水悬浮，再次离心，用3 500 r/min 15 min 无菌海水定容到一定的浓度，用第二次离心后的上清液作参比，在下测其吸光度。

604 nm 同时采用血球计数法计量其对应的细胞个数；取培养液加入离心管中，两次离心、 10 mL 洗涤后置于℃烘箱内干燥至恒重，得到光密度与藻体细胞干重的标准曲线。

105 单因素实验
1.4 对可能影响紫球藻生长的各因素取不同水平，在其它培养条件相对固定的情况下考察其各自对紫球藻生长的影响。

培养基的均匀设计实验
1.5 依据单因素实验结果，选取对紫球藻生长影响显著的因子，采用均匀设计方法，选取U 12 (123
×均匀设计表考查种因素对紫球藻生长的影响，各因素水平见表。

6) 4 1验证实验
1.6 采用优化配方优和原配方原分别对紫球藻进行培养实验，测定 ( 1) ( 1) OD 604值，绘制 紫球藻生长的曲线，比较所得藻体细胞干重。

计算两种配方下培养的紫球藻的生长速率，计算公式为：K = 3.32 (lg N －lg N 0△)/t ，其中：K 为生长速率； N , N 0分别为不同生长时期的细胞个数；△ t 为时间差。

结果与讨论
２ 标准曲线的绘制
2.1 藻体细胞个数、细胞干重与 OD 604的关系曲线如图和图所示，线性回归后得一元一
1 2 次回归方程为：藻体细胞数 ( 106
/mL ) Y 1 = 8.5662 X －；藻体细胞干重0.1204 Y 2 = 1.0622 X －。

0.0365单因素实验结果
2.2 分别考察了碳酸氢钠、硝酸钠、磷酸二氢钾、维生素 B 1, B 12和对紫球藻生长 Fe-EDTA 的影响，结果如图所示。

3 由图藻体细胞的生长曲线可以看出，同大多数微生物一样，紫球藻的生长过程也可分
3
NaHCO 3/g ·L -1
0.10.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5NaNO 3/g ·L -1
0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0Vb 12/μg ·L
-1
0.10.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
5.5
KH 2PO 4/g ·L
-1
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
海洋通报卷
68 23 为延迟期、指数生长期、稳定期和衰退期。

通过单因素水平实验可以发现，NaHCO 3,
NaNO 3, KH 2PO 4和 VB 12对紫球藻的生长都有一定的影响，其中 KH 2PO 4的影响最显著， VB 1
和对紫球藻生长的影响不明显。

因此在均匀设计实验时只将前项因子作为紫球
Fe-EDTA 4 ００．４
０．８１．２
０
５
１０１５
２０
ｔｉｍｅ（ｄ）
ＯＤ值
００．４
０．８１．２
０
２
４６８
１０
ｔｉｍｅ（ｄ）
ＯＤ值
００．４０．８１．２１．６０
２
４６８
１０
ｔｉｍｅ（ｄ）
ＯＤ值
００．４
０．８
１．２
０
２
４６８１０
ｔｉｍｅ（ｄ）
ＯＤ值
００．４
０．８１．２
０
２
４６８
１０
ｔｉｍｅ（ｄ）
ＯＤ值
０
０．４０．８１．２０２４
６８１０
ｔｉｍｅ（ｄ）
ＯＤ值( a ) NaHCO 3
( b ) NaNO 3
( c ) KH 2PO 4
( d ) VB 1
( e ) VB 12
( f ) Fe-EDTA
图 3 VB 12 , NaHCO 3, NaNO 3, KH 2PO 4, VB 1和对紫球藻生长的影响
Fe-EDTA Fig. 3 Effect of VB 12 , NaHCO 3, NaNO 3, KH 2PO 4, VB 1和
Fe-EDTA on porphyridium cruentum's growth
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6 69藻生长的影响因素。

均匀设计实验结果
2.3 采用 U 12 (123
×均匀设计表安排实验，并测量菌体生长的值，其结果如表所
6) OD 2 示。

应用数理统计软件，对表进行数据处理，回归分析结果见表。

MatLab 2 3由表可得回归方程为：
3 Y － = 146.118.3 X 1－ 16.
4 X 2－ 12.6 X 3－ 3731.9 X 4－ 1.7 X 1 X 2 + 2.1 X 1 X 3 +
511.7 X 1 X 4 + 0.3 X 2 X 3 + 577 X 2 X 4 + 166.5 X 3 X 4
相应的
R 2
相关系数 () = 0.9744, F = 3.8013, P = 0.3808, F > F
， 47，回归方 (0.10) = 2.96程经 F
检验为显著，且残差均很小，因此 回归方程可信。

分别对变量 X 1, X 2, X 3, X 4求
偏导，并令偏导数为零，方程有极值，求得极值点为：X 1 = 2.755, X 2 = 3.224, X 3 = 2.772, X 4。

因此均匀设计优化紫球
= 0.035藻培养基为：NaHCO 3, 2.755 g/L; NaNO 3, 3.224 g/L; KH 2PO 4, 0.035 g/L; VB 12, 2.772
μg/L; VB 1，, 0.9 mg/L; Fe-EDTA, 0.11 mg/L 记为优。

1验证实验结果
2.4 将紫球藻分别用优化配方优与原配方
原在其它培养条件相同的情况下进行培 ( 1) ( 1) 养，两种培养基浓度下藻体生长的情况如图所示。

4 结论
３ 单因素实验结果表明a ) NaHCO 3, NaNO 3, KH 2PO 4和
VB 12在实验浓度范围内对紫球藻的 生长有显著影响，而 VB 1和在低浓度范围内对紫球藻的生长有一定的影响，但当 Fe-EDTA VB 1的浓度超过和的浓度超过时，二者对紫球藻的生长没有
0.8 mg/L Fe-EDTA 0.08 mg/L
实验号O 31224X 1X 2X 3X 4Y 10.5 4.0 4.00.05 1.263 1.3052 1.5 1.5 2.00.04 1.334 1.383 2.5 5.50.10.02 1.023 1.054 3.5 3.0 4.50.010.240.2185 4.50.5 2.50.060.510.5056 5.5 4.50.50.040.0720.04070.1 2.0 5.00.03 1.155 1.1908 1.0 6.0 3.00.010.2650.2459 2.0 3.5 1.00.06 1.325 1.37110 3.0 1.0 5.50.050.6600.66511 4.0 5.0 3.50.030.4130.40212
5.0
2.5
1.5
0.02
0.433
0.423
０
０．４
０．８
１．２１．６２
０２４６８１０１２
ｔｉｍｅ（ｄ）
ＯＤ值
变量回归系数B 0146.10.974 4 3.801 3
0.380 8
X 1-18.3X 2-16.4X 3-12.6X 4-3731.9X 1X 2-1.7X 1X 3 2.1X 1X 4511.7X 2 X 30.3X 2X 4577X 3X 4
166.5
图紫球藻生长曲线
4 Fig. 4 The growth curve of porphyridum cruentum
70 23
海洋通报卷
明显促进作用。

b )
通过对主要营养元素的优化实验获得了以海水为基础、稳定高产的紫球藻培养基优化配方为：NaHCO3, 2.755 g/L; NaNO3, 3.224 g/L; KH2PO4, 0.035 g/L; VB12, 2.772 g/L; VB1, 0.9 mg/L; Fe-EDTA, 0.11 mg/L
μ。

c ) 1.46 g/L
验证实验表明优化配方的紫球藻达到稳定期时藻体细胞干重可达，而原培养
0.87 g/L40 %
基配方下培养的藻体干重只有，优化配方高于原配方。

优化配方的生长速率达 0.60
到。

参考文献：
[1] , . [M]. : , 1994, 21-23.
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[2] , . () [J]. , 2000, 22(11): 758-760.
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王长海鞠宝欧阳藩紫球藻的培养条件化工冶金
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王长海鞠宝欧阳藩紫球藻培养条件优化化工冶金
( 1973)
作者简介：孙利芹—，女，中国海洋大学在读硕士研究生，工程师。

主要从事微藻
10
生物技术的教学和科研工作，在国内刊物发表论文余篇。

Application of Uniform Design in the Media Optimization of
Porphyridium cruentum
SUN Liqin1, LIN Jian1, WANG Changhai1, JIANG Tao2
(1. Institute of Marine Biochemistry Engineering, Yantai University, Yantai 264005, Shandong, China;
2. Marine University of China, Qingdao 266071, Shandong, China)
Abstract: Uniform design method was applied in this paper for the media optimization of the marine microalgae. On the basis of the single factor experiment ,four key nutrient factors which had distinct effect on Porphyridium crentum's growth were optimized by means of the uniform design experiment of U12(123×6), and the optimum media ingredients were obtained as follows:
: 2.772g/L, VB1: 0.9 mg/L, NaHCO3: 2.755 g/L, NaNO3: 3.224 g/L, KH2PO4: 0.035 g/L, VB12μ
Fe-EDTA: 0.11 mg/L. The Porphyridium crentum cell biomass and growth rate could also be improved effectively.
Key words:P orphyridium crentum; optimization; uniform design。