小白菊内酯对人非小细胞性肺癌H1975细胞凋亡、侵袭与迁移的影响

小白菊内酯对人非小细胞性肺癌H1975细胞凋亡、侵袭与迁
移的影响
白祥建;朱美林;李博涵;李红梅;霍强;吴成柱
【摘要】目的探究小白菊内酯(parthenolide,PTL)对非小细胞性肺癌细胞株
H1975凋亡、侵袭和迁移的影响及其可能机制.方法 MTT法和集落克隆实验检测PTL对H1975细胞增殖的影响;Annexin V-FITC/PI双染、流式细胞仪检测PTL对H1975细胞凋亡的影响;Transwell实验检测PTL对H1975细胞侵袭和迁移的影响;Western blot检测细胞凋亡、侵袭和迁移相关蛋白,以及PI3K/Akt信号通路相关蛋白的表达.结果 MTT和集落克隆实验结果显示,随着PTL浓度的增加,H1975细胞的增殖明显受到抑制,与对照组相比,差异均具有统计学意义(P<0.05);Annexin V-FITC/PI双染结果显示,PTL能明显诱导H1975细胞发生凋亡
(P<0.01);Transwell实验结果显示,PTL能明显抑制H1975细胞侵袭和迁移
(P<0.01);Western blot结果显示,PTL明显上调H1975细胞Bax蛋白表达,下调Bcl-2、HIF-1α、MMP-9、Akt、p-Akt(Ser473)蛋白的表达(P<0.05),同时使caspase-3蛋白发生裂解.结论 PTL能明显诱导非小细胞性肺癌H1975细胞发生凋亡,抑制其侵袭和迁移,作用机制可能与PTL抑制PI3K/Akt信号通路有关.
【期刊名称】《中国药理学通报》
【年(卷),期】2019(035)005
【总页数】7页(P673-679)
【关键词】小白菊内酯;非小细胞性肺癌;凋亡;侵袭;迁移;Akt
【作者】白祥建;朱美林;李博涵;李红梅;霍强;吴成柱
【作者单位】蚌埠医学院药学院,安徽蚌埠 233000;蚌埠医学院药学院,安徽蚌埠233000;蚌埠医学院药学院,安徽蚌埠 233000;蚌埠医学院药学院,安徽蚌埠233000;蚌埠医学院药学院,安徽蚌埠 233000;蚌埠医学院药学院,安徽蚌埠233000
【正文语种】中文
【中图分类】R284.1;R329.24;R329.25;R743.202.2;R977.6
非小细胞性肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)约占肺癌患者的80%，大多数患者发现时已处于晚期或中晚期，5年生存率不足10%，严重危害着人类健
康和生命[1]。

在过去较长时间内，以小分子靶向药物吉非替尼为代表的表皮生长
因子受体酪氨酸激酶抑制剂(epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI)，在NSCLC治疗中发挥重要作用。

然而，随着化疗的推进，EGFR-TKI在表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)突变的NSCLC类型中不能发挥出很好的疗效，不可避免地出现获得性耐药，导致化疗失败[2]。

因此，寻找更为低毒有效的化疗药物，成为当前NSCLC治疗研究的热点。

PI3K/Akt信号通路在肿瘤的发生、发展中发挥重要作用[3]。

Akt作为该信号通路的关键蛋白，能够调节下游相关基因和分子，从而影响肿瘤细胞增殖、转移、凋亡等过程。

大量研究表明，PI3K/Akt信号通路在许多肿瘤组织中持续活化，严重影
响化疗的进行。

因此，针对该信号通路的靶向抑制剂的研究已经成为了关注焦点，为抗肿瘤药物的研发提供新的思路。

从中草药中获得的天然产物，由于其结构复杂多样、毒性低，且具有多靶点、多途径的抗肿瘤活性，已经成为肿瘤药物研发的重要来源之一[4]。

小白菊内酯(parthenolide，PTL)是从中草药小白菊(Chrysanthemum parthenium)中提取分
离到的一种倍半萜内脂类化合物(结构见Fig 1A)，可用于治疗头痛、风湿等疾病。

近年来发现，PTL具有很强的抗肿瘤活性，能够抑制肿瘤细胞增殖，诱导肿瘤细胞凋亡等[5]。

而关于PTL对EGFR突变型的NSCLC细胞株H1975的作用却未见报道。

本研究以H1975细胞作为研究对象，观察PTL对其增殖、凋亡、侵袭、迁移等的影响，并探讨其相关的作用机制。

1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 药物与试剂 PTL，由蚌埠医学院药物化学实验室提供，纯度为99.5%。

RPMI 1640，购自HyClone公司；胎牛血清，购自浙江天杭生物科技有限公司；四甲基偶氮唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)，购自美国Sigma公司；结晶紫染液为碧云天公司产品；Transwell小室和基质胶(Matrigel)，购自BD公司；Annexin V-FITC/PI试剂盒，购自贝博生物；β-actin、Bcl-2、Bax抗体，购自Proteintech公司；缺氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor 1α，HIF-1α)、基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9，MMP-9)抗体，购自Abcam公司；caspase-3、Akt、p-Akt(Ser473)抗体，购自CST公司。

1.1.2 细胞株 EGFR突变型NSCLC细胞株H1975，购自上海细胞库。

培养于含15%胎牛血清的RPMI 1640培养液中，在5% CO2、37 ℃以及饱和湿度的无菌
培养箱中传代培养，取处于对数生长期的细胞进行实验。

1.1.3 仪器细胞培养箱(Thermo Scientific公司)；倒置显微镜(OLYMPUS公司)；流式细胞仪(BD公司)；微量高速冷冻离心机(BECKMAN COULTER公司)；酶标
仪(BioTek公司)；电泳仪、电泳槽及转移槽(Tanon公司)；凝胶成像仪(Bio-Rad
公司)。

1.2 MTT法检测PTL对细胞增殖的影响取处于对数生长期的H1975细胞，接种
于96孔细胞培养板中，每孔1×104个细胞，培养24 h细胞贴壁后，更换含不同
浓度PTL(6.25、12.5、25、50 μmol·L-1)的培养液，同时设阴性对照组和空白对
照组，每组设3个复孔，分别培养24、48、72 h。

待培养结束后，加入10 μL MTT(5 g·L-1)，在37 ℃培养箱继续孵育4 h，弃上清，每孔加入100 μL DMSO，于37 ℃培养箱中孵育30 min，酶标仪上振荡20 s，以酶标仪检测波长490 nm
处吸光度(A)值，计算细胞存活率。

细胞存活率=(实验组A值-调零组A值)/(对照
组A值-调零组A值)×100%。

以上实验重复3次。

1.3 集落克隆形成实验将H1975细胞接种于6孔细胞培养板中，每孔1×104个
细胞。

培养24 h后，更换含不同浓度PTL(1.25、2.5、5 μmol·L-1)或等体积DMSO的新鲜培养液。

置细胞培养箱中培养96 h后，预冷PBS洗2次，4%多聚甲醛固定15 min，弃固定液，然后加入结晶紫染液染色15 min，再用双蒸水洗
去染液，室温下晾干，拍照。

实验重复3次。

1.4 Annexin V-FITC/PI染色流式细胞仪检测细胞凋亡取生长良好的H1975细胞，接种于6孔板中，每孔3×105个细胞，继续培养24 h至细胞贴壁。

然后更换含PTL(浓度为7.5、15、30 μmol·L-1)或等体积DMSO的新鲜培养液，置培养箱中作用24 h。

作用结束后，收集细胞，1 500 r·min-1离心10 min，弃上清，加入
预冷的Annexin V结合液重悬细胞，置冰浴，每管分别加入5 μL Annexin V-FITC染液和5 μL PI染液，避光染色20 min，上流式细胞仪检测分析。

实验重复
3次。

1.5 Transwell法检测细胞迁移取处于对数生长期的H1975细胞，胰酶消化收集
细胞，再用PBS重悬细胞，洗去含血清的细胞培养液，接着用不含血清的RPMI 1640培养基重悬细胞，调整细胞浓度为2.5×108·L-1。

小室上室为200 μL细胞
悬液，即5×104个细胞，并加入不同浓度的PTL(0、1.25、2.5、5 μmol·L-1)，
将小室放置12孔板中。

下室为800 μL含15%胎牛血清的RPMI 1640培养液。

培养箱中继续培养24 h。

作用结束后，小心吸去上室的细胞悬液，用4%多聚甲
醛固定15 min，再用结晶紫染液染色15 min，然后将小室用PBS清洗2遍，棉
棒小心擦去上室未迁移的细胞。

倒置显微镜下随机选取3个视野，拍照(×200)保存，统计穿过微孔膜的细胞。

以上实验重复3次。

1.6 Transwell法检测细胞侵袭取基质胶放于冰上融化，并用预冷的RPMI 1640
培养基4 ∶1稀释。

每个小室中加入45 μL基质胶，铺匀，放置培养箱中1～2 h。

同迁移实验中处理细胞，调整细胞浓度为5×108·L-1，每个小室加入200 μL细胞悬液，即1×105个细胞。

并加入不同浓度的PTL(终浓度0、1.25、2.5、5
μmol·L-1)，作用时间为48 h。

其余步骤同“1.5”。

以上实验重复3次。

1.7 Western blot检测相关蛋白表达取处于对数生长期的H1975细胞，接种于6孔板中，每孔3×105个细胞，继续培养24 h至贴壁。

按实验设计，更换含
PTL(7.5、15、30 μmol·L-1)或等体积DMSO的新鲜培养液，继续作用24 h。

作用结束后，收集细胞，2 500 r·min-1离心10 min，弃上清，每孔加入50 μL含
蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液，置冰上裂解30 min。

4 ℃、12 000 r·min-1离心30 min，取上清，用BCA试剂盒进行蛋白定量。

每组取50 μg蛋白进行SDS-PAGE电泳，转膜，封闭2 h，1×TBST洗3次，每次5 min， Bcl-2、Bax、caspase-3、Akt、p-Akt(Ser473)、HIF-1α、MMP-9一抗4 ℃孵育过夜，
1×TBST洗3次，每次5 min，二抗室温孵育2 h，1×TBST洗3次，每次5 min，加入显影液，凝胶成像仪获取图像。

实验重复3次。

1.8 统计学处理实验结果以表示，采用SPSS 16.0统计软件进行方差分析及两样
本均数t检验。

2 结果
2.1 PTL对H1975细胞的增殖抑制作用 MTT结果显示，随着给药浓度的增加，PTL对H1975细胞的增殖抑制作用明显增加，其中PTL处理H1975细胞24、48、72 h的半数抑制浓度(IC50)分别为(15.83±0.35)μmol·L-1、
(14.04±0.11)μmol·L-1、(14.05±0.21)μmol·L-1(Fig 1B)。

同时，根据MTT实验结果，选取了低浓度的PTL(1.25、2.5、5 μmol·L-1)处理H1975细胞，观察到PTL能在低浓度明显抑制H1975细胞集落的形成(P<0.05)，见Fig 1C、1D。

以
上结果表明，天然产物PTL对NSCLC细胞系H1975具有较强的抑制增殖作用，且呈现浓度和时间依赖性。

2.2 PTL对H1975细胞凋亡的影响采用Annexin V-FITC/PI双染，流式细胞仪检测PTL对H1975细胞凋亡的影响。

Fig 2结果显示，PTL(7.5、15、30 μmol·L-1)能明显诱导H1975细胞凋亡，凋亡率分别为(26.91±4.11)%、(41.43±6.36)%、(84.60±
3.51)%，随着给药浓度的增加，凋亡比例逐渐升高，与对照组相比，差异具有统计学意义(P<0.01)。

2.3 PTL对凋亡相关蛋白表达的影响不同浓度的PTL处理H1975细胞24 h后，
采用Western blot法检测Bcl-2、Bax、caspase-3蛋白表达的变化。

Fig 3结果显示，PTL可促进H1975细胞中促凋亡蛋白Bax表达，而减少抑凋亡蛋白Bcl-2
的表达，从而使Bax/Bcl-2的比例明显升高。

caspase家族蛋白为凋亡的执行者，PTL能明显使caspase-3蛋白发生裂解，从而诱导细胞发生凋亡。

Fig 1 Effects of PTL on proliferation of H1975 cells n=3)
A: The structure of PTL; B: Cytotoxic effect of PTL on H1975 cells for 24 h,
48 h, 72 h by MTT assay; C: Cell colonies significantly decreased with the increase of PTL concentration; D: Data analysis of C. *P<0.05, **P<0.01 vs control.
Fig 2 Effect of PTL on apoptosis of H1975 cells n=3)
A: PTL induced apoptosis in H1975 cells by flow cytometry; B: With the increase of PTL concentration, cell apoptosis rate gradually increased.
**P<0.01 vs control.
2.4 PTL对H1975细胞Akt、p-Akt蛋白表达的影响 Akt作为肿瘤细胞内
PI3K/Akt信号通路的关键蛋白，对肿瘤的生长、发展具有重要作用。

Fig 4的Western blot结果显示，PTL能明显降低H1975细胞内Akt蛋白及p-
Akt(Ser473)的表达(P<0.01)，从而抑制其信号通路的传导。

2.5 PTL对H1975细胞侵袭和迁移的影响采用Transwell小室法检测PTL对
H1975细胞侵袭和迁移能力的影响，通过统计穿透到小室下方的相对细胞数目，
可以反映出细胞侵袭和迁移能力的改变。

Fig 5结果表明，PTL(1.25、2.5、5
μmol·L-1)能明显抑制H1975细胞向下侵袭浸润生长，其48 h抑制率分别为(57.62±7.40)%、(71.77±5.54)%、(82.26±1.50)%，相比于对照组，差异均具有统计学意义(P<0.01)。

迁移实验结果表明，PTL能有效降低H1975细胞迁移能力，PTL(1.25、2.5、5 μmol·L-1)作用H1975细胞24 h后，抑制率分别为
(47.87±2.33)%、(57.65±6.84)%、(74.28±4.02)%，与对照组相比差异有统计学意义(P<0.01)。

Fig 3 Effects of PTL on expression level of Bcl-2, Bax, caspase-3 in H1975 cells by Western blot n=3)
*P<0.05, **P<0.01 vs control
Fig 4 Effects of PTL on expression levels of Akt, p-Akt (Ser473) in H1975 cells by Western blot n=3)
**P<0.01 vs control
Fig 5 Effects of PTL on invasion and migration of H1975 cells by Transwell assay (×200)
A: PTL significantly inhibited cell invasion and migration; B: Data analysis of
A n=3). **P<0.01 vs control.
2.6 PTL对H1975细胞HIF-1α和MMP-9蛋白表达的影响 Fig 6的Western
blot结果显示，随着浓度的增加，PTL能明显降低H1975细胞中MMP-9及
HIF-1α的表达(P<0.05)。

Fig 6 Effects of PTL on expression levels of HIF-1α, MMP-9 in H1975 cells
by Western blot n=3)
*P<0.05, **P<0.01 vs control
3 讨论
EGFR的激活与异常表达在肿瘤的发生、发展中有着重要作用。

在过去较长的一段时间内，针对EGFR为特定靶点的小分子抑制剂成为了晚期NSCLC患者的首选。

EGFR-TKI能特异性地抑制EGFR及其下游的信号通路，如PI3K/Akt，从而抑制
肿瘤细胞生长增殖，诱导凋亡。

但随着治疗的推进，患者大多会出现EGFR突变，继而产生耐药。

其中，EGFR的20号外显子790位甲硫氨酸置换苏氨酸密码子的突变，即T790M突变，约占EGFR突变类型的50%～60%，是肿瘤对EGFR-TKI 产生获得性耐药的重要原因[6]。

本研究中，H1975细胞是T790M突变型NSCLC 细胞株，因此，我们以其为研究对象，希望为NSCLC的治疗提供一定的研究基础。

我国中草药资源丰富，且几千年来形成了完整的中医理论，来指导中药的临床使用。

对于肿瘤的治疗，中药有其独特的作用。

中药中富含多种化学成分，已经成为抗肿瘤药物研发中发现先导化合物的重要来源。

其中，以和厚朴酚、姜黄素、雷公藤甲素等为代表的天然产物，具有良好的抗肿瘤活性，包括抑制肿瘤细胞增殖，诱导肿瘤细胞凋亡，逆转肿瘤细胞耐药等[7-9]，都已成为极具潜力的抗肿瘤新药。

事实上，目前已上市的抗肿瘤药物大多也都来自天然产物，包括紫杉醇、喜树碱、长春新碱等。

PTL作为一种天然产物，对多种肿瘤细胞具有很好的杀伤作用，但对于耐药NSCLC的研究未见报道，仍有较好的潜力，值得挖掘。

诱导肿瘤细胞发生凋亡是目前抗肿瘤药物研发的靶点之一。

凋亡是细胞程序性死亡，在维持细胞增殖与死亡的平衡中发挥重要作用，Bcl-2家族蛋白具有调控细胞凋亡
的功能，Bax/Bcl-2比值变化能够反映出细胞存活和凋亡的平衡关系。

细胞发生凋亡也需要一些酶的作用，其中caspase扮演着重要角色，一直成为人们的研究热点，而caspase-3的激活更是被认为是细胞发生凋亡的早期标志[10]。

本研究中，PTL能明显上调H1975细胞中促凋亡蛋白Bax水平，同时下调抑凋亡蛋白Bcl-2
水平，Bax/Bcl-2比例明显升高，使caspase-3蛋白被激活，发生裂解，从而诱
导H1975细胞发生凋亡。

Akt是肿瘤细胞重要信号通路PI3K/Akt中的关键分子，是整个PI3K/Akt信号通
路转导的核心。

Akt是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，多种生长因子、信号蛋白等，均可通过磷酸化Thr308和Ser473位点激活Akt，磷酸化的Akt通过调节下游相关分子，对肿瘤细胞的增殖、凋亡等过程具有重要作用。

研究表明，活化的Akt
可以磷酸化Bcl-2家族中促凋亡蛋白Bad，引起Bad与其伴侣蛋白(chaperone
14-3-3)结合，阻断Bad蛋白的促凋亡功能，并激活下游分子Bcl-2释放，从而抑制肿瘤细胞凋亡，也可直接磷酸化Bax蛋白，阻断其促凋亡作用[11]。

另外，caspase级联反应是凋亡发生的主要原因，其中，caspase-3作为凋亡的执行者，具有不可替代的作用，同样，Akt可磷酸化下游caspase-3、caspase-9等家族蛋白，使其失活，抑制其促凋亡作用[12]。

本研究Western blot结果表明，PTL能
明显降低H1975细胞内Akt、p-Akt(Ser473)蛋白水平，有效抑制Akt蛋白的活化，从而抑制其下游信号通路的转导，发挥促凋亡作用。

同时，大量研究表明，PI3K/Akt信号通路在肿瘤细胞转移过程中也有着重要的作用。

通过PI3K/Akt信号通路激活Akt，活化的Akt可通过下游的雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)，直接激活下游的HIF-1α，启动血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)基因的转录，促进VEGF蛋白生成，增加肿瘤组织血供，促进肿瘤细胞转移[13]。

此外，活化的Akt
能上调基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)的表达，特别是上
调MMP-2、MMP-9 mRNA和蛋白水平，参与细胞外基质的降解，促进肿瘤细胞侵袭和迁移[14]。

本研究Transwell实验结果显示，PTL能明显抑制H1975细胞侵袭和迁移，同时Western blot实验结果表明，PTL能明显下调H1975细胞HIF-1α和MMP-9的表达，从而抑制H1975细胞发生转移。

综上所述，天然产物PTL能明显诱导NSCLC细胞株H1975发生凋亡，同时抑制其侵袭和迁移，机制可能与PI3K/Akt信号通路中关键分子Akt被抑制有关，从而调节下游靶蛋白Bcl-2、Bax、caspase-3、HIF-1α及MMP-9的表达，发挥抗肿瘤作用。

本研究为天然产物PTL的临床使用提供了一定的实验基础，但是作为有潜力的抗肿瘤新药，其体内的抗肿瘤作用及相应的毒副作用仍需要进一步研究。

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