3种重金属对斑马鱼的联合毒性及迷迭香酸的保护作用研究

收稿日期：２０１９０２２０ 基金项目：山东省科技发展计划资助项目（２０１４ＧＨＹ１１５０１０）；泰山学者建设工程专项（ｔｓｈｗ２０１５０２０４６）． 通信作者：许波（ｘｕｂｏ１６３＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ），副教授，博士，从事海洋天然生物活性物质分离及活性筛选和海洋环境毒理的研究．
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烟台大学学报（自然科学与工程版）
54烟台大学学报自然科学与工程版第33卷表4cu2和pb2对斑马鱼胚胎联合作用实验数据的回归分析结果tab4lc50anditsconfidenceintervalofcu2andpb2tozebrafishembryos重金属直线回归方程相关系数r96hpflc50mgl195置信区间安全浓度gl1cu2pb2cu2p0958x009109292735119136972735pb2p1117x1800094611380580686152865113805215重金属cd2pb2cu2的联合急性毒性实验对联合毒性的概率单位浓度对数值进行线性回归分析表5cd2cu2和pb2共存时对斑马鱼胚胎96hpflc50分别为13470mgl3551mgl40410mgl计算可得ai为0005其联合毒性表现为协同作用
３种重金属对斑马鱼的联合毒性及 迷迭香酸的保护作用研究
宋明霞，陈天荣，钱豪文，许 波
（烟台大学生命科学学院线粒体健康与衰老研究中心，烟台大学，山东 烟台 ２６４００５）
摘要：对氯化镉、硝酸铅、硫酸铜 ３种重金属单一以及联合情况下对早期斑马鱼胚胎发育 毒性的影响进行考察，并采用不同浓度的迷迭香酸进行干预，同时观察 ９６ｈｐｆ胚胎的死亡 率和孵化率．Ｃｄ－Ｐｂ、Ｃｄ－Ｃｕ、Ｐｂ－Ｃｕ、Ｃｄ－Ｐｂ－Ｃｕ对斑马鱼胚胎的毒性作用类型分别 为协同作用、协同作用、拮抗作用、协同作用．６０μｍｏｌ／ＬＲＡ对斑马鱼胚胎死亡、幼鱼畸形 及胚胎孵化率无明显影响．Ｃｄ２＋ －Ｐｂ２＋ －Ｃｕ２＋联合处理，胚胎死亡率明显上升，６０μｍｏｌ／ ＬＲＡ与 Ｃｄ２＋ －Ｐｂ２＋ －Ｃｕ２＋联合处理，胚胎死亡率降低约 ２０％（Ｐ＜００１）；胚胎凋亡细胞 数目明显减少，Ｂｃｌ－２／Ｂａｘ的基因表达水平明显上调（Ｐ＜０．０１），Ｃａｓｐａｓｅ３基因表达下调 （Ｐ＜００５）．表明 ＲＡ对 Ｃｄ２＋ －Ｐｂ２＋ －Ｃｕ２＋的联合毒性具有保护作用，其机制可能与上调 Ｂｃｌ－２／Ｂａｘ，降低 Ｃａｓｐａｓｅ３基因表达，减少胚胎细胞凋亡有关． 关键词：斑马鱼；重金属联合毒性；迷迭香酸；凋亡 中图分类号：Ｓ９１７４ 文献标志码：Ａ
第 ３３卷
数次，转移到 ２８５℃恒温培养箱中培养，及时移除 未受精和死卵并换水，未受精的卵或死卵呈白色，正 常胚胎呈透明状． １２ 实验药品
ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＳＯ４、ＣａＣｌ２、ＣｄＣｌ２、ＣｕＳＯ４ 购 自 天 津瑞金特；Ｐｂ（ＮＯ３）２ 购自国药集团化学试剂有限 公司；０２５％ ＥＤＴＡ胰 蛋 白 酶 细 胞 消 化 液、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ－ＦＩＴＣ／ＰＩ细胞凋亡检测试剂盒购自碧云天生物 技术有限公司；胶原蛋白酶Ⅱ购自 Ｓｏｌａｒｂｉｏ；胎牛血 清购自浙江天杭生物科技股份有限公司；迷迭香酸 （ＲＡ）购 自 ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，荧 光 定 量 试 剂 盒 ＳＹＢＲ ｐｒｅｍｉｘＥｘＴａｑＴＭⅡ、逆转录试剂盒 （Ｐｒｉｍｅ ｓｃｒｉｐｔＴＭ ＲＴｒｅａｇｅｎｔｋｉｔ）均购自 Ｔａｋａｒａ公司． １３ 实验仪器与设备
水环境是各种污染物的综合受体，其中重金属 污染物会在生物体内富集，最终通过食物链富集到 人体内，对人体产生致畸、致癌、致突变的作用．城市 污水是工业废水和生活污水的混合体，被多种重金 属污染的水体会发生复杂的联合毒性效应［１］．
迷迭香酸（Ｒｏｓｍａｒｉｎｉｃａｃｉｄ）是一种具有多种生 物活性的天然水溶性酚类化合物，广泛存在于迷理活性，如抗菌抗病毒、抗炎及免疫调节、保护 神经系统、抗辐射抗肿瘤、抗氧化及清除自由基、抑 制黄嘌呤氧化酶、保肝护肺等［２－６］．
１ 材料与方法
１１ 实验动物 ＡＢ系斑马鱼由北京大学张博教授惠赠，由本实
验室繁育 保 种，成 年 斑 马 鱼 饲 养 于 独 立 养 殖 单 元 （北京爱 生），水 温 ２８５±０５℃，盐 度 ４５０～５００ μＳ，ｐＨ值 ７０，光照周期为 １４ｈ／１０ｈ（明 ／暗）交替 循环．每日早晚各饲喂一次新鲜孵化的丰年虾．收集 的卵置于平 板 培 养 皿 中，去 除 死 卵、粪 便 和 其 他 杂 物，用 Ｅ３（０１７ｍｏｌ／ＬＫＣｌ，５ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ，０３３ ｍｍｏｌ／ＬＭｇＳＯ４，０３３ｍｍｏｌ／ＬＣａＣｌ２，ｐＨ值 ７４）洗涤
斑马鱼（Ｄａｎｉｏｒｅｒｉｏ）属于辐鳍亚纲（Ａｃｔｉｎｏｐｔｅｒｙ ｇｉｉ）鲤科（Ｃｙｐｒｉｎｉｄａｅ）短担尼鱼属 （Ｄａｎｉｏ），是生物 医学和毒理学模型的最佳的模式生物之一［７－１１］．本
实验以斑马鱼作为实验动物，探索多种重金属联合 诱导斑马鱼发育毒性特性，研究天然抗氧化剂迷迭 香酸对重金属致斑马鱼胚胎细胞凋亡的保护作用．
第 ３３卷第 １期 ２０２０年 １月
烟台大学学报（自然科学与工程版）
ＪｏｕｒｎａｌｏｆＹａｎｔａｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（ＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＥｄｉｔｉｏｎ）
Ｖｏｌ．３３Ｎｏ．１ Ｊａｎ．２０２０
文章编号：１００４８８２０（２０２０）０１００４３０６
ｄｏｉ：１０．１３９５１／ｊ．ｃｎｋｉ．３７１２１３／ｎ．２０２０．０１．００６
ＳｔｅｐＯｎｅｐｌｕｓ荧光定量 ＰＣＲ仪为 ＡＢ公司产 品；ＡＥ３１型 荧 光 倒 置 显 微 镜 为 Ｍｏｔｉｃ公 司 产 品； ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｐａｒａｄｉｇｍ ＭｕｌｔｉＭｏｄｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｐｌａｔ ｆｏｒｍ型多功能酶标仪为 Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｄｅｖｉｃｅｓ公司产品； ＳＭＺ８００型 体 视 显 微 镜 为 Ｎｉｋｏｎ公 司 产 品；ＨＣ－ ３０１８Ｒ型高 速 冷 冻 离 心 机 为 安 徽 中 科 公 司 产 品； ＡＣＡＥＮｏｖｏＣｙｔｅＴＭ系列流式细胞仪为 ＡＣＥＣＢｉｏｓｃｉ ｅｎｃｅｓ公司产品；斑马鱼养殖系统为北京爱生产品； 体式显 微 镜 为 南 京 江 南 永 新 光 学 有 限 公 司 产 品； ＰＨＳ－３Ｃ型 ＰＨ计为上海精密科学仪器有限公司产 品；６孔细胞培养板． １４ 毒性实验 １４１ 胚胎染毒实验 参照文献［７］方法，收集受精 后 ２ｈ（２ｈｐｆ）斑马鱼胚胎，置于 ６孔细胞培养板中， ３０枚 ／孔．每孔分别加入含有不同测试样品 Ｅ３溶液 ３ｍＬ，另设只加 Ｅ３培养液孔作为正常对照，每处理 组设 ３个平行复孔．将培养板置于 ２８５℃恒温光照 培养箱内，每 ２４ｈ更换新培养液，以卵黄凝结、心跳 停止为胚胎死亡终点，记录各组胚胎死亡情况，及时 吸掉死亡胚胎．至 ９６ｈｐｆ胚胎完全孵化后，观察畸形 幼鱼数量并拍照记录．统计 ２４，４８，７２和 ９６ｈｐｆ时的 死亡数，计算 ９６ｈｐｆ胚胎死亡率．