干扰载体构建SOP

shRNA干扰载体构建SOP

目录

第一部分RNA干扰原理及shRNA设计 2

第二部分酶切与回收 6

第三部分退火与连接7

第四部分转化与涂平板9

第五部分挑菌与菌液PCR 11

第六部分质粒提取13

第一部分RNA干扰原理及shRNA设计

标准操作规程（SOP）

1.目的：

了解RNA干扰原理，设计shRNA干扰序列

2.仪器与设备：

需要能够连接Internet的个人计算机，引物设计相关软件（如Primer Premier 5）.

3.操作步骤

3.1RNA干扰原理

1)RNAi概述：RNA干扰（RNA interference，RNAi）是指在进化过程中高度保守的、由双

链RNA（double—stranded RNA,dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。简单的说是指一种分子生物学上由双链RNA诱发的基因沉默现象.当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默，是一种特异性的转录后基因沉默（post-transcriptional gene silencing).由于RNAi具有高度的序列专一性和有效的干扰，可以特异地将特定的基因沉默，从而获得基因功能丧失或基因表达量的降低，因此可以作为功能基因组学的一种强有力的研究工具。RNAi技术可广泛应用到包括功能学，药物靶点筛选，细胞信号传导通路分析，疾病治疗等等。

2)RNAi原理:RNA干扰包括起始阶段和效应阶段（inititation and effector steps）。在起始阶

段，小分子RNA被切割为21—23核苷酸长的小分子干扰RNA片段(small interfering RNAs, siRNAs).证据表明;一个称为Dicer的酶，是RNase III家族中特异识别双链RNA的一员,它能以一种ATP依赖的方式逐步切割由外源导入或者由转基因,病毒感染等各种方式引入的双链RNA，形成19-21bp的双链RNAs(siRNAs),每个片段的3’端都有2个碱基突出。在RNAi效应阶段，siRNA双链结合一个核酶复合物从而形成所谓RNA诱导沉默复合物(RNA—induced silencing complex，RISC）。激活RISC需要一个ATP依赖的将小分子RNA 解双链的过程。激活的RISC通过碱基配对定位到同源mRNA转录体上，并在距离siRNA 3’端12个碱基的位置切割mRNA。尽管切割的确切机制尚不明了，但每个RISC都包含一个siRNA和一个不同于Dicer的RNA酶。

3)RNAi示意图（见图1）

3.2shRNA设计

1)shRNA：即short hairpin RNA(短发卡RNA），包含两个短反向重复序列(其中一个与目

的基因互补)，中间由一个loop序列分隔，组成发夹结构。shRNA在体内可以被加工成siRNA从而降解目的基因..示意图见图2。

2)shRNA作用原理：见图3。

3)shRNA设计原则：

●克隆到shRNA表达载体中的shRNA包括两个短反向重复序列，中间由一茎环(loop）

序列分隔的，组成发夹结构，由polⅢ启动子控制.随后在连上5—6个T作为RNA

聚合酶Ⅲ的转录终止子；

●两个互补的寡核苷酸两端须带有限制性酶切位点；

●StrataGENE发现29个寡核苷酸较之原先推荐的23个寡核苷酸可以更有效的抑制目

的基因；

●在启动子下游的酶切位点下方紧连一个C，使插入片段和启动子有一定空间间隔以

确保转录的发生;

●shRNA目的序列的第一个碱基必须是G以确保RNA聚合酶转录。如果选择的目的序

列不以G开头，必须在紧连正义链的上游加一个G；

●ShRNA插入片段中的茎环应当靠近寡核苷酸的中央.不同大小和核苷酸序列的茎环

都被成功的运用过.其中包含一个独特的限制性酶切位点的茎环利于检测带有

shRNA插入片段的克隆。在比较了众多不同长度和序列的茎环,5’TCAAGAG3'序列

最为有效（AMBION use）；

●5—6个T必须放置在shRNA插入片段尾部以确保RNA聚合酶III终止转录（stop)；

●在正义链和反义链序列上不能出现连续3个或以上的T，这可能导致shRNA转录的

提前终止;

●从转录本（mRNA）的AUG起始密码开始，寻找“AA或者NA"二连序列，并记下其

3’端的19个碱基序列，作为潜在的siRNA靶位点.正义链和反义链都采用这19个

碱基(不包括AA或者NA重复)来设计。

图1 RNAi原理

图2 shRNA示意图图3 shRNA作用原理

4)shRNA设计举例

●以人源基因VEGFC为例，选取干扰靶点序列为：GCCGATGCATGTCTAAACT

●在该序列两端加上酶切位点，中间插入Loop环，设计shRNA片段：

BamH I 靶点序列环结构靶点反义序列Hind III

GATCC GCCGATGCATGTCTAAACT TTCAAGAGA AGTTTAGACATGCATCGGCTTTTTT A

G CGGCTACGTACAGATTTGA AAGTTCTCT TCAAATCTGTACGTAGCCGAAAAAA TTCGA

●正反向Oligo序列分别为：

H—VEGFC—sh—F：

5’—GATCC GCCGATGCATGTCTAAACTTTCAAGAGAAGTTTAGACATGCATCGGCTTTTTT A-3’

H-VEGFC-sh—R：

5’—AGCTT AAAAAAGCCGATGCATGTCTAAACTTCTCTTGAAAGTTTAGACATGCATCGGC G—3’将该Oligo片段正反向一起混合退火后，即可直接与载体进行连接,构建shRNA干扰载体。