SDS-PAGE自制胶操作规程

SDS-PAGE自制胶操作规程
一：试剂准备
SDS-PAGE电泳所用溶液：
30 %聚丙烯酰胺溶液(100 mL)
丙稀酰胺(Arc)29.2g，N-N-甲叉双丙稀酰胺(Bis)0.8g，加入去离子水定容至100mL，过滤于棕色玻璃瓶中4℃贮存。

将商品用的40 %聚丙烯酰胺溶液稀释到浓度为30 %，冰箱4℃保存。

分离胶缓冲液1.5mol/L Tris·HCl，pH8.8：23.23gTirs碱，溶于80mL去离子水中，加入盐酸调节pH值至8.8，定容至150mL。

浓缩胶缓冲液0.5mol/L Tris·HCl，pH6.8： 6.0gTirs碱，溶于60mL去离子水中，加入盐酸调节pH值至6.8，定容至100mL。

10％SDS：2gSDS溶于去离子水中，定容至20mL，加热至68℃助溶。

10％过硫酸铵：0.1g过硫酸铵，溶于1mL去离子水中；现配现用或分装冷冻备用。

TEMED(N-N-N`-N`－四甲基乙二胺)原液，室温保存。

1×Tris-甘氨酸缓冲液(1 L)
Tris碱 3.03
甘氨酸(电泳级) 14.4g
SDS 1g
2×SDS凝胶还原型加样缓冲液(5mL)
0.25 mol/L Tris-Cl (pH 6.8) 1 mL
SDS 0.25g
甘油0.189g
β-巯基乙醇 2.5ml
(DTT（二硫苏糖醇）0.385g
溴酚兰0.001g
双蒸水定容到5ml
考马斯亮蓝染色液
考马斯亮蓝R-250 1.0g
甲醇450 mL
冰醋酸100 mL
ddH2O 450 mL
考马斯亮蓝脱色液（甲醇脱色液效果好，但有毒性）
450mL乙醇（甲醇）450mL
冰醋酸100mL
ddH2O 450mL
PH7.4PBS（0.01M）1L
KH2PO4 1 mL
Na2HPO40.25g
NaCl 0.189g
KCl 2.5ml
二：凝胶配置
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1．将短玻璃板放在带有边条的长玻璃板上，做成玻璃板夹心。

玻璃板应保持干燥洁净。

2．将玻璃夹心放入灌胶架，短玻璃板冲前。

两块玻璃板底部齐平。

3．锁紧夹子（绿色），夹紧玻璃板夹心，做成灌胶模块。

4．把灰色的橡胶垫放在灌胶架底部，将灌胶模块放在灰色的胶垫上，灌胶架上部一透明夹子，用此夹子夹住长玻璃板。

5．配制凝胶，以下为常用的SDS-PAGE凝胶体系
分离胶:
12% 15%
H2O 3.4 ml 2.4 ml
1.5 M Tris-HCl, pH 8.8
2.5ml 2.5 ml
10% (w/v) SDS 0.1 ml 0.1 ml
30 %聚丙烯酰胺溶液 4.0 ml 5.0 ml
10% (w/v) (APS) 0.05 ml 0.05 ml
TEMED 0.005ml 0.005ml
浓缩胶(5%):
H2O 2.8 ml
0.5 M Tris-HCl, pH 6.8 1.25 ml
10% (w/v) SDS 0.050 ml
30 %聚丙烯酰胺溶液0.9 ml
10% (w/v) (APS) 0.025ml
TEMED 0.004 ml
先按顺序加入各项试剂配好分离胶后，倾斜模具，灌胶至距离梳齿下端0.5-1cm处，从两端用去离子水缓慢压平，放置到37℃恒温箱半个小时凝胶后，倒掉去离子水，残余的水用滤纸条吸干净；再按顺序加入各项试剂配制浓缩胶，灌满模具缓慢插入梳子，注意不要产生气泡。

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6．凝胶凝固后，取出梳子，加入准备好的样品。

把玻璃板夹心（凝胶）从灌胶架上取下。

7．把玻璃板夹心放入电泳架，短玻璃板面冲里，做成电泳模块。

8．把电泳模块完全插入电泳架。

9．合上电泳架上的密封夹。

如只跑一块胶，在另一侧放入随仪器配的挡板；在装配的过程中，会觉得很紧，为正常现象。

10．将整个装配好的电泳架放入电泳槽。

11．样品处理以干扰素为例：
离心菌种：
离心后的菌体，加入200ul的PH7.4的PBS溶解，超声清洗仪内超声20min后冻存于
-20℃冰箱，如此反复三次后取20μl加入2*还原型上样缓冲液20μl，混匀沸水水浴十分钟，上样10ul每孔。

发酵离心菌体，发酵下罐离心菌体：
离心后的发酵液，加入原始体积7倍的PH7.4的PBS溶解，超声破碎仪内超声10min （超声一秒停顿五秒）后，取20μl加入2*还原型上样缓冲液20μl，混匀沸水水浴十分钟，上样10ul每孔。

下罐离心菌体：
离心后的菌体，于电子天平内精密称量0.1±0.01g,加入3.5ml的PH7.4的PBS溶解，超声破碎仪内超声10min（超声一秒停顿五秒）后，取20μl加入2*还原型上样缓冲液20μl，混匀沸水水浴十分钟，上样10ul每孔。

包涵体，洗涤包涵体：
于电子天平内精密称量0.02-0.03g包涵体,加入1ml的8M的尿素溶解，若不溶解可滴加6M的NaOH促进溶解，溶解后的包涵体用8M的尿素稀释6倍后，取20μl加入2*还原型上样缓冲液20μl，混匀沸水水浴十分钟，上样10ul每孔。

12．加入电泳液，内槽加入新配制电泳液，外槽为循环用电泳液，内槽没过短玻璃板，外槽按照电泳槽的上的指示加至合适的刻度。

13．盖上电泳槽的盖子，将电泳电极和电泳仪相连接，正极对正极，负极对负极（红对红，黑对黑）。

14．在电泳仪上设定电泳电压或电流，开始电泳。

一般进行SDS-PAGE一块胶电泳时可使用11mA 恒流浓缩、22mA恒流分离的电流体系，大约60min 能完成电泳；进行SDS-PAGE两块胶电泳时可使用20mA 恒流浓缩、40mA恒流分离的电流体系，大约60min 能完成电泳，具体条件根据样品摸索。

15．电泳完成后，关闭电泳仪，拔出电极线。

16．打开盖子，取出电泳模块，打开密封夹，取出玻璃板（凝胶）。

轻轻用撬胶板（绿色）撬开玻璃板，让凝胶滑入染色液中。

17．清洗电泳槽，玻璃板。

注意：丙烯酰胺为神经毒剂，电泳操作全部过程应戴PE手套操作！
四：常见问题
Q：提高SDS-PAGE电泳分辨率的途径？
A：1、聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝胶的分辨率。

建议做法：待凝胶在室温凝固后，可在室温下放置一段时间使用。

忌即配即用或4℃冰箱放置，前者易导致凝固不充分，后者可导致SDS结晶。

一般凝胶可在室温下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。

Q：“微笑”（两边翘起中间凹下）形带原因？
A：主要是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致，多出现于较厚的凝胶中。

处理办法：待其充分凝固再作后续实验。

Q：“皱眉”（两边向下中间鼓起）形带原因？
A：主要出现在蛋白质垂直电泳槽中，一般是两板之间的底部间隙气泡未排除干净。

处理办法：可在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡。

Q：为什么带出现拖尾现象？
A：主要是样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。

处理办法：加样前离心；选择适当的样品缓冲液，加适量样品促溶剂；电泳缓冲液时间过长，重新配制；降低凝胶浓度。

Q：为什么带出现纹理现象？
A：主要是样品不溶性颗粒引起的。

处理办法：加样前离心；加适量样品促溶剂。

Q：什么是“鬼带”，如何处理？
A：―鬼带‖就是在跑大分子构象复杂的蛋白质分子时，常会出现在泳道顶端（有时在浓缩胶中）的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀，主要由于还原剂在加热的过程中被氧化而失去活性，致使原来被解离的蛋白质分子重新折叠结合和亚基重新缔合，聚合成大分子，其分子量要比目标条带大，有时不能进入分离胶。

处理办法：在加热煮沸后，再添加适量的DTT或β-巯基乙醇，以补充不足的还原剂；或可加适量EDTA来阻止还原剂的氧化。

Q：为什么溴酚蓝不能起到指示作用？
A：我们在实验中常会遇到溴酚蓝已跑出板底，但蛋白质却还未跑下来的现象。

主要与缓冲液和分离胶的浓度有关。

处理办法：更换正确pH值的Buffer；降低分离胶的浓度。

Q：为什么电泳的条带很粗？
A：电泳中条带很粗是常见的事，主要是未浓缩好的原因。

处理办法：适当增加浓缩胶的长度；保证浓缩胶贮液的pH正确（6.8）；适当降低电压；
Q：为什么电泳电压很高而电流却很低呢？
A：这种现象一般初学者易出现。

比如电压50v以上，可电流却在5mA以下。

主要是由于电泳槽没有正确装配，电流未形成通路。

包括：a.内外槽装反；b.外槽液过少；
处理办法：电泳槽正确装配即可。

Q：浓缩胶与分离胶断裂、板间有气泡对电泳有影响吗？
A：前者主要原因是拔梳子用力不均匀或过猛所致；后者是由于在解除制胶的夹子后，板未压紧而致空气进入。

一般对电泳不会有太大的影响。

五：灰度扫描及计算
打开桌面上的Gel-Pro Analyzer软件File—open打开需要处理的凝胶图片
转换图片为灰色图片并放大Convert to—Gray Scale Zoom—Zoom 25%
点击上方工具栏里的Image enhancement调节凝胶图片的背景及条带至合适程度
点击上方工具栏里的View 1D-Gel ToolBar—单击Lanes/Bands
单击Add Lanes—移动鼠标添加所要处理的泳道—添加完毕后单击OK
鼠标移至泳道上端和下端，拉动上下边缘将泳道调节至合适长度；鼠标移至泳道左端和右端，拉动左右边缘将泳道调节至合适宽度，将所有条带和每一条带的每一部分都包括进去
单击Delete Bands –鼠标箭头移动至所要删除的条带后变为十字光标—单击删除条
带---完毕后点击Ok
毕后点击Ok
Baseline—Filtered Profile后—在弹出的对话框中输入基线参数，一般为0-50
移动Lane Profile 图片中黑色框两端，将对应的条带包括进去至合适程度（移动杂带的两端使计算时尽量少的计算背景面积）
调节条带完毕后，点击1DGel栏中的Mass/IOD--点击左下角的
Amounts/Mol.Weights—选中IOD—用目的蛋白的面积值除去该泳道中所有蛋白的峰
面积值即目的蛋白纯度。