如何进行病原菌的分离

如何进行病原菌的分离
如何进行病原菌的分离、纯培养
材料用具
菌种：米曲酶枯草芽孢杆菌大肠杆菌金黄色葡萄球白地霉蕈状芽孢杆菌（Bacillus mycoides）粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）巴氏芽孢梭菌（巴氏固氮梭状芽孢杆菌，Clostridum pasteurianum）荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）灰色链霉菌（Streptomyces griseus）酿酒酵母产黄霉菌（Penicillium chrysogenum）
培养基：淀粉琼脂培养基牛肉膏蛋白胨培养基(斜面、液体、半固体) 马丁氏琼脂培养基查氏琼脂培养基庖肉培养基肉汤培养基马铃薯培养基麦芽汁酵母膏培养基
溶液或试剂：10%酚，盛9ml无菌水的试管，盛90ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶，4%水琼脂，10%NaOH,灭菌的石蜡凡士林（1：1），焦性没食子酸，液体石蜡，甘油，五氧化二磷，河沙，瘦黄土或红土，95%乙醇，10%盐酸，无水氯化钙，食盐，干冰。

仪器或其他用具：无菌玻璃涂棒，无菌吸管，接种环，无菌培养皿，链霉素和土样，显微镜，血细胞计数板，接种针，酒精灯，棉花，厌氧罐，催化剂，产气袋，厌氧指示袋，无菌的带橡皮塞的大试管，无菌的玻璃板（直径比培养皿大3至4cm），滴管，烧瓶，小刀。

微生物的分离与纯化：
一、基本原理
从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。

常用的方法有
1.简易单细胞挑取法：它需要特制的显微操作器或其他显微技术，因而其使用受到限制。

简易单孢子分离法是一种不需显微单胞操作器，直接在普通显微镜下利用低倍镜分离单孢子的方法。

它采用很细的毛细管吸取较稀的萌发的孢子悬浮液滴在培养皿盖的内壁上，在低倍镜下逐个检查微滴。

将只含有一个萌发孢子的微滴放一小块营养琼脂片，
使其发育成微菌落。

再将微菌落转移到培养基中，即可获得仅由单个孢子发育而成的纯培养。

2.平板分离法：该方法操作简便，普遍用于微生物的分离与纯化。

其原理包括两方面;
选择适合于待分离微生物的生长的生长条件，如营养、酸碱度、温度和氧等要求或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。

微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落可以是由一个细胞繁殖而成的集合体。

因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。

获取单个菌落的方法看通过稀释涂布平板或平板划线等技术来完成。

值得指出的是从微生物群体中经分离生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。

因此，纯培养的确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定，有些微生物的纯培养要经过一系列的分离与纯化过程和多种特征鉴定方能得到。

土壤是微生物生活的大本营，它所含微生物无论是数量还是种类都是极其丰富
的。

因此土壤是微生物多样性的重要场所，是发迹微生物资源的重要基地，可以从中分离、纯化得到许多有价值的菌株。

本论文采用三种不同的培养基从土壤中分离不同类型的微生物。

方法与操作步骤：
稀释涂布平板法
（1）倒平板：将肉膏蛋白胨琼脂培养基、高氏I号琼脂培养基、马丁琼脂培养基加热溶化，待冷至55~60℃时，马氏I号琼脂培养基中加入10%酚数滴，马丁氏培养基中加入链霉素溶液（终浓度30ug/ml），混均匀后分别倒平板，每种培养基倒三皿。

倒平板的方法：右手持盛培养基的试管或三角瓶置火焰旁边，用左手将试管塞或瓶塞轻轻的拔出，试管或瓶口保持对着火焰；然后用右手手掌边缘或小指与无名指夹住管（瓶）塞。

左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝，快速倒入培养基大约15ml，加盖后轻轻地摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面上，待
凝后即为平板。

（2）制备土壤稀释液：称取土样10g，放入90ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，振荡摇20min,使土样与水分充分混合，将细胞分散。

用一支1ml无菌吸管从中吸取1ml土壤悬浮液加入盛有9ml无菌水的大试管中充分混合，然后用无菌吸管从此试管中吸取1ml加入另一盛有9ml无菌水的试管中，混合均匀，以此类推制成1/10、1/100、1/1000、1/10000、1/100000、1/1000000不同稀释度的土壤溶液。

（3）涂布：将上述每种培养基的三个培养底面分别用记号笔写上1/10000、1/100000、1/1000000三种稀释度，然后用无菌吸管分别由1/10000、1/100000、1/1000000三管土壤稀释液中各吸取0.1ml 对号放入已写好稀释度的平板中，用无菌玻璃涂棒来回刮动，在培养基表面轻轻的涂布均匀，室温下静置5~10min，使菌液吸附进培养基。

平板涂布方法：将0.1ml菌悬浮液小心的滴在平板培养基表面中央位置。

右手拿无菌涂棒平放在平板培养基表面上，将菌悬浮液先沿一条直线轻轻的来回推动，使之分布均匀，然后改变方向沿着另一垂直线来回推动，平板内边缘处可改变方向涂棒再涂布几次。

（4）培养:将高氏I号培养基平板和马丁氏培养基平板倒置于28℃温室中培养3～5天，肉膏蛋白胨平板倒置于37℃温室中培养2～3天。

（5）挑菌落：将培养后长出的单个菌落分别取少许细胞接种到上述三种培养基的斜面上，分别置28℃和37℃温室培养，待菌苔长出后，检查其特征是否一致，同时将细胞涂片染色后用显微镜检查是否为单一的微生物。

若发现有杂菌，需再一次进行分离、纯化，直到获得纯培养。

3.平板划线分离法
（1）倒平板：按稀释涂布平板法倒平板，并用记号笔标明培养基名称、土样编号和实验日期。

（2）划线：在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环，挑取上述1/10的土壤悬浮液一环在平板上划线，划线的方法很多，但无论采用哪种方法，其目的都是通过划线将样品在平板上进行稀释，使之形成
单个菌落。

常用的划线方法有下列二种：
①用接种环以无菌操作挑取土壤悬浮液一环，先在平板培养基的一边作第一次平行划线3～4条，再转动培养皿约70°角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后
通过第一次划线部分作第二次平板划线，再用同样的方法通过第二次划线部分作第三次平行划线作第四次平行划线。

划线完毕后，盖上培养皿盖，倒置于温室培养。

②将挑取有样品的接种环在平板培养基连续划线。

划线完毕后，盖上培养皿盖，倒置于温室培养。

（3）挑菌落:同稀释涂布平板法，一直到分离的微生物认为纯化为止。

4.简易单孢子分类法
（1）后壁磨口毛细滴管的制备：截取一段玻璃管，在火焰上烧红所要拉细的区域，然后用钳子夹住其尖端，在火焰上拉成很细的毛细管。

从尖端适当的部位割断，用砂轮或砂纸细湿器，使管口平整、光滑。

（2）分离小室的准备：取无菌水培养皿（D9ml）倒入10ml4%水琼脂作保湿剂。

在皿盖上用记号笔画小方格。

待凝后倒置于37℃恒温箱中烘数小时，使皿盖干燥。

（3）萌发孢子悬液的制备：
①孢子悬液的制备：用接种环挑取米曲霉孢子数环接入盛有10ml 查氏培养液及玻璃珠的无菌三角瓶中，振荡5～10min,使孢子充分分散开。

②过滤:用无菌漏斗或自制的过滤装置将上述充分分散开的孢子液过滤，收集过滤液。

③孢子萌发：将孢子过滤液用血球计数板测定孢子的浓度，再用查氏培养液调整孢子液至0.5～1.5*1000000个孢子/毫升后置28℃培养8h。

④点样：用无菌自制的后壁磨口毛细滴管吸取萌发孢子液少许，快速轻巧地点在培养皿的内壁的方格内中，每微滴面积要小于显微镜
低倍镜的视野，依次将每方格点上萌发孢子液，成为分离小室。

最后将皿盖小心快速翻过来，盖在原来的平板上。

⑤镜检：将点样的分离小室平板放在显微镜镜台上，用低倍镜逐个检查皿盖内壁上的微滴。

如果观察到某微滴只有一个萌发孢子时用记号笔在皿盖上作上标记。

⑥加薄片培养基：取少量查氏琼脂培养基倒入无菌培养皿中制成薄层平板，待其凝固后用无菌小刀片将琼脂砌成若干小片，然后挑一小片放在作有标记的单孢子微滴上，其他依次进行，最后盖好皿盖。

⑦培养：将分离小室平板置28℃培养24h，直至单孢子形成微菌落。

⑧转种：用无菌微型小刀小心的挑取长有微菌落的琼脂薄片移至新鲜的查氏培养基斜面或液体培养中，置28℃培养4～7h。

即可获得由单孢子发育形成的纯培养。

微生物的培养特征
一、基本原理
微生物的培养特征是指微生物在固体培养基上、半固体和液体培养基中生长后所表现出的群体形态特征，不同的微生物有其固有的培养特征，这些特征一般用固体、半固体和液体培养基来进行检查。

固体培养基又分平板和斜面两种形式，在平板上主要观察菌落表面结构、形态及边缘等的状况。

它们培养在斜面培养基上，可以呈丝线状、刺毛状、念珠状、树枝状等等，生长在液体培养基内，可以呈混浊、粘液状、形成菌膜、上层清晰而底部沉啶状，穿刺培养在半固体培养基中,可以沿着接种线向四周蔓延或仅沿线生长，也可上层生长很好，甚至连成一片，底部很少生长或底中长得好，上层甚至不生长。

微生物培养特征还包括菌苔的颜色、表面光滑度、基质是否产生水溶性色素等等。

培养特征可以作为微生物
分类鉴定的特征之一，并能为识别纯培养是否被污染作为参考。

检测微生物的培养基特征时，接种和培养过程中必须保证不被其他微生物所污染，因此。

除工作环境要求尽可能地避免或减少杂菌污染外，熟练地掌握各种无菌操作技术是很重要的。

二、方法与步骤
1、斜面接种：
（1）在肉膏蛋白胨斜面试管上用记号笔标明待接种的菌种名称、株号、日期和接种种者。

（2）点燃酒精灯或煤气灯。

（3）将菌种试管和待接种的斜面试管，用大拇指和食指、中指、无名指握在左手中，试管底部放在手掌内并将中指夹在两试管之间，使斜面向上呈水平状态，在火焰边用右手松开试管塞以利于接种时拔出。

（4）右手拿接种环通过火焰烧灼灭菌，在火焰边用右手的手掌边缘和小指，小指和无名指分别夹持棉塞将其取出，并迅速烧灼管口。

（5）将灭菌的接种环伸入菌种试管内，先将环接触试管内壁或未长菌的培养基，使接种环的温度下降退出接种试管，迅速伸入待接种的斜面试管，用环在斜面上自试管底部向上端轻轻的划一条直线。

（6）接种环退出斜面试管，再用火焰烧灼管口，并在火焰边将试管塞上。

将接种环逐渐接近火焰再烧灼，如果接种环上沾的菌体较多时，应先将环在火焰边烘干，然后烧灼，以免未烧死的菌种飞溅出污染环境，接种病原菌时更要注意此点。

2、液体培养基接种：
向肉膏蛋白胨液体培养基中接种少量菌体时，其操作步骤基本与斜面接种法相同，不同之处是挑取菌苔的接种环放入液体培养基试管后，应在液体表面处的管内壁上轻轻摩擦，使菌体分散从环上脱开，进入液体培养基，赛好试管塞后摇动试管，使菌体在培养液小红分布均匀。

若向液体培养基中接种量大或要求定量接种时，可先将无菌水或液体培养基加入菌种试管，用接种环将菌苔刮下制成菌悬浮液，再将菌悬浮液用塞有无菌吸管定量吸出后直接倒入液体培养基。

整个接种过程都要求无菌操作。

3、穿刺接种：
用接种针下端挑取菌种，自半固体培养基的中心垂直刺入半固体
培养中，直至接近试管底部，但不要穿透，然后沿原穿刺线将针退出，塞上试管塞，烧灼接种针4、将已接种的斜面、半固体和液体培养基放置28～30℃温室培养2～3d后取出结果。

厌氧微生物的培养
一、基本原理
厌氧微生物在自然界中分布广泛，种类繁多，作用也日益引起重视。

由于它们不能代谢氧来进一步生长，且在多数情况下氧分子的存在对其机体有害，所以在进行分离、培养时必须处于除去了氧及氧化还原电势差的环境中。

目前，根据物理、化学、生物或它们的综合的原理建立的各种厌氧微生物培养技术很多，其中有些操作十分复杂，对实验仪器的要求较高。

如主要用于严格厌氧菌的分离和培养的Hungate技术，厌氧手套箱等。

而有些操作相对简单，可用于那些对厌氧要求相对较低的一般厌氧菌的培养，如碱性焦性没食子酸法、厌氧罐法、庖肉培养基法等，本论文将主要介绍后面提到的三种，它们都属于最基本也是最常用的厌氧培养技术。

1、碱性焦性没食子酸法：
焦性没食子酸（Pyrogallic acid）与碱溶液（NaOH、Na2C○3或NaHC○3）作用后形成易被氧化的碱性没食子盐（alkaline pyrogallate）,能通过氧化作用而形成黑、褐色的焦性没食子澄从而除掉密封容器中的氧。

这种方法的优点是无需特殊及昂贵的设备，操作简单，适用于任何可密封的容器，可迅速建立厌氧环境。

而其缺点是在氧化过程中会产生少量上网一氧化碳，对某些厌氧菌的生长有抑制作用。

同时，NaOH的存在会吸收掉密闭容器的二氧化碳，对某些厌氧菌的生长
不利，用NaHC○3代替NaOH可部分克服二氧化碳的被吸收问题，但却又会导致
吸氧速率的减慢。

2、厌氧灌培养法：
利用一定方法在密闭的厌氧罐中生成一定量的氢气，而经过处理
的钯或铂可作催化剂催化氢与氧化合形成水，从而除掉灌中的氧二造成厌氧环境。

由于适量的C○2(2%～10%)对大多数的厌氧菌的生长有促进作用，在进行厌氧菌的分离时可提高检出率，所以一般在供氢的同时还向灌内供给一定的C○2。

厌氧罐中Ｈ2及C○2的生成可采用钢瓶灌注的外源法，但更方便的是利用各种化学反应在罐内自行生成的内源法。

3、庖肉培养基法：
碱性焦性没食子酸法和厌氧罐培养法都主要用于厌氧菌的斜面及平板等固体培养，而庖肉培养基法则在对厌氧菌进行液体培养时最常用。

其基本原理是，将精瘦牛肉或猪肉经处理后配成庖肉培养基，其中既含有易被氧化的不饱和脂肪酸能吸收氧，又含有谷胱甘肽（glutathione）等还原性物质可形成负氧化还原电势差，再加上培养基煮沸驱氧及用石蜡凡士林封闭液面，可用于培养厌氧菌。

这种方法是保藏厌氧菌，特别是厌氧的孢子菌的一种简单可行的方法。

若操作适宜，严格厌氧菌都可获得生长。

二、方法与步骤
1、碱性焦性没食子酸法：
（1）大管套小管法：
在一已灭菌、带橡皮塞的大试管中，放入少许棉花和焦性没食子酸。

焦性没食子酸的用量按它在过量碱液中能每克吸收100ml空气中的氧气来估计，本论文实验用量约0.5g，接种巴氏芽胞梭菌在小试管肉膏蛋白胨琼脂斜面上，迅速滴入10%的NaOH于大试管中，使焦性没食子酸润湿，并立即放入除掉棉塞已接种厌氧菌的小试管斜面，塞上橡皮塞，置30℃培养，定期观察斜面上菌种的生长状况并记录。

（2）培养皿法：
取玻璃板一块或培养皿盖，洗净，干燥后灭菌，铺上一薄层灭菌脱脂棉或纱布，将1g焦性没食子酸放在其上，用肉膏蛋白胨培养基倒平板，待凝固稍干燥后，在平板上一半划线接种巴氏芽胞梭菌，另一半划线接种荧光假单胞菌，并在皿底用记号笔作好标记，滴加10%NaOH溶液约2ml于焦性美食子酸上，切勿使溶液印出棉花，立
即将已接种的平板覆盖于玻璃板上或培养皿盖上，必须将脱脂棉全部罩住，而焦性没食子酸反应物不能与培养基表面接触，以溶化的石蜡凡士林液密封皿底与玻板或皿盖的接触处，置30℃培养，定期观察平板上菌种的生长状况并记录。

2、厌氧罐培养法:
(1)用肉膏蛋白胨琼脂培养基倒平板。

凝固干燥后，取两个平板，每个平板均同上同时划线接种巴氏芽胞梭菌和荧光假单胞菌，并作好标记。

取其中的一个平板置于厌氧罐的培养基支架上，而后放入厌氧灌内，而另一个皮瓣直接置与30℃温室培养。

（2）将已活化的催化剂倒入厌氧罐罐盖下面的多孔催化剂小盒内，旋紧。

（3）剪开气体发生袋的一角，将其置于罐内金属架的架上，再向袋中加入10ml 水，同时，由另一同事配合，剪开指示剂袋，使指示条曝露（还原态为无色，氧化态为蓝色）立即放入罐内。

（4）迅速盖好厌氧罐罐盖，将固定梁旋紧，置30℃温室培养，观察并记录罐内的情况变化及菌种徳生长情况。

3、庖肉培养基法
（1）接种：将盖在培养基液面嘚石蜡凡士林先于火焰上微微加热，使其边缘溶化，再用接种环将石蜡凡士林块拨成斜立或直立在液面上，然后用接种环或无菌滴管接种。

接种后再将液面上的石蜡凡士林块在火焰上加热溶化，然后将试管直立静置，使石蜡凡士林凝固并密封培养基液面。

（2）培养：将上述方法分别接种了巴氏芽孢梭菌和荧光假单胞菌的庖肉培养基置30℃温室培养，并注意观察培养基肉渣颜色的变化和熔封石蜡凡士林层的状况。

总结：
在微生物的纯培养操作中，每一个步骤都要严格的按照无菌操作技术去完成。

分离的目的是为了获得纯培养，要时时刻刻做无菌检查。

在操作的步骤中取试管棉塞或试管帽时要缓慢拔出，不宜用力过猛；所划直线尽可能的直，切莫划几条，不要将培养基划破，也不要使接种环接触管壁或管口；由于焦性没食子酸遇碱性溶液后即会迅速发生
反应并开始吸氧，所以在采用此法进行厌氧微生物培养时必须注意只有在一切准备工作都已齐备后再向焦性没食子酸上加NaOH溶液，并迅速封闭试管或平板。

目前厌氧罐培养法中使用的催化剂是将钯或铂经过一定处理后包被于还原性的硅胶或氧化铝小球上形成的“冷”催化剂，它们在常温下即具有催化活性，并可反复使用。

由于在厌氧培养过程中形成水汽、硫化氢、一氧化碳等都会使这种催化剂受到污染而失去活性，所以这种催化剂在每次使用后都必须在140～160℃的烘箱内烘1～2h,使其重新活化，并密闭后放在干燥处直到下次使用。

对于一般的厌氧菌，接了种的庖肉培养基可直接放在温室培养，而对于一些对厌氧环境要求比较苛刻的厌氧菌，接了种的庖肉培养基应先放在厌氧罐中，然后再送温室培养。