双偏振干涉测量技术在生物分析方面研究应用进展

评述与进展
双偏振干涉测量技术在生物分析方面研究应用进展
王娟
1,2　杨秀荣311
(电分析国家重点实验室,中国科学院长春应用化学研究所,长春130022)2(中国科学院研究生院,北京100039)
摘　要　双偏振干涉测量(dual 2polarizati on interfer ometry,DP I )技术是2000年以后出现的一种灵敏、实时、无需标记的新型表面状态分析方法,它能够在亚秒尺度精确测量界面层厚度、密度和质量的绝对值。

所以,DP I 在固/液界面上蛋白质结构、功能表征,蛋白质之间或与其它分子间的相互作用研究,核酸固定化及杂交检测研究,模拟生物膜研究以及表面超微结构表征等方面都有着广泛的应用。

本文介绍了DP I 的测量原理和特点,着重评述了近年来DP I 在生物分析方面的应用进展。

关键词　双偏振极化干涉测量技术,蛋白质,脱氧核糖核酸,相互作用,评述
　2007212203收稿;2008205225接受
本文系国家自然科学基金(No .20475052)和中国科学院计划(No .KJCX2.Y W.H09)资助项目
3E 2mail:xryang@ciac .jl .cn 1　引　言
双偏振干涉测量(dual 2polarizati on interfer ometry,DP I )技术是2000年以后出现的一种新型表面分析方法。

它能够灵敏、实时高精度测量界面层厚度、密度和质量的绝对值。

DP I 主要应用于生物分子如蛋白质等结构研究,生物分子间相互作用研究,模拟生物膜研究和表面超微结构实时、灵敏的定量分析。

由于DP I 系统可以进行亚原子尺度的精确、实时测量,是深入揭示生物分子结构、功能关系,以及相互作
用过程中分子结构变化的有力工具,被称为“分子显微镜”
(molecular m icr oscopes );它的结构测量结果可以直接与NMR 、X 2ray 及中子反射等结构表征结果进行比较。

目前,英国、美国、瑞典等国家的十几个研究小组开展了有关DP I 技术的研究应用工作,在蛋白质结构、功能表征,生物分子相互作用、DNA 杂交及模拟生物膜研究等方面,已有近30篇文章发表。

而DP I 技术的研究应用工作在我国尚未开展。

2　D P I 的原理、装置及特点
2.1　D P I 的原理及装置
DP I 是一种可以灵敏、实时检测传感片表面层绝对厚度和密度的光学技术[1]。

它的理论基础为200年前Thomas Young 的干涉实验。

DP I 测量使用的传感片由感应波导片和参考波导片构成,光经两个波导片传播后发生干涉。

光在传感片内传播时,在界面外产生消散场(evanescent field ),约渗透界面外100n m 。

如果分子吸附在传感片表面,或与表面已固定的分子发生相互作用,就会影响消散场,使光
在感应波导片内传播速率改变[2],而光在参考波导片内传播速率是不变的,所以光由两个波导片出射
后的干涉条纹位置会发生改变。

由干涉条纹位置变化即可获得感应波导片内出射光的相位变化。

通过Max well 方程,由两组独立的偏振光相位变化就可以获得精确的表面厚度和折射率的数值。

表面等离子共振(surface p las mon res onance,SPR )是应用广泛的实时表面分析技术,由于它是基于单个偏振光测量,得到的信号反映了厚度和折射率的综合变化即质量变化,不能分别确定厚度、折射率的值[3]。

而在DP I 测量中采用两个偏振光交替、连续照射传感片[4,5]
,采集两个独立偏振光的干涉条纹信号,并推算出横向磁场(transverse magnetic,T M )和横向电场(transverse electric,TE )的相位变化,即可第36卷2008年9月 分析化学(FE NX I HUAXUE )　评述与进展Chinese Journal of Analytical Chem istry
第9期1293～1299
求出表面层绝对厚度和折射率[1,4,6,7]。

DP I可以每秒进行10次数据采集,厚度分辨率达到0.1nm[2]。

所以DP I技术能够实现表面状态高分辨率的实时检测,并且无需标记放大。

DP I系统的核心部分包括氦2氖激光光源、偏振转换控制器、传感片和干涉信号采集装置;泵、定量环与传感片表面构成了流动通道。

溶液(流动相)由泵连续注入,流经传感片表面(感应波导片表面);与此同时,激光光源交替、连续地以两种偏振光照射传感片,干涉条纹信号被实时采集并转化为T M、TE 相位变化[3,4]。

实验前,选用已知折射率的溶液(如去离子水、80%乙醇)对仪器和波导片进行校正[4]。

再以载有不同分子的溶液流经传感片,进行吸附固定、相互作用等,干涉条纹信号随着感应波导片表面状态变化而改变,并被实时记录。

2.2　D P I与几种分析方法的比较
常用表面结构或表面分析技术有中子反射(neutr on reflecti on),椭圆光度法(s pectr oscop ic elli p s ome2 try,SE),表面等离子体共振(SPR)及石英晶体微天平(quartz crystal m icr obalance,QC M)等。

其中中子反射能够提供非常详细的结构信息,但是每次测量需要30～60m in完成,所以只能得到静态、稳态的结构信息,不适合动态测量[7]。

椭圆光度法可以在m in尺度实时测量物质吸附量、吸附层厚度;但不能准确测量太薄的吸附层,只能得到相对厚度而非绝对值大小[7]。

QC M与SPR只能得到质量变化响应,不。

DP I可以在亚秒尺度测量,并得到表面层厚度、密度绝对值,厚度测量精确到0.1n m[2,7]。

因此在质量变化很小的情况下,DP I能够轻易区分不同厚度、密度的结构[8]。

各种方法比较见表1。

表1　几种常用表面分析、结构分析技术比较[3,7,9,10]
Table1　Comparis ons of surface and structural analytical techniques
技术Technique
定量测量
Quantitative
measurements
精度
Precisi on
实时
Real ti m e
接近体内环境
Cl ose t o in vivo
结构信息量
Structural detail
SPR Yes N/A Yes Yes Low X2ray crystall ography Yes H igh No No Very high
Neutr on reflecti on Yes Very high No Yes H igh DP I Yes Very high Yes Yes Medium Spectr oscop ic elli p s ometry Yes H igh M in Yes Low AF M Yes Very high No-Very high
　SPR:surface p las mon res onance;DP I:dual polarizati on interfer ometry;AF M:at om ic force m icr oscope;N/A:not available.
3　D P I的应用
DP I技术可以实时、精确测量界面层,如表面吸附或共价固定的生物分子层的厚度、密度和质量绝对值;能够用于研究会引起表面层厚度、密度变化的分子间相互作用。

所以,DP I在蛋白质吸附、聚集过程研究,蛋白质与配体相互作用研究,模拟生物膜以及DNA固定与杂交检测等生物分析研究领域得到广泛的应用。

3.1　蛋白质在表面的结构表征及吸附、固定和聚集过程研究
随着蛋白质组学研究的不断深入,需要大量关于蛋白质结构功能的信息。

但是蛋白质原位的结构信息很难得到,并且这些结构信息需要能够在不同实验、技术平台间直接比较[3]。

另外,蛋白质在界面吸附、固定或者聚集过程中实时、原位结构表征非常重要。

蛋白质在界面的行为与仿生材料研制,生物传感器构建,生物相容性研究以及生物分离、生物修补等很多交叉领域都有着密切关系[11]。

蛋白质的聚集行为则被证明是一系列神经退行性疾病,包括帕金森病、阿尔茨海默症等的重要诱因[12]。

由于蛋白质普遍具有复杂的三级、四级结构,其构象非常容易受外界因素影响而改变,而结构决定功能。

对蛋白质在界面的结构进行实时、原位表征可以深入揭示蛋白质结构功能关系。

Lu等[11]利用原子力显微镜(AF M)和DP I研究了五边形C反应性蛋白质(CRP)的表面超微结构并精确测量其尺寸。

DP I测量结果为CRP单分子层的平均厚度是(3.18±0.43)nm,AF M测量结果为(3103±0.37)n m,均接近于已有的CRP晶体参数(3.6n m)。

4921 分析化学第36卷
Cr oss 等
[3]利用DP I 实时、定量检测了蛋白质在传感片表面固定的过程,并与传统常用分析技术进
行比较。

他们在氨基化的传感片表面共价固定一层生物素分子(bi otin ),通过生物素2亲和素特异性结合作用将链霉抗生物素蛋白(strep tavidin )固定在传感片表面。

DP I 测量结果为蛋白质层的厚度约
5.5n m ,与X 2ray 晶体学测量结果吻合。

另外,他们通过交联分子(cr osslinker )BS 3修饰氨基化的传感片表面,再共价固定anti 2HS A 蛋白。

BS 3可提供1114nm 的间隔长度,但是实验测量BS 3
层厚度仅
0.42n m ,折射率为1.44,这表明在传感片表面BS 3分子不是垂直伸展开的,而是形成相对致密的堆积
层。

由anti 2HS A 蛋白质层的密度,推算该蛋白质表面覆盖度为51.6%,说明固定过程中柔性蛋白质肽链的构象发生变化,使蛋白质铺展在表面。

该工作表明,DP I 能够实时、精确地测量蛋白质层厚度和密度。

Lu 等[11]研究了溶菌酶(lys ozy me )在硅/水界面的吸附行为。

溶菌酶浓度从0.03g/d m 3增大至
4.0g/dm 3,在pH 4条件下溶菌酶吸附层厚度由1.4n m 增大到(4.3±0.01)nm ,质量覆盖度为(0.21～
2136)±0.05mg/m 2;而在pH 7条件下,吸附层厚度由1.6增大到5.4±0.1nm ,质量覆盖度为
(0.74～3.29)±0.05mg/m 2。

这表明在低浓度时,pH 4和pH 7条件下溶菌酶均形成分子单层膜并伴
随着强烈的变形;在高浓度时,单层膜逐渐转化为双层结构。

而且在pH 7条件下溶菌酶在表面的吸附量更大。

Free man 等[2]用DP I 技术对固/液界面上蛋白质的吸附和结构性质进行了实时、精确的测量。

他们
以牛血清白蛋白(BS A )为模型蛋白。

溶液中,BS A 在不同pH 下具有不同构象,且随pH 发生可逆构象变化。

当BS A 的表面吸附达到平衡时,DP I 与中子反射实验测量结果一致(分别在pH 3、pH 5、pH 7)。

由于不同pH 下构象不同,BS A 的吸附动力学及在表面的构象都有很大差别。

利用DP I 可以高精度、实时揭示BS A 吸附过程中的细节,表明DP I 在实时研究界面上分子结构功能具有巨大潜力。

A r m str ong 等[7]研究了细胞粘性蛋白纤维蛋白原(fibrinogen )的界面吸附过程及RG D 肽链对蛋白原
吸附行为的影响。

通过椭圆光度法(SE )、中子反射法和DP I 对纤维蛋白原在硅/水界面的吸附进行测量。

SE 结果表明纤维蛋白原吸附量随时间增加,在最初1m in 左右吸附量迅速增大,随后缓慢增加,在60m in 达到稳定;RG D 的加入会明显抑制蛋白质吸附。

由于SE 只能在m in 尺度进行测量,所以不足以详细研究该吸附过程。

中子反射虽然可以提供更精确的结构信息,但是每次测量需要30～60m in,只能给出整个时间段结构变化的平均效果。

DP I 可以在亚秒尺度进行测量,具有明显优于以上两种方法的实时测量能力。

利用DP I 测量得到,0.01g/L 纤维蛋白原的表面吸附在5m in 内逐渐上升并达到一个平台;当存在2g/L RG D 或2g/L 肝素时,蛋白质吸附明显受到抑制,2m in 后几乎保持不变。

Lord 等[10]研究了溶菌酶与poly (HE MA )水凝胶层的相互作用。

通过可监测能量耗散的石英晶体
微天平(QC M 2D )研究发现,溶菌酶的结合使界面层质量减小而刚性增加。

由于QC M 2D 对结合水分子敏感,以此推测溶菌酶结合使水凝胶的结合水脱离,刚性增加而总体质量减小。

SPR 对结合水分子不敏感。

用SPR 检测溶菌酶与水凝胶层的结合,发现界面层质量逐渐增加,说明溶菌酶的确结合到水凝胶层。

DP I 测量结果显示,第一次加入溶菌酶后,水凝胶层厚度下降,折射率和质量增大,说明溶菌酶排斥出水凝胶中水分子,吸收到凝胶层内部,使其结构更加紧凑;第二次加入溶菌酶,厚度、质量和折射率都稍微增大,说明溶菌酶结合少,且只在表面吸附。

所以在整个结合过程中,溶菌酶开始排斥出凝胶内部水分子,进入凝胶层内部,随后增加的溶菌酶则吸附在水凝胶表面。

Soness on 等[13]以脂酶(li pase )在C 18表面吸附过程为模型,比较了DP I 和SPR 两种技术。

分别由
DP I 和SPR 测量得到的吸附曲线计算,均得到脂酶在浓度为1000nmol/L 及以上时在表面吸附达到饱
和,质量覆盖度为1.30～1.35mg/m 2。

这表明两种技术的测量结果具有可比性。

DP I 的优势在于除了
和SPR 一样得到吸附层质量变化以外,它能够精确测量吸附层厚度和折射率,有助于进一步揭示蛋白质的结构和吸附状态。

实验中所用脂酶为球形蛋白,平均半径2.3n m ,DP I 测得在低浓度下脂酶吸附层厚度约1.2n m ,饱和浓度下吸附层厚度约2.1n m ,这说明脂酶在吸附时发生不同程度去折叠,结构更加
扁平。

Soness on 等[14]还研究比较了脂酶分别在亲水、疏水表面的吸附及活性。

通过DP I 测量了脂酶在
亲水表面(未修饰的传感片)、疏水表面(C 18)的吸附过程。

脂酶在疏水表面的吸附亲和力更大,饱和吸
附量达到1.90mg/m 2(在亲水表面饱和吸附量为1.40～1.50mg/m 2)。

当表面吸附量高于1.0mg/m 25921第9期王娟等:双偏振干涉测量技术在生物分析方面研究应用进展
6921 分析化学第36卷
时,在亲、疏水表面的吸附层厚度均为常数(约3.5nm);当表面吸附量较低时,脂酶在亲水表面的吸附层厚度降低,表明其结构发生了部分去折叠。

脂酶在疏水表面吸附层折射率与其吸附量成正比,表明脂酶结构在低、高表面吸附量下是相似的。

通过共聚焦显微镜测量脂酶在两种表面上的活性。

比较疏水表面而言,脂酶在亲水表面的活性更大,说明有更多脂酶以活性位点朝着溶液的取向进行吸附。

Gengler等[12]在研究β2淀粉(25～35)聚集体神经毒性时,利用DP I定量测量了β2淀粉的聚集程度和动力学过程。

在相同初始浓度下,β2淀粉(25～35)在数小时内聚集(2h厚度约4nm),但是它的反序列β2淀粉(35～25)只有微小的聚集;前者聚集的平均速度比后者大17倍,且后者聚集速度在1h内即降至0左右。

这说明β2淀粉聚集性质和其基因序列有关。

Halthur等[4]用原位的椭圆光度法、QC M2D和DP I研究了聚谷氨酸(PG A)和聚赖氨酸(P LL)层层组装多层膜,及釉原蛋白在多层膜上的固定过程。

通过DP I可以实时全面地揭示多层膜组装及蛋白质固定过程。

3.2　蛋白质与配体的相互作用研究
蛋白质是生命活动最重要的物质基础,、核酸、多糖,或者配体结合而实现一系列生物学功能。

其中具有代表性的如,酶2底物、受体2何尔蒙、抗原2抗体的结合[8]。

蛋白质的结构、功能异常则会改变蛋白质分子间或者与配体的相互作用,导致生物学过程的改变,甚至一些疾病的发生。

另外,很多金属离子在体内起着调节、稳定蛋白质结构的重要作用。

因此,在接近体内环境下研究蛋白质与各种生物分子、配体、金属离子间的相互作用对深入了解重要生物学过程的分子机理非常有意义。

蛋白质2配体等相互作用过程中往往伴随着蛋白质构象的转变。

DP I能够实时、精确测量表面结构变化,被广泛应用于蛋白质与配体,特别是蛋白质与小分子的相互作用研究中。

S wann等[15]利用DP I实时测量链霉抗生物素(strep tavidin)与生物素(bi otin)结合前后的结构变化,推算两者结合计量比并区分特异性、非特异性相互作用。

他们首先在氨基化传感片表面非原位(ex situ)共价修饰一层生物素,再结合链霉抗生物素,由DP I测量得到蛋白质层厚度为6.63n m,这与链霉抗生物素X2ray测量的长轴长度6.8nm接近,说明表面形成了蛋白质的单分子层。

当溶液中D2bi o2 tin与表面固定的链霉抗生物素结合时,蛋白质层厚度明显减小而密度增大,说明D2bi otin与链霉抗生物素后引起蛋白质的构象变化,这与结晶学测量结果一致。

根据表面质量增加计算出两者结合计量比为2∶1(bi otin∶strep tavidin)。

链霉抗生物素共有4个结合位点,假定有2个结合位点在固定化时被占据,那么还有2个结合位点可以和溶液中D2bi otin结合,实验测量结合计量比和理论推测可以很好地吻合。

另外,当溶液中D2bi otin与蛋白质层表面发生非特异性结合时,表面层厚度稍微增加但密度几乎不变,以此可以区分特异性和非特异性结合。

在另一个工作中,S wann等[16]将生物素修饰的抗体(B i P AK< p r oBNP>)通过生物素2亲和素作用固定在传感片表面,用DP I实时测量p r oBNP抗原与抗体的结合。

根据相互作用前后蛋白质层厚度和密度的变化,可以区分各种结合作用,例如厚度增大,密度不变表明发生了非特异性结合,而厚度不变,密度增加,表明发生了特异性结合,蛋白质结构变得紧凑。

B iehle等[6]研究阿朴脂蛋白(Apo E)的几种同源蛋白与血浆酶原activat or(tP A)的相互作用。

利用DP I实时检测了表面固定化tP A分别与Apo E2、E3和E4的结合。

其中,Apo E2引起tP A层密度增大,表明两者发生特异性结合,使界面层结构变紧凑;Apo E3、E4则使tP A层密度减小。

圆二色实验结果显示,tP A可以引起Apo E2的螺旋度改变,但对Apo E3、E4的构象没有影响。

由此证明只有Apo E2与tP A有特异性相互作用。

R icard2B lu m等[8]利用DP I研究了肝素(heparin)与胶原蛋白V(HepV)的相互作用。

肝素是一种多糖,与胶原蛋白的重组片段HepV有特异性结合。

生物素修饰肝素通过链霉抗生物素固定在传感片表面,并与溶液中的HepV结合。

SPR和DP I均可以实时测量整个肝素2HepV结合过程。

DP I测量不仅得到结合过程中质量变化,更能得到准确的吸附层厚度和密度值。

HepV与表面固定的肝素结合时,最初密度迅速增大而厚度减小,这表明HepV插入了肝素层中使界面层结构更加紧凑,然后厚度不变而密度稍微下降,这说明表面有物质流失,可能是链霉抗生物素的脱落造成。

另外,HepV在链霉抗生物素层表面有非特异性的结合,但是与HepV2肝素特异性结合过程明显不同,界面层厚度迅速增大而密度几乎
不变,这是典型的非特异性吸附。

L in 等[17]利用DP I 研究了同质多价抗原(Ag )与单克隆抗体(Ab )的相互作用动力学过程。

C 反应
性蛋白(CRP )是一种五边形结构的抗原,含有多个等同的抗原决定基;anti 2CRP 含有2个结合位点。

多结合位点抗原2抗体结合存在多级平衡,计算结合常数等较为复杂。

DP I 测量anti 2CRP 2CRP 复合物分解常数K D (0.447±0.032)μmol/L 与E L I S A 结果(0.553±0.048)μmol/L 一致,并且得到两者结合计量比Ag/Ab 为1.56±0.6。

Thibault 等[18]研究伴侣蛋白Cl pX (chaper one Cl pX )N 末端对底物和辅因子的特异性识别时,利用
DP I 测定了辅因子Ss pB 2对伴侣蛋白Cl pX 的N 末端Zn 结合域(Z BD2)的亲和力及Ss pB 22Z BD 2复合物的结构参数。

根据Ss pB 2与Z BD 2结合前后蛋白质层厚度、密度变化与Ss pB 2浓度关系,推测存在强、弱两种不同的结合方式。

在强结合模式下,K D 为0.85μmol/L,最终结合饱和时厚度为3.3n m ,1个Ss pB 2占据2个Z BD 2的面积,表明Ss pB 2以长轴倾倒至表面的取向与2个Z BD 2结合;在弱结合模式下,K D 为11.0μmol/L,最终厚度7.6n m 且1个Ss pB 2占据1个Z BD 2面积,表明1个Ss pB 2以长轴垂直表面取向与1个Z BD 2结合。

Kari m 等
[5]利用DP I 研究了转谷氨酰胺酶(transgluta m inase,tTG )与Ca 2+结合后的构象变化。

tTG 通过BS 3共价固定在氨基化的传感片表面,得到厚度4～5nm 的蛋白质层,计算每个tTG 分子所占面积为76nm 2表明tTG (11n m ×6.2nm ×4.2nm )是以平躺的取向形成蛋白质单分子层。

Ca 2+与tTG 结合
常数为(0.95±0.2)mmol/L,与其它文献测量结果一致。

Ca 2+与tTG 结合会引起蛋白质层厚度降低,
密度增大,表明蛋白质构象(趋于紧凑)变化很大;而Na 2+与tTG 结合引起厚度变化很小,蛋白质结构几
乎不变。

根据质量的增加计算每个tTG 结合1.7～2.1个Ca 2+。

Thomp sett 等[19]研究了朊病毒蛋白(p ri on p r otein,PrP )与Cu 2+结合前后的构象,证明存在两种不同
的折叠模式。

PrP c 是正常朊蛋白亚型,PrP sc 是异常亚型,两者具有不同的构象和性质,PrP c 能够高亲和
力结合Cu 2+,PrP sc 则不能结合Cu 2+。

他们比较了脱辅基蛋白(Apo 2PrP )与Cu 2+、Mn 2+结合蛋白
(Cu 2PrP 、Mn 2PrP )的结构,3种蛋白通过BS 3共价固定在传感片表面。

通过计算每个分子占据面积,结
合厚度就可以推算分子的体积,Mn 2PrP 和Apo 2PrP 的结构相似(约2.9nm ×2.9nm ×6.0n m;3.0nm ×
3.0n m ×6.0n m ),Cu 2PrP 则比前两个更细长(约2.7n m ×2.7n m ×7.1nm )。

Cu 2+、Mn 2+都能够使PrP
结构更紧凑,而只有Cu 2+能使PrP 结构明显拉伸。

将Apo 2PrP 固定在传感片表面,用DP I 研究Cu 2+
与
PrP 结合的实时过程,发现Cu 2+引起了蛋白质层的厚度下降,密度和质量增加,在用E DT A 竞争除去
Cu 2+后,蛋白质层厚度又恢复至结合前数值。

这表明Cu 2+与PrP 结合为可逆过程。

DP I 测量的Cu 2PrP
结构与表面固定化PrP 结合Cu 2+后的结构有明显差异,这可能是Cu 2PrP 、Apo 2PrP 在传感片表面结合方
式不同造成的。

3.3　模拟生物膜及生物膜与分子相互作用研究
细胞膜等各种膜结构是细胞结构的重要组成部分,也是生命活动的主要结构基础,它们统称为生物
膜。

人工构建模拟生物膜是在体外对生物膜结构、功能进行模拟、研究的重要方法[20]。

磷脂等两亲性
分子在界面上形成的自组装双层膜(BL M )是使用最广泛的模拟生物膜模型。

DP I 能够实时、精确测量界面层密度、厚度,因此可以得到有关模拟生物膜的结构、形态的丰富信息,并可用于研究界面上模拟生物膜的形成及与其它分子相互作用的过程。

Popp le well 等[21,22]实时、定量测量了蜂毒肽(melittin )对脂质体(li pos ome )结构的溶解(lysis )作用。

脂质体通过物理吸附后发生一定重排附着在传感片表面。

溶液中的蜂毒肽会使DOPC 脂质体层厚度由18nm 迅速降低至3nm (约双层磷脂膜厚度),折射率由1.375(接近缓冲)增大到1.435(磷脂折射率),这说明蜂毒肽使DOPC 脂质体结构崩塌,释放出包含的水后,变成双层膜吸附在传感片表面。

通过DP I 测量蜂毒肽与脂质体层作用过程,可以详细揭示两者结合及脂质体结构崩塌的动态结构信息,可以比较
不同脂质体与蜂毒肽作用的过程[20]。

Terry 等[23]用DP I 表征了模拟生物膜———杂化双层膜(HBM )在传感片表面的形成过程。

杂化膜形
成过程中厚度、折射率、质量和第一层的倾斜角度都可以同时用DP I 测定。

他们在传感片表面共价固定7921第9期王娟等:双偏振干涉测量技术在生物分析方面研究应用进展
8921 分析化学第36卷
癸酸,形成一层疏水层。

癸酸层厚度(0.92±0.12)n m,表明碳链以57℃倾斜角排列。

分别用DPPC和DMPC磷脂在癸酸表面形成杂化膜。

DPPC HBM厚度为4.32nm,质量3.18ng/mm2,折射率1.404; DMPC HBM厚度2.12n m,质量2.25ng/mm2,折射率1.435。

比较两种HBM的厚度、质量和折射率就可以深入了解不同成分HBM的形成过程和结构差异。

3.4　D NA表面固定化及杂交过程研究
基因是生命的遗传单位,基因序列变异与疾病发生等有着密切关系。

因此基因测序一直是非常重要的研究领域。

随着DNA芯片及DNA生物传感器的发展,基因序列测定更加快速、简便,且仪器小型化。

DNA芯片及生物传感器研制过程的关键步骤之一便是探针在表面的固定化[24,25]。

因此改进探针固定方法,以提高固定效果、DNA杂交效率具有重要意义。

Berney等[24]通过DP I研究了ss DNA探针的固定,及固定方法和探针表面密度对杂交效率的影响。

他们比较了直接吸附、共价耦联和亲和素2生物素耦联的DNA探针3种固定方法。

盐浓度增加会降低DNA在氨基化表面的吸附,而增大探针浓度可以显著增大DNA探针表面覆盖度,但是探针层密度过大会降低杂交效率。

吸附固定DNA探针与互补链杂交后,表面覆盖度会降低,说明形成刚性较大的双链DNA部分脱离了表面。

通过交联分子BS3共价耦联固定DNA探针,得到厚度约4.5nm,说明探针倾斜表面取向。

通过亲和素2生物素耦联的双链DNA每个分子所占据面积约为共价耦联双链DNA的4倍,表明共价耦联时DNA链更加密集并朝向溶液,亲和素2生物素耦联时由于亲和素有一定体积,引入了较大的空间间隔,使DNA链分散并可以卷曲折叠附着在表面。

L illis等[25]用DP I表征了DNA探针的两种共价固定过程,及探针与互补DNA杂交过程。

DNA探针采用直接共价耦联和双功能交联分子耦联两种固定方法。

DP I可以实时检测探针固定过程中,DNA 探针的取向和覆盖度变化;而根据杂交过程中表面层厚度、密度变化可直接得到探针自由度与杂交效率的关系。

直接共价耦联的DNA探针厚度0.68n m,表明DNA通过多点接触平躺在平面上;与互补DNA 杂交时探针没有发生重新取向,杂交效率为35%。

双功能交联分子耦联的DNA探针厚度0.5nm,说明探针也是平躺取向;杂交过程中探针发生了显著的重新取向,表明探针具有足够的自由度以便杂交互补链,杂交效率为85%。

所以,通过交联分子耦联固定的DNA探针具有较大的自由度,保证了杂交效果。

3.5　D P I的其它应用
除了以上总结的在蛋白质结构表征、相互作用研究,模拟生物膜、DNA固定化及检测研究等生物分析领域的应用,DP I在其它有关界面结构的研究中也有应用。

Edmonds on等[26]研究聚电解质大分子引发剂(polyelectr olytic macr oinitiat ors)引发表面聚合过程。

DP I可以准确测量出大分子引发剂在表面形成的吸附层的厚度和密度,为进一步研究表面聚合过程提供了可靠参数。

Pop t oshev等[27]研究表面活性剂(DDAO)在硅/水界面吸附行为时,利用DP I准确测量了DDAO吸附层的折射率和厚度。

4　结　语
DP I技术具有无需标记、实时、精确测量界面层厚度、密度和质量绝对值的优点。

因此它对于固/液界面上,生物分子结构、功能,及能够引起界面层厚度、密度变化的相互作用研究有着传统表面分析、结构分析技术无法比拟的动态、精确测量能力。

并且DP I技术所得到的测量数据是绝对值,可以直接与传统的结构分析技术,如X射线衍射、原子力显微镜、中子反射及椭圆光度法等测量结果进行比较,利于不同实验室及平台间研究工作的比较和交流[3,7,9,10]。

目前DP I技术的应用主要在生物分析研究领域里的应用尚不成熟,从实验到数据分析等等还需要更多的摸索和规范。

随着DP I研究应用的不断展开和深入,它在包括生物分析、纳米材料表征、表面结构研究等方面都会有非常广泛的应用。

References
1　Yates E A,Terry C J,Rees C,Rudd T R,Duchesne L,Skid more M A,Levy R,Thanh N T K,N ichols R J,Clarke D T, Fernig D G.B ioche m.Soc.T.,2006,34:427～430。