新型结构仿生骨-软骨修复支架的构建以及性能研究

摘要
目的：通过冻干法和定向冰冻技术分别制备磷酸八钙/丝素蛋白/海藻酸钠（octacalcium phosphate/silk fibroin/sodium alginate，OCP/SF/SA）复合多孔骨层支架和含硫酸软骨素（hondroitin Sulfate，CS）的CS/SF/SA定向孔软骨层支架；体外实验评估支架的理化性能以及生物学行为，选择合适的骨层以及软骨层材料，构建骨-软骨结构仿生支架，为下一步动物体内修复骨-软骨损伤的实验打下基础。

方法：
（1）支架的制备以及理化性能分析：制备OCP/(SF+SA)质量百分比为0:100、10:90、25:75、50:50和75:25的5组复合多孔骨层支架、CS浓度为0%、1%、2%和10%的4组定向孔软骨层支架以及骨-软骨结构仿生支架；使用扫描电镜（SEM）观察支架的形貌；使用X射线衍射仪（XRD）检测支架材料的晶体结构；使用傅里叶红外光谱仪（FTIR）测定支架的分子结构；将支架浸泡在模拟体液（SBF）中观察矿化情况；将支架浸泡在磷酸盐缓冲液（PBS）中检测支架的吸水率、降解率、骨层支架钙离子（Ca2+）释放情况以及软骨层支架硫酸软骨素释放情况；使用动态力学试验机测试支架的力学性能。

（2）支架的体外细胞学分析：将骨髓间充质干细胞（mBMSCs）种植在骨层支架上进行培养，CCK-8法检测细胞增殖情况；SEM和共聚焦显微镜（CLSM）观察细胞粘附情况；ALP染色、ALP活性测定和成骨分化相关基因表达检测评估细胞的成骨分化情况。

将ATDC5与软骨层支架浸提液共培养，使用CCK-8法检测细胞的增殖情况；使用Live-dead染色检测细胞活性；使用阿利新蓝染色和成软骨分化相关基因表达检测评估成软骨分化情况。

结果：
（1）支架的理化性能分析：SEM照片显示骨层支架具有蜂窝状多孔结构，直径在81±42μm至219±56μm之间，孔径随着OCP含量增加而减小，14d矿化实验中，10：90、25:75组支架出现大量片状的类似羟基磷灰石（HA）的晶体；软骨层支架具有定向孔结构，孔隙大小为130±39μm至444±53μm之间，随着CS含量增加，孔径逐渐减小；骨-软骨结构仿生支架骨层为蜂窝状的多孔结构，软骨层为定向孔结构，两层结构之间逐渐转变，构成骨-软骨界面；FTIR结果显示，骨层以及软骨层支架均出现丝素蛋白β-折叠结构吸收峰；XRD结果显示，OCP/SF/SA复合支架中出现OCP的特征峰，其峰强与OCP的含量成正比；吸水率实验结果显示，0:100、10:90、25:75组骨层支架吸水率良好，复合大量
的OCP降低了吸水率，而各组软骨层支架吸水率良好，CS掺入可以增加支架吸水率；骨层支架在PBS中可以释放Ca2+；软骨层支架在PBS中可以释放CS；此外，OCP的掺入降低了支架降解率，但提高了支架的机械性能。

（2）骨层支架的体外细胞成骨活性：CCK-8检测结果提示，mBMSCs可在各组支架上增殖，以25:75组增殖最为明显；SEM和CLSM结果显示，mBMSCs在各组支架上粘附良好；ALP活性和染色结果表明，10:90和25:75组ALP活性较其它组高；qPCR结果显示，适量的OCP可以促进成骨分化相关基因（ALP、Col-I）的表达，高含量的OCP可以促进OC、OPN基因的表达。

（3）软骨层支架的体外细胞成软骨活性：CCK-8检测结果提示，ATDC5在各组支架浸提液中增殖良好，以2%CS组最为明显；Live-dead染色结果显示，各组支架的细胞相容性良好；阿利新蓝染色结果表明，ATDC5在含CS支架浸提液中分泌的多糖量较SF/SA组多；qPCR结果显示，适量的CS可以促进成软骨分化相关基因（Col-II，Sox9、Aggrecan）的表达。

结论：本研究成功的构建了具有良好理化性能以及生物相容性的骨-软骨结构仿生支架，骨层复合的OCP能够促进mBMSCs成骨分化，软骨层复合的CS能够促进ATDC5成软骨分化，为下一步体内修复骨-软骨损伤动物实验打下了基础。

关键词：骨-软骨，结构仿生，磷酸八钙，硫酸软骨素，丝素蛋白，海藻酸钠
Abstract
Objective:In this study,octacalcium phosphate/silk fibroin/sodium alginate(OCP/SF/SA) composite porous scaffold was prepared as the bone layer and CS/SF/SA scaffold containing chondroitin sulfate(CS)with oriented pore structure was prepared as the cartilage layer by lyophilization and directional freezing technique.The physicochemical properties and biological behaviors of scaffolds were evaluated in vitro and the proper scaffolds for bone and cartilage layer were selected to construct the osteochondral biomimetic scaffold with a good interface.These experiments would lay a foundation for osteochondral repairing in vivo. Methods:
(1)Preparation of scaffold and analysis of its physicochemical properties:5groups of porous bone scaffolds with the mass percent of OCP/(SF+SA)as0:100,10:90,25:75,50:50 and75:25were prepared by lyophilization;4groups of CS/SF/SA cartilage scaffolds with oriented pore structure respectively containing0,1%,2%and10%CS were prepared by directional freezing technique and lyophilization;the osteochondral biomimetic scaffold was prepared by combining proper bone and cartilage layer scaffolds;the morphology of scaffolds was observed by SEM;the crystal structure of scaffolds was detected by XRD;the molecular structure of the scaffolds was determined by FTIR;the scaffold was immersed in simulated body fluid(SBF)to observe the mineralization;the water absorption rate,degradation rate,calcium ion release from the bone layer scaffold and chondroitin sulfate release from the cartilage layer scaffold were detected by soaking the scaffold in phosphate buffer solution(PBS);the mechanical properties of the scaffold were tested by dynamic mechanical testing machine.
(2)Cytological analysis of scaffolds in vitro:after mBMSCs were cultured on the bone layer scaffolds,CCK-8was used to detect cell proliferation;SEM and CLSM were used to observe cell adhesion on scaffolds;ALP staining,ALP activity test and osteoblast differentiation related gene expression test were used to evaluate the osteoblast differentiation of mBMSCs; after ATDC5cells were co-cultured with the extracts of the cartilage layer scaffolds,CCK-8was used to detect cell proliferation;Live-dead staining was used to detect cell viability;alcian blue staining and chondrogenic differentiation related gene expression detection were applied to evaluate the chondrogenic differentiation of ATDC5.
Result:
(1)Analysis of physicochemical properties of the scaffolds:SEM photographs showed that the bone layer scaffolds had cellular porous structure with the diameter ranging from81±42μm to219±56μm and the aperture decreased with the increase of OCP content;In the mineralization
experiment on day14,a large number of flake crystals like hydroxyapatite(HA)were found in the scaffolds of10:90and25:75group;the cartilaginous scaffold had a directional pore structure, with the pore size ranging from130±39μm to444±53μm,and the pore size decreased with the increase of CS content;the bone layer of the biomimetic bone-cartilage scaffold was a cellular porous structure and the cartilage layer was a directional pore structure;the two layers gradually changed to form the bone-cartilage interface;FTIR results showed that absorption peaks ofβ-sheet structure in silk fibroin appeared in each group of bone and cartilage layer scaffolds;XRD results showed that the characteristic peaks of OCP appeared in the OCP/SF/SA composite scaffolds,and the peak strength increased with the increase of OCP content;the water absorption experiment results showed that:0:100,10:90,25:75group of scaffolds had good water absorption rate,which was significantly better than other groups,each cartilage layer scaffold had good water absorption rate,which increased with the increase of CS conten;The bone layer scaffold can release Ca2+and Cartilage scaffold can release CS in PBS,In addition,the incorporation of OCP improved the mechanical properties of the scaffolds and reduced scaffold degradation rate.
(2)Osteogenic activity of subchondral scaffold in vitro:CCK-8detection showed that mBMSCs could proliferate in each group of scaffolds,especially in25:75group;SEM and CLSM showed that BMSCs adhered well in each group of scaffolds;ALP activity test and staining results showed that ALP activity in10:90and25:75groups was higher than that in other groups;The qPCR showed that moderate OCP could promote the expression of osteogenic differentiation related genes(ALP,Col-I)of mBMSCs and high content of OCP promoted the genes expression of OC and OPN.
(3)Chondrogenic activity of chondrogenic scaffold in vitro:CCK-8results showed that ATDC5could proliferate well in each group,especially in the2%CS group;the results of Live-dead staining showed that each groudp of scaffolds had good cytocompatibility;the results of Alixin blue staining showed that ATDC5secreted more polysaccharide in each group than in the pure SF/SA group;the results of qPCR showed that proper amount of CS could promote the expression of chondrogenic differentiation related genes(Col-II,Sox9,aggrecan). Conclusion:in this study,we successfully constructed an osteochondral biomimetic scaffold with good physicochemical properties and biocompatibility.OCP in the bone layer promoted the osteogenic differentiation of mBMSCs and CS in the cartilage layer promoted the chondrogenic differentiation of ATDC5.The development of this study can lay a foundation for osteochondral repair experiment in vivo.
Keywords:osteochondral,structural bionics,octacalcium phosphate,chondroitin sulfate,silk fibroin,sodium alginate
目录
摘要 (III)
Abstract (V)
1.绪论 (1)
1.1骨软骨结构的解剖学 (2)
1.2骨软骨损伤临床治疗方法以及所面临的问题 (3)
1.3组织工程技术治疗骨软骨损伤的研究进展 (5)
1.4本课题设想和提出 (14)
2.实验材料和方法 (15)
2.1实验材料和主要的设备 (15)
2.2支架的制备实验方法 (18)
2.3支架的理化性能分析 (20)
2.4骨层支架的成骨分化性能分析 (22)
2.5软骨层支架的成软骨分化性能分析 (26)
2.6统计学方法 (28)
3.结果 (29)
3.1骨软骨支架理化性能分析 (29)
3.2骨支架上体外细胞成骨活性 (38)
3.3软骨层支架体外细胞成软骨活性 (41)
4.讨论 (45)
5.结论 (48)
参考文献 (49)
主要英文缩写词表 (61)
在校期间发表的论文以及科研成果 (63)
致谢 (64)
1.绪论
人体关节的关节面主要为软骨。

软骨与关节腔内的滑液一起促进健康关节的近无摩擦运动。

此外，关节软骨将关节负荷传递到软骨下骨，从而起到减震器的作用。

关节软骨损伤常见于创伤，剥脱性骨软骨炎以及关节的退行性病变。

随着疾病的进展，大部分患者将发展为骨性关节炎（osteoarthritis，OA），软骨下骨也常常被累及[1]。

据报道，截至2012年，美国骨性关节炎患者约3100万人，其中9.2%存在骨软骨缺损[2]。

随着目前医疗技术的发展，人口平均寿命的延长，OA患者人数将不断增加，预计到2030年，约有6700万美国人将患有OA。

骨关节炎常常导致患者关节疼痛、肿胀、畸形、活动受限，极大地影响了患者的生活与工作[3]。

关节软骨缺乏神经、血管和淋巴系统，因此软骨一旦出现较为严重的损伤，仅仅通过保守治疗几乎很难达到自身的修复[4]，常常需要手术的干预，目前在美国每年约50万例与软骨疾病相关的手术[5]。

传统的软骨修复手术包括关节清理术，微骨折术，自体软骨细胞植入和镶嵌成形术，自体异体软骨移植术等。

然而，由于新形成的组织质量较差，且缺乏生物力学功能的恢复，这些方法并不完全成功，且异体软骨移植术常常伴有疾病传播以及免疫排斥的风险[6]。

鉴于传统手术修复软骨损伤存在诸多的不足，组织工程技术是目前软骨修复的研究热点。

组织工程指的是应用工程学和生命科学的原理来开发生物替代物，以恢复、维持或改善组织功能[38]。

符合组织机械性能和代谢功能的支架、细胞和生物活性物质是组织工程技术的三大核心[7]。

在以往的研究中，骨软骨缺损的治疗策略主要集中于关节软骨层的再生，关于软骨下骨再生的研究较少[8]。

随着对骨软骨微观结构以及代谢研究的深入，学者们认识到软骨与软骨下骨是一个整体的功能单位，对于骨软骨损伤，或者伴有软骨下骨变性的软骨损伤，同时修复骨-软骨对于恢复关节功能是至关重要的。

而且相关研究表明，骨-软骨之间存在骨软骨界面，且软骨与软骨下骨在许多特征上存在差异，比如细胞与细胞外基质的组成、机械性能，营养代谢等。

因此，在骨软骨修复支架的设计中有必要重新生成骨-软骨界面，并尽可能接近地模拟骨骼和软骨的解剖、生物学和物理化学特性[9]。

目前，相关的两相的、三相的支架被开发出来且用于临床修复骨软骨损伤，比如TruFit plug双层支架和Maio Regen®三层支架，这些支架的结构呈现出机械、物理化学或生物特性的梯度。

但是临床随访发现它们存在软骨修复不完全、软骨下骨修复不良以及远期疗效欠佳等不足，严重影响了它们在临床中的应用。

因此，我们还需要在骨软骨修
复支架的开发方面进行进一步的努力，通过优化支架的组成成分，结构等使其更能满足骨软骨复合体修复的需要。

1.1骨软骨结构的解剖学
如图1所示，成人骨软骨组织由软骨、钙化软骨层和软骨下骨组成[15]，厚度约为3毫米，三种成分厚度比例分别为90%、5%和5%[9]。

在外观上，关节透明软骨是浅蓝色和半透明的弹性组织，而软骨下骨致密而坚硬[10]。

在生理学上，透明软骨可以分为浅、中和深三个不同的区域，分别占软骨厚度的10%-20%、40%-60%、30-40%[11]。

软骨的主要成分包括软骨细胞和细胞外基质。

软骨细胞是软骨中唯一存在的细胞类型，占该组织成分的2%，软骨的细胞外基质主要由胶原蛋白和蛋白聚糖组成，也有少量非胶原蛋白和糖蛋白，其中胶原蛋白占比约为45-50%，这使得胶原蛋白成为细胞外基质中最丰富的结构大分子，而90-95%的胶原蛋白是以II型胶原纤维的形式存在的，形成致密且高度互连的基质，另外，蛋白聚糖的含量随着软骨深度的增加而增加[12]。

在软骨层的各个区域中，软骨细胞以及II型胶原纤维的形状、大小以及II型胶原纤维的排列方向有其自身的规律。

浅层胶原纤维细长且水平均匀排列，软骨细胞呈小而扁平的圆形。

中层的胶原纤维比表层的厚，呈随机排列，该区的软骨细胞呈球形。

深层的软骨细胞呈垂直排列，呈椭圆形，厚胶原纤维呈垂直均匀排列[13]。

软骨内无血管，营养物质主要通过滑液的扩散被输送到细胞中，有研究表明模拟人体在活动的时候对软骨产生的周期性负荷会产生“泵”的作用，有利于软骨内和软骨外的滑液流动以促进营养物质交换[14]。

图1.骨软骨组织的结构。

骨软骨组织由关节软骨、软骨下骨和骨-软骨界面组成。

关节软
骨可分为浅层、中层、深层和钙化软骨[15]。

在三个软骨区的下面，有一条波浪状的线，被称为潮线，它将透明软骨区和钙化软骨分开，使两个区域发生逐渐的转变[16]。

在健康的骨软骨组织中，潮线是一道生理屏障，仅使低于500Da的小分子从钙化软骨单向移动到透明软骨，从而保护透明软骨免受血管侵犯，潮线和钙化软骨对维持透明软骨和软骨下骨的不同的生理环境具有重要的作用，二者共同被称为骨-软骨界面[17]。

钙化软骨被认为是软骨和骨骼之间的过渡部分，该区域同时具有软骨和骨组织的一些特征和属性。

钙化软骨层存在肥大表型的软骨细胞，其体积比其余软骨区的软骨细胞大20倍，可产生X型胶原纤维，该区域的胶原纤维垂直锚定在软骨下骨上，另外，骨组织的一些特征，包括碱性磷酸酶的存在也可以在这个区域找到[13]。

钙化软骨在功能上为软骨下骨和关节软骨之间的界面处提供良好的粘附力[4]。

关节软骨钙化区下方是软骨下骨，软骨下骨是骨软骨组织的重要组成部分，它负责维持关节骨的轮廓形状，并为软骨的分化和发育创造合适的生物力学环境[18]。

软骨下骨中有来自骨髓组织的血管为其提供充足的营养，并且存在多种类型和功能的细胞。

间充质干细胞约占细胞总数的0.002%，它具有分化成成骨细胞和软骨细胞能力，成骨细胞负责骨形成，包括羟基磷灰石（hydroxyapatite，HA）的合成和沉积，内皮细胞负责组织内血管的形成[19，20]。

软骨下骨中有大量的I型胶原以及HA，I型胶原纤维和HA 组成复合结构使软骨下骨在关节运动过程中具有强大的硬度和抗压强度[21]。

骨-软骨复合体的结构以及组成成分的差异性必将导致软骨与软骨下骨在机械性能方面的差异。

在软骨层中胶原纤维的结构和直径决定了软骨拉伸模量的变化，且不同方向的拉伸模量具有差异性。

在平行方向。

软骨浅、中、深层的拉伸模量分别为42.2、13.0和2.6MPa。

而在垂直方向，拉伸模量分别为15.6、4.7和1.1MPa。

此外，软骨的压缩模量随深度增加而增加。

从浅层软骨至深层软骨，压缩模量从0.27-1.16MPa增加到0.71-7.75 MPa[22，23]。

在软骨下骨层，由于其结构致密，并具有无机成分HA晶体的增强作用，其弹性模量为5.7±1.9GPa，明显高于矿化软骨的弹性模量0.32±0.25GPa[24]。

综上所述，软骨与软骨在组织成分以及机械力学上具有明显的差异，同时在结构和功能上又具有密切的联系，骨-软骨复合体整体的完整性对维持软骨功能是至关重要的。

1.2骨软骨损伤临床治疗方法以及所面临的问题
软骨损伤目前在临床中较为常见，根据Outerbridge分类系统，膝关节软骨损伤分为0级（正常软骨）、II级（部分软骨缺陷）、III级（全层软骨缺陷）、IV级（骨软骨缺陷）四个等级。

在解剖学上，尽管软骨下骨富含血管、淋巴和神经，但是关节软骨缺
乏神经、血管和淋巴系统，因此软骨一旦出现损伤将愈合缓慢或者难以愈合[4]。

对于骨-软骨损伤的患者尤其需要手术治疗[25]。

临床上常见的软骨损伤修复手术治疗大致可分为三类：（1）姑息治疗（清创或软骨成形术），（2）修复治疗（微骨折或钻孔），和（3）恢复治疗（自体软骨细胞植移植术[ACI]、自体骨软骨移植和异体骨软骨移植）[26]。

1.2.1软骨清创术
软骨清创术指的是在关节镜下清除受损的软骨碎片，术后辅以其他的保守治疗的方法。

目的在于减轻患者的疼痛、交锁等症状，有研究表明清创术早期对缓解疼痛症状疗效尚可，但是对于较大的软骨缺损，术后多以纤维软骨修复为主，并不能改变软骨退变的病程[27]。

1.2.2微骨折技术
微骨折技术暴露软骨下骨髓并在软骨缺损处形成血凝块，最终招募间充质干细胞，用纤维软骨瘢痕愈合缺损。

由于技术简单、手术时间相对较短、成本较低，且不需要额外的设备，微骨折术已成为软骨缺损的一种流行的一线治疗方法[28，29]。

但是研究表明，由于微骨折术只能达到纤维软骨瘢痕愈合，长期效果并不确切[30，31]。

1.2.3骨软骨移植术
根据供体骨软骨的来源不同，可将骨软骨移植术分为自体与同种异体骨软骨移植术。

利用自体骨软骨移植技术，缺损可立即被成熟的透明关节软骨所填补。

研究表明，大约90%接受股骨髁或胫骨平台自体软骨移植术的患者在术后10年仍具有良好或极好的效果，但是供体不足以及供体部位损伤限制了该技术的应用[32]。

同种异体软骨移植术骨同样存在供体不足的缺点，同时还可能因免疫排斥反应导致移植失败。

1.2.4自体软骨细胞移植
自体软骨细胞移植术指的是通过手术从关节的低负重区域收集全层样本，分离出软骨细胞并在体外进行扩增，随后再次通过手术的方式将软骨细胞移植到软骨缺损处，然后覆盖一层骨膜。

这种技术对人体损伤小，以透明软骨修复为主，长期随访有效率可达70%以上尤其适用于较大面积的软骨缺损的修复[33，34]。

在中长期的随访中发现，自体软骨细胞移植术的有效率可达70%以上，尤其适用于较大面积的软骨损伤修复[35]。

尽管自体软骨细胞移植术主要形成透明软骨为主，但该技术仍有其不足之处，如患者需要经历两次手术，治疗周期长，骨膜覆盖修复使组织过于肥厚等，甚至部分病例由于软骨细胞去软骨化而形成纤维软骨影响疗效[36]。

1.3组织工程技术治疗骨软骨损伤的研究进展
鉴于传统手术修复软骨损伤存在诸多的不足，组织工程技术是目前软骨修复的研究热点。

组织工程指的是应用工程学和生命科学的原理来开发生物替代物，以恢复、维持或改善组织功能[37]。

生物相容性支架、细胞和生物活性分子是骨软骨损伤修复诊治工程的三大要素[38]。

另外，在上段我们描述骨软骨复合体由软骨、钙化软骨和软骨下骨组成，它们在细胞以及细胞外基质组成、结构以及营养代谢上具有巨大的差异，同时功能、结构上又相互依存。

利用组织工程技术修复骨软骨损伤的难点在于构建合适的支架以及创造合适的条件，分别修复软骨、钙化软骨以及软骨下骨，更好恢复其功能状态。

1.3.1骨软骨修复支架材料
软骨再生支架的材料主要是由具有生物相容性和生物可降解的聚合物组成。

软骨层中使用的聚合物可分为天然聚合物和合成聚合物。

天然聚合物主要为明胶、壳聚糖、透明质酸、胶原蛋白、藻酸盐、糖胺聚糖等。

大多数天然聚合物含有特定的分子域，可以促进软骨细胞的增殖和分化[39]。

然而，与其他材料相比，天然聚合物具有低刚度和弱生物力学[40]。

合成聚合物优于天然聚合物，具有受控的降解动力学和受控的机械性能。

常用的修复软骨的有聚乳酸（polylactic acid，PLA）、聚乳酸/乙醇酸共聚物（Polymer of polyglycolic acid and polylactic acid，PLGA）、聚乙醇酸（Polyglycolic acid，PGA）、聚乙二醇（Polyethylene glycol，PEG）、聚已内酯（Polymer ofε-caprolactone，PCL）等[41]。

在骨层修复支架中，由于机械性能以及诱导成骨的需要，往往要加入无机成分，它们主要包括生物活性玻璃、磷酸钙、硫酸钙等。

1.3.1.1.天然高分子材料
（1）胶原（collagen）
胶原蛋白是ECM中最丰富的蛋白，为结缔组织、肌腱和皮肤等组织器官提供了巨大的抗拉强度和结构完整性。

在体外作为生物材料时，胶原不仅能提供结构完整性，还能调节细胞的增殖和分化能力。

在一项研究中发现，胶原包被的组织培养板能促进间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）的粘附和增殖[42]。

此外，间充质干细胞在注入胶原的聚合物支架中培养时，显示出更大的成骨潜能[43]。

（2）明胶（gelatin）
明胶是由胶原蛋白通过加热和酶变性等方式水解产生，与胶原的分子组成非常类似，
正因为如此，明胶有能力取代胶原蛋白，并在体外发挥类似胶原蛋白的生物材料功能，促进细胞发育。

明胶可从牛骨、鱼、猪皮等多种来源提取，其生物相容性良好，一般不会对人体细胞产生毒性及抗原性，并且可降解[44，45]。

但是机械性能差，热稳定性差和相对较快的降解速度限制了它在骨软骨修复组织工程中的应用[46]。

然而，通过制备明胶复合材料来提高材料的机械稳定性、生物相容性和生物活性可以很容易地克服这些缺点。

（3）海藻酸钠（sodium alginate，SA）
SA是一种来源于褐藻的多阴离子共聚物，SA材料具有水溶性、良好的细胞相容性以及原位交联的能力，同时它还可以延长活化剂的释放并常常用作细胞和粒子释放系统的保护屏障[47]。

另外，可以通过改变其分子量来调节机械性能和降解率，分子量越大则降解性越差，机械性能就越优异[48]。

因此，SA广泛地应用于药物载体、伤口敷料、牙周基质以及骨软骨修复等领域。

通过与二价阳离子进行交联，SA可形成水凝胶，常用于骨软骨的修复。

学者Ansari等[49]开发了一种含有转化生长因子β-1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）的海藻酸/透明质酸水凝胶，该系统可以促进牙周韧带干细胞成软骨分化。

学者Li YJ等[50]利用合适比例的羧甲基壳聚糖和SA成功构建一种软骨修复复合水凝胶，实验结果表明，当氨基与醛基比例为1:1时，该水凝胶具有良好的孔隙率、适宜的成胶时间、较强的附着力、稳定的溶胀率和良好的细胞生物相容性。

（4）丝素蛋白（silk fibroin，SF）
蚕丝主要由SF（72-81wt%）以及丝胶蛋白（18-28wt%）两种结构蛋白组成，SF是一种纤维蛋白，为蚕丝提供良好的机械性能，蚕丝经过脱胶工艺处理后便可以得到SF[51]。

在初级结构中，SF由疏水的重链(Mw=391.6kDa)和亲水性轻链(M w=27.7kDa)以及糖蛋白P25组成，轻重链之间以二硫键相连[52]。

在蛋白质二级结构中，SF有三种构像，分别是无规则卷曲，α螺旋以及β折叠（机械性能较强）。

在一定条件下，SF溶液会发生胶凝反应，其分子构像会从无规则卷曲转变为β折叠[53]。

SF具有极佳的机械性能，有文献报道尽管丝素蛋白重量轻，但其抗拉强度优于其他生物聚合物，如胶原蛋白和聚乳酸，可与尼龙和低碳钢相媲美[54]。

部分研究人员着重于对丝质支架的免疫原性和抗原性进行了深入研究，SF几乎不导致炎症以及免疫反应[55]。

另外，SF在体内降解较为缓慢，其降解产物对人体无毒[56]。

尽管SF具有低免疫原性、良好的生物形容性、可控的降解速度和优越的机械性能，然而，由于缺乏细胞特异性结合位点和生长因子锚固能力，单组分SF支架可能不足以用于骨软骨组织工程。

因此，SF需与透明质酸、壳聚糖等其他生物材料结合，
可制备具有定制特性的复合材料。

学者Nopporn Sawatjui等[57]制备了一种由SF、明胶、透明质酸等组成的多孔复合支架，结果表明该支架可以明显的促进人MSCs成软骨分化。

(5)硫酸软骨素（Chondroitin Sulfate，CS）
CS是骨软骨细胞外基质的重要成分，属于由羧基和硫酸酯基组成的高负极分子氨基聚糖，可作为聚阴离子，吸附并富集带正电荷的生长因子，诱导细胞粘附和分化[58,59]。

在组织工程的应用中，CS作为一种添加剂与其它生物材料混合或共价结合形成生物复合支架。

Hwang N S等[60]将CS加入到PEG支架中，与单纯使用PEG的支架相比，可以增加MSCs中软骨源性标志物、聚集蛋白聚糖、II型胶原和Sox9的表达，同时抑制了MSCs 向肥大软骨细胞的分化，降低了X型胶原的生成。

Dinescu S等[61]将CS植入胶原-丝胶蛋白支架中，也证实了MCSs沿软骨形成途径的分化。

另外，还有相关研究表明CS不仅仅可以促进软骨细胞增殖，同时还具有免疫抑制减轻炎症反应的作用[62]。

1.3.1.2人工合成高分子材料
（1）聚乙醇酸（Polyglycoic acid,PGA）
PGA具有良好的生物相容性。

由于其链结构的规律性，PGA是高度结晶的，它在水溶液或体内降解速度较快，一般在2-4周内失去其机械完整性，这取决于材料的分子量、物理结构和降解条件。

PGA是第一个合成可吸收缝线的材料也是当今组织工程中应用最广泛的支架材料之一[63,64]。

学者Christoph Erggelet等[65]利用PGA与透明质酸合成一种支架移植到羊软骨缺损模型中，6个月后软骨缺损被很好的修复，且主要以透明软骨以及II 型胶原修复为主，明显优于对照组微骨折术。

另外一项研究利用负载MCSs的PGA-HA 支架修复兔膝关节全层软骨缺损也取得了良好的效果[66]。

（2）聚乳酸（polylactic acid,PLA）
PLA是由乳酸聚合而成，PLA比PGA更疏水性，这是由于PLA的重复单元中有更多的甲基。

PLA具有良好的生物相容性以及机械性能，降解产物对人体组织细胞无毒，因此也广泛应用于组织工程中，它的主要缺点是加工性能差，脆性大，韧性低，细胞粘附性差，可通过与其他材料符合来改善其性能[67]。

（3）聚乳酸/乙醇酸共聚物（Polymer of polyglycolic acid and polylactic acid，PLGA）PLGA由乳酸与羟基乙酸随机聚合而成，由于其具有良好生物相容性、降解速率的可调性、良好的机械性能特别是韧性、优良的加工性等突出优点。

被广泛的应用于组织工程中[68]。

学者Pingguo Duan等[69]通过控制骨层与软骨层的孔隙的大小合成了一种PLGA。