诃子提取物清除自由基活性研究

诃子提取物清除自由基活性研究
刘鑫;熊斌;张耀华;周红审;陈丽华
【摘要】10.3969/j.issn.1007-5119.2012.06.020% 考察了诃子提取物及其色谱纯化物(a、b、c)清除自由基的活性能力,进行了1,1-二苯基-2-苦肼基(DPPH·)清除试验.结果表明,甲醇提取物、乙酸乙酯提取物及其色谱纯化物均具有清除自由基活性的能力,甲醇粗提物活性略高于等体积1 mg/mL TBHQ,而其色谱纯组分 c 的活性最高,约为1 mg/mL TBHQ 的1.2倍,且略高于茶多酚；乙酸乙酯组分色谱纯组分 a,b 抑制率分别为其粗提取物的1.6和1.1倍.色谱纯成分经显色反应、UV 和 H1NMR 检测后被确认为诃黎勒酸衍生物或诃子单宁水解碎片,此为诃子提取物作为烟用自由基清除剂提供了有效的理论依据.
【期刊名称】《中国烟草科学》
【年(卷),期】2012(000)006
【总页数】5页(P97-101)
【关键词】烟草;诃子;1,1-二苯基-2-苦肼基;诃子单宁;自由基清除剂
【作者】刘鑫;熊斌;张耀华;周红审;陈丽华
【作者单位】湖北中烟工业有限责任公司技术中心,武汉 430051;湖北中烟工业有限责任公司技术中心,武汉 430051;湖北中烟工业有限责任公司技术中心,武汉430051;湖北中烟工业有限责任公司技术中心,武汉 430051;河南平顶山工学院,河南平顶山 467036
【正文语种】中文
【中图分类】S572.099
近年来，有关吸烟与健康的研究结果表明，卷烟烟气自由基可直接损伤机体内细胞和酶等物质，并与DNA结合使细胞转化而产生突变；其间接毒性可在体内激活和产生大量活性更高、毒性更大的其他自由基，如超氧自由基和羟基自由基，从而导致多种病变[1]。

目前，合成抗氧化剂往往有毒副作用，它们逐步被取代是大势所趋。

因此，开发出高效无毒的天然自由基清除剂应用于卷烟制品，对于降低吸烟的危害具有十分重要的意义。

诃子系君子科植物诃子树（Terminalia Chebula Ritz）的果实，原产印度、缅甸等国，在西藏、云南等省区均有分布。

《药性论》记载其“味酸涩、温无毒”，有敛肺、涩肠、下气之功效。

药理试验表明，诃子具有明显的抗艾滋病、抑制恶性肿瘤、抑菌等作用，它含有约30%～40%[2]的鞣质，而诃子鞣质具有良好的抗氧化功能[3-6]。

诃子在医药及油脂抗氧化方面的研究较多，而对降低香烟烟气自由基含量的应用报到较少[7-8]，且多为粗提物，作用成分不明。

本研究对诃子提取物进行色谱纯化，并通过显色反应、UV和H1NMR检测后确认其清除自由基的活性物质主要为诃黎勒酸衍生物或诃子单宁水解碎片等，为诃子提取物作为烟用自由基清除剂提供了有效的理论依据。

1 材料与方法
1.1 材料和试剂
诃子购于中药城，DPPH·购于Sigma-Aldrich公司。

其余试剂均为国产分析纯。

试验于2008—2009年进行。

1.2 主要仪器及设备
721紫外可见分光光度计；ZF-C三用紫外分光计；TGL-18C高速台式离心机；HG101-1B电热鼓风干燥箱；2110 Fraction collector离心沉淀器。

1.3 方法
1.3.1 诃子中清除自由基活性成分的提取与分离200 g诃子粉（粉碎至40目）以
甲醇回流提取2次（固液比1:6），每次2 h，合并滤液，浓缩至浸膏状，浸膏用
乙酸乙酯萃取，萃取液减压浓缩至干，称重，定容并计算得率和浓度。

1.3.2 显色法跟踪试验根据三氯化铁溶液、茴香醛-硫酸、亚硝酸钾-醋酸溶液、碘酸钾饱和溶液、α-萘酚等显色试验[9]来判断其主要成分类别。

1.3.3 DPPH·法活性跟踪试验将提取物（分别以提取剂为溶剂）、茶多酚和特丁基对苯二酚（TBHQ，以甲醇为溶剂）分别配成5个浓度梯度溶液。

再将DPPH·用
各对应溶剂分别配成1×10-4 mol/L的溶液7份。

取2 mL不同浓度的样品溶液
分别加入到2 mL相对应的D P P H·溶液中，总体积4 mL，摇匀，25 ℃保温30 min，于517 nm测定吸光值（A样品）（以2 mL样液+2 mL对应溶剂混合调零）。

2 mL相应溶剂加到2 mL DPPH·液中空白对照，测定空白的吸光值（A空白）（以4 mL对应纯溶剂调零）[10]。

计算抑制率公式为：
抑制率（%）=（A空白－A样品）/A空白×100%
1.3.4 乙酸乙酯和甲醇组分的色谱纯化分别对乙酸乙酯和甲醇组分进行硅胶柱层析，从乙酸乙酯组分得色谱纯组分a和b；甲醇组分得到色谱纯组分c。

1.3.5 色谱纯成分的结构鉴定对a、b、c溶液进行显色试验、紫外（UV）和核磁
共振法（H1NMR）进行结构鉴定。

2 结果
2.1 浓度和得率
按照试验方法对诃子进行分步提取，甲醇提取物和乙酸乙酯得率分别为40.8%和4.18%。

2.2 甲醇和乙酸乙酯提取物的活性跟踪
2.2.1 显色反应跟踪提取物组分显色试验结果见表1。

2.2.2 DPPH·法活性跟踪采用DPPH·法活性跟踪法测定不同浓度下的A值，计算其抑制率，并绘制其抑制率曲线如图1。

观察抑制率曲线发现：（1）TBHQ和甲醇组分的抑制率较高，但随浓度升高数值变化不大，即对自由基的清除效果的量效关系并不明显。

（2）茶多酚和乙酸乙酯组分呈上升状，表明其活性与浓度成正比关系，但乙酸乙酯组分清除自由基的活性弱于茶多酚。

2.3 乙酸乙酯和甲醇组分的色谱纯化
乙酸乙酯和甲醇提取物显色试验中均呈现不同程度的蓝绿色，说明均含有多酚类物质，进一步对乙酸乙酯和甲醇提取物进行硅胶柱层析。

柱层析纯化过程中，采用薄层分析板三氯化铁显色跟踪，最后得色谱纯两个纯组分，重量分别为2.689 g和0.026 g，用甲醇分别定容到 50 mL后，浓度各为53.79 g/L和0.52 g/L，分别命名为样a和b。

甲醇组分色谱纯化后重0.385 g，用甲醇定容50 mL，其浓度为7.04 g/L，命名为样c。

表1 两组分显色试验结果Table 1 The color test of the purified components 注：“－”表示显色反应呈阴性。

提取物组分三氯化铁茴香醛-硫酸亚硝酸钾-醋酸碘酸钾α-萘酚成分判断乙酸乙酯浅蓝黑色－红转黄褐红转褐色深紫色环多种水解单宁和低聚合度的缩合单宁甲醇浅蓝黑色－黄色红转褐色深紫红色环成分复杂
图1 甲醇组分、乙酸乙酯组分、茶多酚及TBHQ对DPPH·的抑制活性Fig.1 Methanol fractions, the ethyl acetate fractions, tea polyphenol and TBHQ on DPPH· inhibit ory activity
2.4 色谱纯组分清除自由基活性检测和化学成分定性鉴定
2.4.1 显色法定性鉴定滤纸层析和α-萘酚法对色谱纯组分a、b、c显色，其结果
如表2和图2所示。

条形纸层析在BAW 和 6%的冰乙酸中展开，并在紫外灯254 nm下观察，其显色结果见表3。

综合表2、3的显色结果，可以推断样a属水解单宁中的棓单宁，是多个棓酸与邻苯三酚型酚羟基醇形成的六羟基联苯二酸酯；样b为缩合单宁，由于含有邻苯二
酚的单宁在三氯化铁溶液显色下才呈绿色，它是羟基黄烷类单体形成的缩合物，单体间以碳-碳键连接，遇浓硫酸生成暗红棕色沉淀；样c的纸层析在紫外灯254
nm下观察呈紫色[11]，在BAW的上层和6%的醋酸中它们的Rf值分别为0.42
和0.12，这与葡萄糖棓酸酯在紫外光下的呈色以及纸色谱上以BAW为展开剂的
比移值（Rf）大体相近，至于6%的醋酸为展开剂时，其Rf值随分子中棓酰基的
个数增加而下降。

根据上述推测，它的结构应为1β,2,3,4,6-五-O-棓酰-β-D-吡喃葡萄糖。

表2 色谱纯组分a、b、c显色情况Table 2 The color test of the purified components注：“－”表示显色反应呈阴性。

色谱纯组分 FeCl3茴香醛-硫酸亚硝酸钾醋酸碘酸钾饱α-萘酚a 蓝色－褐色红转褐色紫红环b 绿色－－浅红
色红棕色沉淀c 蓝色－褐色红转褐色，拖尾严重紫红色的环
图2 色谱纯组分滤纸层析样图Fig.2 Chromatography paper chromatography sample of the purified components
表3 条形纸层析显色结果Table 3 The color test of the strip paper chromatography样液展开剂 a b c BAW的上层 Rf 0.65，天蓝色，条状 Rf 0.66，浅蓝色 Rf 0.42，紫色到深蓝色6%醋酸 Rf 0.43，淡红色 Rf 0.42，淡红色 Rf
0.12，淡红色锥形斑
2.4.2 紫外（UV）和核磁（NMR）结构测定结果从紫外图谱上观察，a样的UV （MeOH）的波峰为219、202.5、275 nm，b样UV（MeOH）的波峰为200、220 nm，c样的UV（MeOH）的波峰为274、205、222.5 nm。

根据参考文献
[2]中的数据，a样与诃黎勒酸的波峰相对应，可大概判断为诃黎勒酸。

b样和c样的紫外波峰数据没有记载，但b和c的显色反应表明它们具有诃子单宁的特征，
结合核磁图谱（图3、4）分析推测，它们属诃子大家庭中的一员，是诃黎勒酸的
变体或诃子单宁的水解碎片。

组分 b和c的推测结构见图5、6。

图3 b组分核磁图谱Fig.3 The H-NMR spectra of the b component
图4 c组分核磁图谱Fig.4 The H-NMR spectra of the c component
图5 核磁图谱推测b组分结构Fig.5 b component structure
图6 核磁图谱推测c组分结构Fig.6 c component structure
2.4.3 色谱纯组分抑制DPPH·活性的检测结果采用DPPH·法活性跟踪法测定a、b、c样不同浓度下的A值，计算其抑制率，结果见表4。

表4 色谱组分a、b、c各浓度下的抑制率Table 4 The purified component on DPPH· inhibitory activity色谱组分0.2/(mg·mL-1)0.4/(mg·mL-1)0.6/(mg·m L-1)0.8/(mg·mL-1)1.0/(mg·mL-1)茶多酚 13.04 17.39 39.13 73.91 82.61 TBHQ 47.9 58.33 66.17 70.80 75.00 a 42.6 60.00 72.50 86.00 74.00 b 17.8 21.4 27.0 40.7 59.1 c 44.0 54.7 67.5 76.0 86.49
试验结果表明，纯化后 a、b、c样的清除DPPH·自由基的效果有了明显的提高，a、b样的最大抑制率分别为其所在乙酸乙酯粗提取物的1.6倍和 1.1倍，c样的
最大抑制率为其所在甲醇粗提取物的1.1倍，其中清除效果最好的c样比茶多酚还好，同时是TBHQ的1.2倍。

3 结论
（1）诃子甲醇提取物和乙酸乙酯提取物，对清除自由基都具有一定的效果。

甲醇组分的抑制率较高，但随浓度升高数值变化不大；乙酸乙酯组分的活性与浓度成正比关系。

（2）甲醇提取物和乙酸乙酯提取物纯化后活性提高，其纯化后a、b、c样最大抑
制率分别为其所在提取物的1.6、1.1和1.1倍。

其主要活性物质为棓单宁、鞣花
单宁及水解单宁碎片等多酚类物质。

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