2×CTAB法植物总DNA提取

2×CTAB法植物总DNA提取
1. 液氮研磨1g左右的植物组织，转移到离心管中。

改用研磨枪在冰上研磨，不加β-巯基乙醇
研磨时可加入适量的PVP、β-巯基乙醇。

若CTAB准备2-3天内用完，则可将PVP、β-巯基乙醇直接加入其中。

2. 加入500µl的2*CTAB (60℃或65℃预热) ,颠倒混合均匀后在60℃或65℃水浴30m-1h 小时,其间要上下颠倒混匀数次。

3.取出离心管，加入等体积的24：1（三氯甲烷：异戊醇），上下颠倒充分混合。

若量多，则可以直接侧立于摇床上晃动10分钟。

4.12000转速离心5-10min。

将离心管动作轻缓的取出转子，放置于离心管架上。

a.离心后溶液分三层：上层为水相；中层为碎片和蛋白相；底层为氯仿
b.迅速进入下一步，以免各相混合
5.用移液枪吸取管中上层水相，动作一定要轻缓，不可搅动其它两层。

a.此步骤要宁舍不贪多，尽量避免吸取到下层液体。

b.若上步骤中中间层较厚，则继续加入等体积24：1，再次抽提一次，直至中间层较薄。

6.在抽提出的水相中加入1/3体积的5M的KAc及等体积的异丙醇（4℃预冷），轻轻晃动混合均匀后在-20℃沉淀。

沉淀至少15分钟至过夜。

6-1 在抽提出的水相中加入1/10体积醋酸钠（pH5.2, 3M），混匀后，加入2倍体积预冷的无水乙醇，-20℃沉淀15min至过夜。

6-3. 在抽提出的水相中加入加入2倍体积预冷的无水乙醇，-20℃沉淀15分钟至过夜。

a.时间越长，DNA的产量越多，污染也越多
7. 12000转速离心5-10min，去上清，倒置于吸水纸上数分钟，加入700µl 70%的酒精，上下颠倒数次，洗涤沉淀。

12000转离心5-10m，去上清，倒置于吸水纸上数分钟。

重复一遍。

8. 12000转速离心5-10min，去上清，倒置于吸水纸上数分钟，最后置于超净工作台中吹干。

9. 在离心管中加入30-50µl的灭菌去离子水或者TE溶液，4℃放置数小时，使其充分溶解。

10.用琼脂糖凝胶检测结果。

11. -20℃—— -70℃低温保存。

去除总DNA中的 RNA污染先做预扩增实验，若RNE污染无严重影响则舍去该步骤
A
1. 在总DNA溶液中加入灭菌去离子水或者TE溶液调整总体积至200µl, 加入10µRNase-A （10mg/ml）4℃过夜，或者37℃ 1h .
2. 用等体积的24：1抽提。

3. 沉淀DNA——洗涤DNA——干燥DNA——溶解DNA—— -20℃—— -70℃低温保存。

B 直接加入10µRNase-A（10mg/ml）后冷冻保存。

试剂配方
高温高压灭菌后，室温保存
注意：应该在溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大，温度每升高1℃，溶液的pH大约降低0.03个单位
室温保存
室温保存
注：只有pH值接近8.0时，EDTA才能完全溶解。

溶解过程可在磁力搅拌器上剧烈搅拌。

耗材准备：
需要灭菌者：1.5ml离心管、研磨枪头、蓝色枪头、黄色枪头、
其他：卫生纸（吸水用）、镊子、封口膜、挑菌针、酒精灯、70%酒精、离心管架子、离心管盒子、移液枪。

CTAB法提取植物基因组
药品：
2*CTAB
终浓度组分药品用量
0.1M/L 1M Tris-HCl(pH8.0) 100ml
20nM/L 0.5M EDTA(pH8.0) 40 ml
NaCl 82g
CTAB 20g
PVP40 20g
加去离子水800ml 充分溶解定容到1L。

120℃ 1.5个大气压，灭菌20分钟
用之前加0.2-1%的
0.5M EDTA(pH8.0)
配制量：1L
配制方法：
1. 称取186.1g Na2EDTA•2H2O，置于1L烧杯中。

2. 加入约800mL的去离子水，充分搅拌。

3. 用NaOH调节pH值值8.0（约20g NaOH）。

注意：pH值至8.0时，EDTA才能完全溶解。

4. 加去离子水将溶液定容至1L。

5. 适量分成小份后，高温高压灭菌。

6. 室温保存
1M Tris-HCl(pH8.0)
氯仿：异戊醇24:1 异丙醇
流程
1、研钵预冷，叶片放入研钵，加液氮，研磨成粉末，用小勺放入2.0mlEP管。

2、加入65℃预热的2*CTAB 600ul,摇匀;
3、65℃水浴1小时，10min摇动一次
4、12000rpm离心10min, 取上清到一新的EP管中。

（次步骤视情况可省略）
5、加入200ul 氯仿：异戊醇( 24:1)。

6、12000rpm离心10min, 取上层水相到一新的EP管中。

7、加入等体积的异丙醇，轻轻上下摇动10次，静置10min。

8、12000rpm离心10min，弃上清
9、加入75%乙醇1.0ml,摇动
10、12000rpm离心2min，弃上清
11、吸取多余乙醇，室温吹干
12、加入50ul的ddH2O,或TE溶解。

-20℃保存
CTAB法提取植物基因组DNA
CTAB法原理
CTAB（Cetyl trimethyl ammonium bromide），十六烷基三甲基溴化铵，是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，能与核酸形成复合物，具有从低离子强度溶
液中沉淀核酸的特性。

当降低溶液盐浓度到一定程度（0.3 mol/L NaCl）时，CTAB-核酸的复合物从溶液中沉淀，通过离心就可将其与蛋白，多糖类物质分开，在经过有机溶剂抽提，去除蛋白，多糖，酚类等杂质。

最后通过乙醇或异丙醇沉淀DNA，而CTAB 溶于乙醇或异丙醇而除去
在高离子强度的溶液中(>0.7mol/L NaCl)，CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，不能沉淀核酸。

CTAB溶液在低于15℃时会形成沉淀析出，因此，在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。

另外，它还能保护DNA不受内源核酸酶的降解。

主要试剂与溶液的配制：
PVP（聚乙烯吡咯烷酮K30）
巯基乙醇
氯仿︰异戊醇（24︰1）
异丙醇
70%乙醇
Tris-苯酚
RNaseA
无水乙醇
CTAB 溶液：CTAB——20g/L
NaCl（58.44）——1.4 mol/L（81.816g）
EDTA（292.25）——10 mmol/L（2.9225g）
Tris（121.14）——100 mmol/L（12.114g）
pH 8.0
1×TE 缓冲液：EDTA（292.25）——1 mmol/L（0.29225g）
Tris（121.14）——10 mmol/L（1.2114g）
pH 8.0
NaAC溶液：NaAC（82.03）——3mol/L（246.09g）
pH 4.0
植物总DNA的提取
1、取适量甘薯新鲜叶片，用液氮迅速研磨，中间加PVP（聚乙烯吡咯烷酮K30）少许，成粉末后转入10mL的离心管中，放入液氮或-80℃冰箱储存（在研磨样品时，研的细和研的粗，提出的DNA量可以相差几倍，所以，在液氮保护的很好的情况下尽量多研磨几次）。

2、将（200ml）CTAB溶液放于65℃水浴锅中预热。

3、加4ml巯基乙醇到预热的200mlCTAB中。

4、速加3ml预热的CTAB到装有粉末的10mL离心管中，之后放入65℃水浴
锅中，保温30~60min，期间轻摇数次（一般20min左右一次，刚投入水浴时可以稍快速的晃动，之后的晃动一定要轻柔）。

5、加入3~4ml氯仿︰异戊醇（24︰1）（在通风橱中操作），轻摇混匀至乳白色（100~200次，剧烈晃动会使DNA机械切割）。

6、15~20℃，11000 rpm离心15min（CTAB配平，相对应的离心管，质量相差<0.03g）。

7、取上清（用剪过的枪头进行操作，过尖的枪头会把DNA链弄断。

），加0.6倍体积的异丙醇，摇均（有絮状物析出，可放入4℃冰箱过夜）。

8、用毛细玻璃管将DNA絮状物挑出（DNA絮状物尽量要挑出，不要离心，因为离心后虽然产量会增大，但是不完整的DNA也增多）（或4℃，10000 rpm 离心5min，弃上清），放入新的离心管中，用70%乙醇漂洗2次，放置超净台中吹干。

9、加入2ml 1×TE缓冲液溶解，可放入4℃冰箱保存（酶活性在4℃或65℃水浴中最低，防止酶降解DNA）。

10、未溶解的，可放入65℃水浴中促其溶解，10min后拿出冷却至室温，可重复，直至溶解。

11、加入2.5ul RNaseA（RNaseA提前拿出融化），10℃离心，升至4000 rpm 即停，使RNaseA和溶液充分混合。

12、37℃水浴，保温1h。

13、加入1ml Tris-苯酚、1ml氯仿︰异戊醇（24︰1），摇均配平，4℃，11000 rpm离心10min。

14、取上清，加1×TE补至2ml，加2ml氯仿︰异戊醇（24︰1）摇均配平，4℃，11000 rpm离心10min。

15、如仍有白色蛋白质沉淀，则重复步骤14。

16、取上清，加0.1倍上清液体积的NaAC，2.5倍上清液体积的无水乙醇（提前放入-20℃冰箱），摇均，放入-20℃冰箱沉淀30min。

17、用毛细玻璃管将DNA挑出（或用无水乙醇配平，4℃，10000 rpm离心4min，弃上清），放入新的离心管中，用70%乙醇漂洗2次，转入1.5ml离心管，放置超净台中吹干。

18、将DNA 溶于适量的1×TE缓冲液中，短期4℃保存，长期-80℃冰箱中储存。

19、取少量DNA溶液进行琼脂糖电泳，胶浓度为0.8%，检测其完整性。

并用紫外分光光度计测其浓度。

注解：
1、PVP(聚乙烯吡咯烷酮)：是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。

2、CTAB：溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；
3、NaCl：提供一个高盐环境，使DNA充分溶解，在于液相中；
4、EDTA：螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；
5、Tris (pH8.0)：提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；
6、β-巯基乙醇：是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除。

7、苯酚：使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。

用苯酚处理匀浆液时，由于蛋白与DNA 联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶，蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。

使用酚的优点：（1）有效变性蛋白质；（2）抑制了DNase的降解作用。

缺点：（1）能溶解10-15%的水，从而溶解一部分poly(A)RNA。

（2）不能完全抑制RNase的活性。

8、氯仿：克服酚的缺点，加速有机相与液相分层。

最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的迹量酚（酚易溶于氯仿中）。

9、异戊醇：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。

异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡产生。

另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA 的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。

基因组DNA提取常见问题：
1、DNA中含有蛋白、多糖、多酚类杂质：重新纯化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等杂质，重新沉淀DNA。

2、DNA在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应：让酒精充分挥发，增加70%乙醇洗涤的次数(2-3次)
3、DNA中有RNA的存留：加入RNase降解RNA。

4、材料不新鲜或反复冻融：尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融，液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液。

5、未很好抑制内源核酸酶的活性：在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时，可增加裂解液中螯合剂的含量。

6、提取过程操作过于剧烈，DNA被机械打断：细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔。

7、外源核酸酶污染：所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌。

8、反复冻融。

将DNA分装保存于缓冲液中，避免反复冻融。

冰冻材料提出高质量的基因组DNA，应确保以下几点：
1、确保采样后立即投入液氮中保存。

2、在磨样时一定要一直使材料处于低温状态。

研磨前先将液氮倒入研钵，研钵彻底冷却后，再放入材料，研磨过程中，一定不要让液氮挥发净使材料回温，否则会DNA降解得很厉害。

装管的时候，先将几个离心管放入一个装有液氮的容器内，将其冷冻一下，
使之处于低温状态，将液氮还为挥发干净的材料放入管内，不要急着盖盖子，因为液氮不挥发干净就盖上会再次弹开。

将离心管放入盛有液氮的容器，等管内的液氮挥发干净盖上盖子即可。

另外，如果是在离心管上编号，最好在冷冻前写好，否则离心管冷冻后材料会受影响不说，也很难写上。

Geini 关于CTAB法提取基因组DNA，原理
CTAB法原理CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化铵)，是一种阳离子去污剂,具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。

在高离子强度的溶液中(>0.7mol/L NaCl)，CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸。

通过有机溶剂抽提，去除蛋白，多糖，酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。

CTAB提取缓冲液的经典配方
Tris-HCl (pH8.0)提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；
EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；
NaCl 提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，在于液相中；CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；
β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除
PVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。

用酚抽提细胞DNA时，有什么作用？
使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。

用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA 联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。

蛋白分子溶于酚相，而DNA 溶于水相。

使用酚的优点：1.有效变性蛋白质；2抑制了DNase的降解作用。

缺点：1.能溶解10-15%的水，从而溶解一部分poly(A)RNA。

2.不能完全抑制RNase的活性。

氯仿的作用？
氯仿：克服酚的缺点；加速有机相与液相分层。

最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的迹量酚。

（酚易溶于氯仿中）
用酚-氯仿抽提细胞基因组DNA时，通常要在酚-氯仿中加少许异戊醇，为什么？
异戊醇：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。

异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡产生。

另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。

用乙醇沉淀DNA时，为什么加入单价的阳离子？
用乙醇沉淀DNA时，通常要在溶液中加入单价的阳离子，如NaCl 或NaAc，Na+中和DNA 分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，而易于聚集沉淀。

简言之，无论哪种抽提方法，药品的作用基本都是一样的。

CTAB法原理(植物DNA提取经典方法)
发布: 2010-06-02 08:20| 来源:生物吧| 编辑:刘浩| 查看: 634 次
原理：CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化铵)，是一种阳离子去污剂,具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。

在高离子强度的溶液中(>0.7mol/L NaCl),CTAB 与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸.通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。

注：CTAB溶液在低于15℃时会形成沉淀析出，因此，在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。

一、CTAB提取缓冲液的经典配方：
Tris-HCl (pH8.0)提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；
EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；
NaCl 提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中；
CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；
β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除。

二、CTAB提取缓冲液的改进配方：
(1) PVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA 中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖；
(2) 蛋白质的去除：酚/氯仿抽提使用变性剂变性(SDS、异硫氰酸胍等)高盐洗涤蛋白酶处理核酸分离，纯
化；
(3)多糖的去除：高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/2体积的5M NaCl，高盐可溶解多糖。

用多糖水解酶将多糖降解。

在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积)，氯苯可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖。

用PEG8000代替乙醇沉淀DNA：在500 μL DNA液中加入200μl 20% PEG8000 (含1.2 M NaCl)，冰浴20min.核酸分离，纯化；
(4) 多酚的去除:在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：β-巯基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等加入易与酚类结合的试剂：如PVP(聚乙烯吡咯酮),PEG(聚乙二醇)，它们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与DNA的结合；
(5) 盐离子的去除：70%的乙醇洗涤核酸吸附,沉淀和溶解使用合适的吸附材料吸附核酸，其它的杂质均被洗掉，达到纯化DNA的目的另一种方式加入1/10体积的NaAc(pH5.2,3M)，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀RNA吸附或沉淀后应用70%的乙醇洗涤，以除去盐离子等若长期储存建议使用TE缓冲液溶解TE中的EDTA能螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNasepH值为8.0，可防止DNA发生酸解。

三、基因组DNA提取常见问题
DNA中含有蛋白、多糖、多酚类杂质。

DNA在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应，DNA中残留有金属离子，有RNA的存留。

对策：重新纯化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等杂质，重新沉淀DNA，让酒精充分挥发，增加70%乙醇洗涤的次数(2-3次)，加入RNase降解RNA。

（1）DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应。

DNA提取常见问题：材料不新鲜或反复冻融、未很好抑制内源核酸酶的活性、提取过程操作过于剧烈，DNA被机械打断，外源核酸酶污染反复冻融。

尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融，液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液。

在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时，可增加裂解液中螯合剂的含量，细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔。

所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌。

将DNA分装保存于缓冲液中,避免反复冻融。

（2）DNA降解，DNA提取常见问题。

实验材料不佳或量少，破壁或裂解不充分，吸附或沉淀不完全，洗
涤时DNA丢失。

尽量选用新鲜(幼嫩)的材料，动植物要匀浆研磨充分；G+菌，酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁。

高温裂解时，时间适当延长(对于动物细胞,细菌可增加PK的用量)。

增加吸附的时间、或低温沉淀小心操作。

要用冰冻材料提出高质量的基因组DNA，应确保以下几点：
1.确保采样后立即投入液氮中保存.
2.在磨样时一定要一直使材料处于低温状态。

研磨前先将液氮倒入研钵，研钵彻底冷却后，再放入材料，研磨过程中，一定不要让液氮挥发净使材料回温！否则会DNA降解得很厉害。

装管的时候，材料一定要有液氮的保护才行！否则研磨时的液氮保护DNA不都前功尽弃了？可以这样做：将几个离心管放入一个容器，向容器中加液氮，将其冷冻一下，使之处于低温状态，将液氮还为挥发干净的材料放入管内，不要急着盖盖子，因为液氮不挥发干净就盖上会再次弹开。

将离心管放入盛有液氮的容器，等管内的液氮挥发干净盖上盖子即可。

另外，如果是在离心管上编号，最好在冷冻前写好，否则离心管冷冻后材料会受影响不说，也很难写上。

提取DNA时加液氮的目的主要是防止DNA的降解，所以必须一直提醒自己，减少材料回温的机会，液氮保护必须自始至终。

3.在用CTAB法提取时，刚投入水浴时可以稍快速的晃动，之后的晃动一定要轻柔！
4.加酚/氯仿/异戊醇静置30min后，离心温度不可过低。

尽量保持在15度以上。

5.将DNA加入异丙醇析出时用的枪头一定要剪过的。

这点很重要。

过尖的枪头会把DNA 链弄断。

6.加入异丙醇后出现的DNA絮状物尽量要挑出，尽量不要离心，因为离心后虽然产量会增大，但是不完整的DNA也增多了。

另外，看楼主的电泳图条带比较弱，看来不只是降解，提取量也比较少。

这里对于增加提取量想说明一点，在研磨样品时，研得细和研得很细，提出的DNA量可以相差几倍！所以，在液氮保护的很好的情况下多研磨几次，要比在后面的过程中离心以增加产量要划得来！
主要试剂的配制
参考（美）萨姆布鲁克（Sambrook，J.）等.分子克隆实验指南（下册）配置如下[94]：
（1）0.5 mo1/L EDTA(pH 8.0)：称取EDTA-Na2 18.61 g，加80 mL双蒸水，磁力搅拌器上剧烈搅拌。

加入7 mL 10 mo1/L NaOH调至pH 8.0再用双蒸水定容到100 mL，在1.03×105Pa下高压灭菌20 min。

（2）5 mol/L NaCl溶液：称取NaCl 29.22 g，溶解于90 mL的双蒸水，加热到80℃溶解，冷却，再用双蒸水定容100 mL，在高压灭菌20 min。

（3）10 mol/L NaOH溶液：称取40.00 g NaOH溶于80 mL的双蒸水，搅拌，定容到100 mL。

（4）1 mol/L Tris-HC1溶液(pH 8.0)：称取12.114 gTris碱，溶于80 mL的双蒸水，加入浓HC1 4.2 mL，调整PH值到8.0，加水定容到100 mL，高压灭菌20min。

（5）10%CTAB（m/v）：称取CTAB 10.00 g，溶解于80 mL的双蒸水，加热促进溶解，加双蒸水定容到100 mL，室温保存。

（6）5 mo1/L KAc溶液(pH 4.8和6.5)：分别称取KAc晶体49.07 g，溶于80 mL的双蒸水，再用冰乙酸调至pH 4.8和6.5，加双蒸水定容到100 mL，在1.03×
105Pa下灭菌20 min。

4℃保存。

（7）3 mo1/L NaAc·3H2O溶液(pH 5.2)：称取NaAc晶体20.412 g溶解于约30 mL 的双蒸水，用冰乙酸调至pH 5.2，加双蒸水定容到50 mL，高压灭菌20 min。

4℃保存。

（8）提取缓冲液（0.4 mol/L葡萄糖，3%PVP，2％β-巯基乙醇）250 mL：称取葡萄糖19.817 g、PVP 7.50 g，加水溶解并定容到250 mL，在1.03×105Pa下灭菌20 min，β-巯基乙醇现用现加。

4℃保存。

（9）裂解缓冲液（3%CTAB；100 mmo1/L Tris-HC1，pH 8.0；20 mmo1/LEDTA，pH 8.0；1.4 mol/L NaCl；2％β-巯基乙醇）100 mL：取10%CTAB 30 mL，加1mol/LTris～HC1(pH 8.0)10 mL，加0.5 mo1/L EDTA(pH8.0)4 mL，加5 mol/LNaCl 28 mL并定容到100 mL，高压灭菌20 min，β-巯基乙醇现用现加。

（11）TE缓冲液(10 mmo1/LTris-HC1，pH 8.0；1 mmo1/L EDTA，pH 8.0)：取Tris-HCl溶液(pH 8.0)1 mL，EDTA(pH 8.0)0.2 mL，用双蒸水定容到100 mL，高压灭菌20 min。

4℃保存。

（12）电泳缓冲液TAE（Tris-乙酸）的配制
50×TAE母液的配制：242.0 g Tris-Bace、57.1 mL冰乙酸、100 ml 0.5mo1/L EDTA(pH 8.0)，用双蒸水空容至1000 mL。

1×TAE电泳缓冲液的配制：取50×TAE 10 mL，再加入490 mL双蒸水，定容至500mL
主要溶液如下：
1）1M Tris-HC1（pH 8.0）：在800mL水中溶解121g Tris碱，用浓HC1调节pH至所需值pH 8.0（约42mL HC1），加水定容1000mL，分装后高压灭菌。

2）0.5M EDTA（pH 8.0）：在400mL水中加入90.05g二水乙二胺四乙酸二钠（EDTANa2·2H2O），搅拌溶解，用NaOH调pH至8.0（约10g NaOH颗粒），定容至500mL，高压灭菌。

3）5 M NaCl：称取292.2 g NaCl，用双蒸水定容到1000mL，高压灭菌备用。

4）TE缓冲液（pH 8.0）：10mM Tris-HC1（pH 8.0），1.0mM EDTA（pH 8.0）。

5）2×CTAB提取液（pH 8.0）：2％（w/v）CTAB，1.4 M NaCl，20mM EDTA，100mM Tris-HC1，0.2%巯基乙醇（v/v）。

即称取CTAB 2 g，加蒸馏水40mL，加1 M Tris-HCl（pH 8.0）10mL、0.5 M EDTA（pH 8.0）4mL和5 M NaCl 28mL，待CTAB溶解后用蒸馏水定容到100mL。

CTAB提取DNA缓冲液配方
CTAB 4g
NaCl 16.364 g
1M Tris-HCl 20ml( PH8.0)
0.5M EDTA 8ml，先用70ml ddH2O溶解, 再定容至200ml灭菌。

TE缓冲液配方
TE的组成浓度为：10mM Tris-HCl ；1mM EDTA PH=8.0，配制过程如下：
量取下列溶液于500ml烧杯中
1M Tris-HCl Buffer PH=8. 0 5ml
0.5M EDTA PH=8.0 1ml
向烧杯中加入约400mldd H2O均匀混合；将溶液定容到500ml后，高温高压灭菌；室温保存.
CTAB法提取植物基因组DNA
1 实验原理
1、在生物体中核酸常与蛋白质结合在一起，以核蛋白的形式存在, 在制备核酸时，通过研磨破坏细胞壁和细胞膜，使核蛋白被释放出来。

2、在浓氯化钠溶液(1～2mol／L)中，DNA核蛋白的溶解度很大，RNA核蛋白的溶解度很小；而在稀氯化钠溶液(0.14mol／L)中，DNA 核蛋白的溶解度很小，RNA核蛋白的溶解度很大。

因此，可利用不同浓度的氯化钠溶液将DNA核蛋白和RNA核蛋白从样品中分别抽提出来。

3、进一步将蛋白等杂质除去，常采用的去除蛋白：用含异戊醇的氯仿振荡核蛋白溶液，使其乳化，然后离心除去变性蛋白质，此时蛋白质凝胶停留在水相和氯仿相中间，而DNA溶于上层水相。

用两倍体积95％乙醇溶液将DNA钠盐沉淀出来。

反复使用上述方法多次处理DNA核蛋白溶液，就能将蛋白等杂质较彻底地除去，得到较纯的DNA制品。

为了彻底除去DNA制品中混杂的RNA，可用RNA酶处理。

生物材料中含有的脂肪物质和大部分的多糖，在用盐溶液分离核蛋白和用乙醇或异丙醇分级沉淀时即被除去。

在DNA提取、制备的过程中，核酸极不稳定，
许多因素可破坏其完整结构：
①化学因素，核酸的结构在pH值4.0—11.0间较稳定，pH值在此范围外就会使核酸变性降解，故制备过程应避免过酸过碱。

②物理因素，DNA分子链很长，是双螺旋结构，既有一定的柔性。

又有一定的刚性，故强机械作用如剧烈搅拌会令DNA分子断裂，不利于收集，应加以避免。

③酶的作用，细胞中普遍存在的核酸酶在细胞壁或膜遭到破坏时被释放出来，它会降解DNA分子。

故须用酶的变性剂、抑制剂使之失活。

常用的酶抑制剂有柠檬酸盐、氟化物、砷酸盐、乙二胺四乙酸盐、(ETDA-Na)等。

操作过程最好在低温(0℃左右)下进行。

SDS和苯酚作为蛋白变性剂，同时可使核酸酶被破坏而失活。

CTAB法原理
CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化铵)，是一种阳离子去污剂，具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。

在高离子强度的溶液中(>0.7mol/L NaCl)，CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸。

通过有机溶剂抽提，去除蛋白，多糖，酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。

CTAB分离缓冲液
2%CTAB， 1.4mol/LNaCL, 20mmol/LEDTA（PH8.0), 100mmol/LTris-HCL(pH8.0), 0.2%巯基乙醇
100mL：2gCTAB，8.18g NaCL，0.74g EDTA.Na2.2H2O，加入10mL 1mol/L的Tris-HCL(pH8.0), 0.2mL巯基乙醇，加水定容到100mL。

1、Tris-HCl (pH8.0)提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；
2、EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；
3、NaCl 提供一个高盐环境，使DNP充分溶解于液相；
4、CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；
5、β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除; PVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。

1、用酚抽提细胞DNA时，有什么作用？
使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。

用苯酚处理匀浆液时，由于蛋白与DNA 联结键已断，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。

蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。

使用酚的优点：1.有效变性蛋白质；2抑制了DNase的降解作用。

缺点：1.能溶解10-15%的水，从而溶解一部分poly(A)RNA。

2.不能完全抑制RNase的活性。

所以提取RNA时只用氯仿抽提。

2、氯仿的作用？
氯仿：加速有机相与液相分层；去除核酸溶液中的迹量酚。

（酚易溶于氯仿中）
3、用酚-氯仿抽提细胞基因组DNA时，通常要在酚-氯仿中加少许异戊醇，为什么？
异戊醇：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡
(异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡产生。

另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定)
4、用乙醇沉淀DNA时，为什么加入单价的阳离子？
用乙醇沉淀DNA时，通常要在溶液中加入单价的阳离子，如NaCl 或NaAc，Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，而易于聚集沉淀。

1.十六烷基三乙基溴化铵（CTAB）法
在目前众多的DNA提取方法中，CTAB法是其中最为广泛应。