针刺留针与否对血管性痴呆大鼠认知功能及皮层神经元损伤的影响

针刺留针与否对血管性痴呆大鼠认知功能及皮层神经
元损伤的影响
摘要：目的?^察留针与不留针情况下针刺“百会”配伍“足三里”对血管性痴呆（VD）大鼠认知功能及大脑皮层神经元损伤的影响，探讨留针与否的针刺效应。

方法采用永久性双侧颈总动脉结扎方法建立VD 大鼠模型。

实验大鼠随机分为假手术组、模型组、留针组、不留针组，每组8只。

针刺模型大鼠“百会”+“足三里”后，Morris水迷宫实验检测大鼠空间学习记忆能力，尼氏染色检测大鼠大脑皮层神经元损伤。

结果与假手术组比较，模型组大鼠空间学习记忆能力明显降低，皮层神经元损伤明显；与模型组比较，留针组、不留针组空间学习记忆能力均显著提高，皮层神经元损伤改善；其中，留针组空间学习记忆能力提高更多，
皮层神经元损伤改善更明显。

结论针刺可改善VD大鼠空间学习记忆能力和皮层神经元损伤，留针效果更好。

关键词：血管性痴呆；针刺效应；留针；认知功能；皮层神经元；大鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.05.014
中图分类号：R245 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2018）05-0061-05
Effects of Acupuncture Needle Retaining or Not on Cognitive Function and
Cortical Neurons in Rats with Vascular Dementia
LI Tian-ran1，2，YE Yang2，YANG Jing-wen2，XIAO Ling-yong2，
WANG Xue-rui2，3，YAN Chao-qun2，SHAO
Jia-kai2，LIU Cun-zhi4
1. Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China；
2. Acupuncture Center Affiliated to Beijing Hospital of TCM Affiliated to Capital Medical University，Beijing 100010，China；
3. Beijing Institute of Traditional Chinese Medicine，Beijing 100010，China；
4. Dongfang Hospital，Beijing University of
Chinese Medicine，Beijing 100078，China
Abstract：Objective To compare the effects of acupuncture needle retaining or not in “Baihui” compatibility “Zusanli” on cognitive function and cortical neurons in rats with vascular dementia （VD）；To discuss the acupuncture effects of acupuncture needle retaining or not. Methods VD
model was established by permanent bilateral common carotid arteries occlusion. The experimental rats were randomly divided into
sham-operation group，model group，needle retaining group，without needle retaining group，with 8 rats in each group. The acupoints “Baihui” and “Zusanli” were used. Morris water maze test was employed to detect the abilities of spatial learning and memory in rats. Nissl’s staini ng and immunofluorescence technique were used to observe the status of cortical neurons. Results Compared with sham-operation group，the abilities of spatial learning and memory decreased significantly and the injuries of cortical neurons were severe. Compared with model group，the abilities of
spatial learning and memory in needle retaining group and without needle retaining group increased significantly and the injuries of cortical neurons were improved，among which，the abilities of spatial learning and memory was increased more，and the injuries of cortical neurons were better improved in the needle retaining group. Conclusion Acupuncture can improve the abilities of spatial learning and memory and cognitive function，and acupuncture needle retaining has better effects.
Keywords：vascular dementia；acupuncture effects；needle retaining；cognitive function；cortical neurons；rats
基金项目：北京市教育委员会科技计划重点项目（KZ201710025025）
通讯作者：刘存志，E-mail：lcz623780@ 血管性痴呆（vascular dementia，VD）是指以缺血缺氧性或出血性脑损伤造成的记忆、认知及行为等脑区低灌注的脑血管疾病所致的严重认知功能障碍综合征。

我国65岁以上老年人VD患病率为1.2%～4.2%，70岁以上老年人年发病率为每千人6～12例[1]。

与学习记忆有关的脑内结构主要是大脑皮质联合区、海马及其邻近结构。

其中，大脑皮层特别是额叶、颞叶是远事记忆信息转变、贮存的主要部位[2]。

在慢性脑血流灌注不足时，模型大鼠大脑皮质中出现大量神经元凋亡[3-4]。

本课题组前期研究表明，针刺可改善VD模型大鼠的空间学习记忆能力，该作用可能是通过减轻氧化应激[5-6]、神经元凋亡[7]、神经炎症等机制实现的。

在针刺治疗疾病的过程中，留针与否尚存在一定争议
[8-9]。

本课题组前期研究发现，针刺“百会”“足三里”
能有效改善慢性脑低灌注引起的大鼠学习和记忆功能损害。

本研究拟通过行为学和病理学方法，观察留针与否对VD大鼠认知功能和皮层神经元损伤的影响，以期为临床上针刺治疗VD是否留针提供一定的参考。

1 材料与方法
1.1 动物及分组
SPF级SD雄性大鼠32只，4月龄，体质量270～300 g，北京?S通利华实验动物技术有限公司，动物许可证号SCXK（京）2012-0001。

饲养于中国中医
科学院中医基础理论研究所清洁级动物房。

所有动物实验均满足动物伦理委员会的要求。

根据随机数字表将动物分为假手术组、模型组、留针组、不留针组，每组8只。

1.2 主要试剂和仪器
戊巴比妥钠（P3761，Sigma），多聚甲醛（广州晶欣生物科技有限公司），乙醇（北京化工厂），碘伏（青岛海诺生物工程有限公司），中性树脂（国药集团化学试剂股份有限公司），Morris水迷宫系统（美国CSI公司），冰冻切片机（德国Leica公司），焦油紫染色液（上海碧云天生物技术公司），DHG-9023A烤箱（上海林频仪器有限公司），光学显微镜（日本Olympus），华佗牌0.25 mm×13 mm一次性针灸针，苏州医疗用品厂有限公司。

1.3 造模
大鼠腹腔注射2.5%戊巴比妥钠（0.2 mL/100 g）麻醉。

颈正中切开皮肤，剥离胸骨舌骨肌、肩胛舌骨肌与胸骨乳突肌，分离双侧颈总动脉，采用5-0丝线将双侧颈总动脉永久性结扎。

切口处滴少许庆大霉素，防止感染。

假手术组除不结扎双侧颈总动脉外其他操
作同手术组。

大鼠术后死亡率为30%。

1.4 Morris水迷宫实验
水迷宫水池直径160 cm，高40 cm，水深30 cm。

池壁上4个等距离点将水池分为4个象限，将平台置于东北象限。

末次针刺后第2日开始水迷宫试验。

水迷宫实验包括定位航行实验和空间探索实验。

定位航行实验反映大鼠的学习能力。

将大鼠背对水池随机从4个不同象限放入水中，记录朝向角（动物开始游泳的方向与“入水点-平台”连线所成的夹角）和逃避潜伏期。

如果90 s内找不到平台（潜伏期记为90 s），则由操作者帮助其上平台，停留30 s，连续训练5 d。

空间探索实验反映大鼠的记忆能力。

在实验第6日撤除平台，选任意相同入水点将大鼠放入水中，记录90 s内大鼠在池中的游泳轨迹和时间及和90 s内跨越原平台象限次数。

1.5 尼氏染色
末次针刺后第2日大鼠灌注，并将脑组织置于4%多聚甲醛液中4 ℃恒温过夜进行后固定。

35%蔗糖溶液浸泡脱水1周，OCT冰冻包埋剂包埋，冠状位连续10 μm厚度冰冻切片。

将脑片贴于预先明胶处理过的载玻片上，在焦油紫工作液中孵育45 min，用蒸馏水洗去浮色后入特殊分色液，100%乙醇脱水，二甲苯常规脱水后中性树胶封片，光学显微镜下观察，尼氏体为嗜碱性斑块或细颗粒。

在每张载玻片的大脑皮层额叶区分别随机选取5个视野，观察皮层尼氏染色结果并拍照分析。

1.6 免疫荧光
将切片准备好后加入NeuN（Abcam）一抗进行孵育（1∶400，4 ℃冰箱过夜），再加入羊抗兔IgG二抗孵育（1∶400，红色，37 ℃避光60 min），洗涤样
品，封片。

BX53型荧光显微镜下拍照，观察大鼠皮层神经元的损伤情况。

1.7 干预
留针组和不留针组取穴均参照动物穴位图谱[10]取“百会”“足三里”，行捻转补法（捻转角度60次/min）。

留针组行针30 s，留针20 min，不留针组行针30 s，不留针。

2组均每日1次，治疗6 d后休息1 d，连续2周，共治疗12次。

假手术组和模型组由同一实验员进行与针刺组相同时间、相同程度的捉抓刺激。

1.8 统计学方法
采用SPSS17.0统计软件进行分析。

实验数据以―x±s表示。

采用重复测量方差分析比较各组逃避潜伏期；其他数据比较采用方差分析。

P 注：与假手术组比较，*P [5] LI H，LIU Y，LIN L T，et al. Acupuncture reversed hippocampal
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（收稿日期：2017-11-02）
（修回日期：2017-12-06；编辑：华强）。