洞庭湖区两个鲫鱼群体的遗传多样性分析
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TE缓冲液 (10 mmol/L Tris - Cl, 0. 1 mmol/L EDTA , pH 值 810 )中 ,置 4 ℃ 冰箱备用或 - 20 ℃ 冰箱保存 。 PCR 扩增之前 , 将以上 DNA 加适量 TE 稀释后测紫 外光吸收值 ,按 1OD260 = 50 μg基因组 DNA 计算 DNA 浓 度 ;以 λ DNA 为标准 , 取少量 DNA 用 0. 8% 琼脂糖凝胶 (含 0. 5 μg/mL 的溴化乙锭 ) 电泳 ( 5V / cm ) 2 h, 紫外灯下 拍照 ,确定 DNA 的完整性 , 判定样品中是否含有 RNA。 本实验 PCR 扩增所用 DNA 模板严格按以上程序进行检 测并符合要求 。 1. 3 PCR 扩增 PCR 扩增仪为美国 MJ 公司的 PTC - 100, RAPD 扩增 引物购自上海生物工程有限公司 , 使用在银鲫中能稳定 扩增的 随 机 引 物 30 条 。 TaqDNA 聚 合 酶 及 配 套 试 剂 , dNTP,λ DNA / EcoR I + H ind Ⅲ M arker 为上海生物工程有 限公司分装加拿大 BB I公司产品 。 PCR 反应条件 : 反应总体积为 25 μL , 其中含 2. 5 μL μL 25 mmol/L 的 M gCl2 , 2. 5 μL 2 10 ×Reaction Buffer, 2 μL mmol/L 的 dNTP, 2 μL (约 20 ng)引物 , 2 μL 10 ～15ng / μL 0. 5 U / μL 的 TaqDNA 酶 , 12 μL 纯水 。 的模板 DNA , 2 扩增程序参照 Zhou L 等 [ 4 ]的方法并稍作改动 : 94 ℃ 预变 性 7m in; 接着经 94 ℃ 变性 40 s、 38 ℃ 退火 1 m in、 72 ℃ 延伸 115 m in,共 35 个循环 ; 最后再在 72 ℃ 延伸 7 m in。 μg/mL 的 PCR 扩增产物在 1. 5%琼脂糖凝胶 (含 0. 5 溴化乙锭 )中电泳 ( 5V / cm ) 2h, 凝胶成像系统成像 , 观察 并拍照 。 1. 4 数据统计 在数据统计时 , 仅记录清晰且重复性好的 DNA 带 。 根据 M arker各带的迁移率确定扩增产物各带的迁移率 , 同一引物对不同个体扩增出的 RAPD 带 , 只要迁移率相 同都视为同一类型 (性状 ) 记为 1, 缺乏此带的记为 0; 以 此类推 ,将所有个体的 RAPD 条带转换成二元数据矩阵 。 根据 Lynch M [ 5 ] 的方法计算群体内 、 群体间的遗传相似 率 。两个体间的遗传相似率 : S xy = 2N xy / ( N x + N y ) , 其中 N xy 表示个体 x 和 y 之间共有的 DNA 扩增片段数 , N x 和 N y 分别是个体 x 和 y 的 DNA 扩增片段数 。群体内 (间 )
图 1 两个鲫鱼群体由引物 Opp 10、 Opq3 扩增电泳图
表 2 两个鲫鱼群体共 13 个个体间的遗传相似率
鱼名
P- 1 P- 2 P- 3 P- 4 P- 5 Y- 1 Y- 2 Y- 3 Y- 4 Y- 5 Y- 6 Y- 7 Y- 8 P- 1 1. 0 0. 9882 0. 9907 0. 9839 0. 9818 0. 7606 0. 7601 0. 7488 0. 7453 0. 7256 0. 7506 0. 7488 0. 7302 1. 0 0. 9541 0. 9883 0. 9954 0. 7465 0. 7361 0. 7529 0. 7459 0. 7477 0. 7581 0. 7535 0. 7395 1. 0 0. 9952 0. 9838 0. 7366 0. 7172 0. 7206 0. 7243 0. 6851 0. 7356 0. 7643 0. 7806 1. 0 0. 9607 0. 7356 0. 7850 0. 7814 0. 7739 0. 7621 0. 7639 0. 7657 0. 7897 1. 0 0. 7775 0. 7887 0. 7678 0. 7869 0. 7243 0. 7222 0. 7315 0. 7483 1. 0 0. 7962 0. 8143 0. 8009 0. 7793 0. 7917 0. 8178 0. 7814 1. 0 0. 7879 0. 8094 0. 7889 0. 7936 0. 7926 0. 8205 1. 0 0. 8084 0. 7972 0. 8000 0. 8000 0. 8065 1. 0 0. 7678 0. 7834 0. 7674 0. 7661 1. 0 0. 7710 0. 7814 0. 7714 1. 0 0. 7887 0. 7832 1. 0 0. 7822 1. 0 P- 2 P- 3 P- 4 P- 5 Y- 1 Y- 2 Y- 3 Y- 4 Y- 5 Y- 6 Y- 7 Y- 8
2. 1 RAPD 的扩增结果
试验根据对同为 1 个种的方正银鲫 RAPD 分析引 物 [ 4 ] ,选取扩增效果好的 Op j、 Opp、 Opq 组引物共 30 个进 行扩增 ,结果在 30 个引物中 ,有 26 个引物对两个鲫鱼群 体均产生了良好的扩增效果 , DNA 带纹清晰 。每个引物 扩增的条带数 2 ～17 条不等 (表 1 ) ,扩增片断大小一般在 0. 2 ～3. 0kb。图 1 显示了两个引物在两个鲫鱼群体间基 因组 DNA 扩增产物的电泳图谱 ,从图 1 中可以看到 ,彭泽 鲫个体间的电泳图谱带型比较整齐 , 而野鲫个体间的电 泳图谱带型则存在一定的差异 。 表 1 26 个引物的 DNA 序列及其扩增结果
1 材料与方法
1. 1 实验材料
彭泽鲫养殖群体取自湖南省常德市农贸市场 , 并经 严格的形态学鉴定 ,野鲫采自常德德山的池塘和沟渠 (经 调查 ,池塘和沟渠均未放养人工繁殖鲫鱼苗种 ) , 彭泽鲫 个体 120 ～160 mm , 体重 100 ～ 155g, 野鲫体长 90 ～ 120 mm ,体重 30 ～45 g。 1. 2 基因组 DNA 的提取 取新鲜或冰冻肝组织块约 50 mg (0. 3 ～0. 5 cm3 ) , 加 入组织裂解液 [ 10 mmol/L Tris - Cl (pH 8. 0) , 5 mmol/L EDTA (pH 8. 0) , 75 mmol/L NaCl, 5 g/L SDS ]和蛋白酶 K于 37 ℃ 水浴过夜 (12 ～15 h) , RNA 酶处理 ,酚 、 氯仿 /异 戊醇 (24 ∶1) 抽提 , 乙醇沉淀 , 漂洗 , 室温干燥 , 溶于适量
) 引物 序列 ( 5 ′ →3 ′ Op j1 CCCGGCATAA Op j5 CTCCATGGGG Op j7 CCTCTCGACA Op j8 CATACCGTGG Op j9 TGAGCCTCAC Op j11 ACTCCTGCGA Op j14 CACCCGGATG Op j15 TGTAGCAGGG Op j18 TGGTCGCAGA Opp7 GTCCATGCCA Opp8 ACATCGCCCA Opp10 TCCCGCCTAC
2007 年第 27 卷第 3 期 水 利 渔 业 (总第 151 期 )
・75・
的遗传相似率 S 为群体内 (间 ) 所有的两个体间遗传相似 率的平均值 。
2. 2 两个群体内与群体间的遗传相似率
2 结果与分析
收稿日期 : 2006 - 06 - 19 基金项目 : 湖南省教育厅基金项目 ( 05C714) 作者简介 : 刘良国 , 1969 年生 , 男 , 湖南津市人 , 副教授 , 研究 方向为鱼类发育生物学 。 E - mail: 994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved.
水 利 渔 业 2007 年第 27 卷第 3 期 ・74・ (总第 151 期 )
洞庭湖区两个鲫鱼群体的遗传多样性分析
刘良国 ,周 杰 ,马绪亮 ,颜佳立 ,刘光明
(湖南文理学院生命科学系 ,湖南 常德 415000 )
摘要 : 采用随机扩增多态 DNA 技术 ,对洞庭湖区两个不同的鲫鱼群体 (彭泽鲫养殖群体和野鲫群体 ) 进 行比较分析 。在使用的 30 个随机引物中有 26 个引物的扩增效果良好 ,实验结果可见 : 彭泽鲫与野鲫群体间 的遗传相似率为 0. 7505,彭泽鲫群体内的遗传相似率为 0. 9822, 野鲫群体内的遗传相似率为 0. 7910。统计 结果表明 : 彭泽鲫养殖群体与野鲫群体间的遗传差异较大 ,彭泽鲫养殖群体内的遗传多样性贫乏 ,而野鲫群 体内的遗传多样性明显高于彭泽鲫的养殖群体 ,说明野鲫种群内的遗传变异度较大 ,遗传多态性丰富 , 存在 较大的育种潜力 。 关键词 : 野鲫 ; 彭泽鲫 ; RAPD; 遗传多样性 中图分类号 : S931. 5 文献标识码 : A 文章编号 : 1003 - 1278 (2007) 03 - 0074 - 03 鲫 ( Ca rassius au ra tus) 在我国淡水渔业中占有重要地 位 ,它是很多水体 (湖泊 、 水库等 ) 中的主要经济鱼类之 一 ,也是最为普遍的淡水养殖鱼类 。它不仅以其肉质细 嫩、 味道鲜美 , 深受广大消费者和养殖户的喜爱 ; 同时由 于它分布广泛 ,各水域群体间在形态 、 体色甚至倍性上存 在差异 [ 1, 2 ] ,遗传背景复杂 , 因而在脊椎动物的遗传起源 与进化等基础研究方面 , 具有十分重要的理论价值 。随 机扩增多态 DNA ( RAPD ) 技术是 20 世纪 90 年代初发展 起来的以 PCR 为基础的分子生物学技术 [ 3 ] 。实践证明 , 只要严格控制实验条件 , RAPD 技术仍不失为一种方便 、 快速揭示物种遗传多样性的有效工具 。 为了进一步了解洞庭湖区目前野鲫种质资源的遗传 多样性状况 ,我们以养殖的彭泽鲫做对照 , 对彭泽鲫养殖 群体和野生鲫鱼群体进行了分子水平上的遗传多样性分 析 ,试图为鲫鱼优良品种的选育和遗传进化理论研究提 供基础资料 。
Op j10 AAGCCCGAGG 10 ～12
Opq10 TGTGCCCGAA 8 ～11 Opq11 TCTCCGCAAC 4 ～12 Opq13 GGAGTGGACA 3 ～7 Opq14 GGACGCTTCA 3 ～12 Opq15 GGGTAACGTG 9 ～16 Opq20 TCGCCCAGTC 10 ～12 ( P1 ～P5 示彭泽鲫养殖群体 ; Y1 ～Y8 示野鲫 )
对彭泽鲫 5 个个体和野鲫 8 个个体之间共有的扩增 片段数以及各自的 DNA 扩增片段数进行统计分析 , 两个 群体共 13 个个体间的遗传相似率见表 2, 群体内和群体 间的平均遗传相似率见表 3。从表 2、 表 3 可以看到 ,彭泽 鲫个体之间的遗传相似率均较高 ,达 0. 9541 以上 ,平均遗 传相似率为 0. 9822; 彭泽鲫与野鲫群体间的遗传相似率 在 0. 6851 ～0. 7887 之间 ,平均遗传相似率为 0. 7505; 野鲫 群体内的遗传相似率在 0. 7692 ～0. 8531 之间 , 平均遗传 相似率为 0. 8228。统计数据表明 : 彭泽鲫养殖群体与野 生鲫鱼群体遗传差异显著 , 彭泽鲫养殖群体内具有较高 的遗传同质性 ,而野生鲫鱼群体内的遗传多样性则比较 丰富 。
扩增条 带数
8 ～11 9 ～14 10 ～13 9 ～12 4 ～9 6 ～11 3 ～12 2 ～10 2 ～6 7 ～8 9 ～10 5 ～17
) 引物 序列 ( 5 ′ →3 ′
扩增条 带数
Opp11 AACGCGTCGG 5 ～9 Opp12 AAGGGCGAGT 3 ～8 Opq1 GGGACGATGG 7 ～10 Opq3 GGTCACCTCA Opq4 AGTGCGCTGA Opq8 CTCCAGCGGA Opq9 GGCATACCGA 4 ～11 4 ～14 5 ～13 5 ～10
图 1 两个鲫鱼群体由引物 Opp 10、 Opq3 扩增电泳图
表 2 两个鲫鱼群体共 13 个个体间的遗传相似率
鱼名
P- 1 P- 2 P- 3 P- 4 P- 5 Y- 1 Y- 2 Y- 3 Y- 4 Y- 5 Y- 6 Y- 7 Y- 8 P- 1 1. 0 0. 9882 0. 9907 0. 9839 0. 9818 0. 7606 0. 7601 0. 7488 0. 7453 0. 7256 0. 7506 0. 7488 0. 7302 1. 0 0. 9541 0. 9883 0. 9954 0. 7465 0. 7361 0. 7529 0. 7459 0. 7477 0. 7581 0. 7535 0. 7395 1. 0 0. 9952 0. 9838 0. 7366 0. 7172 0. 7206 0. 7243 0. 6851 0. 7356 0. 7643 0. 7806 1. 0 0. 9607 0. 7356 0. 7850 0. 7814 0. 7739 0. 7621 0. 7639 0. 7657 0. 7897 1. 0 0. 7775 0. 7887 0. 7678 0. 7869 0. 7243 0. 7222 0. 7315 0. 7483 1. 0 0. 7962 0. 8143 0. 8009 0. 7793 0. 7917 0. 8178 0. 7814 1. 0 0. 7879 0. 8094 0. 7889 0. 7936 0. 7926 0. 8205 1. 0 0. 8084 0. 7972 0. 8000 0. 8000 0. 8065 1. 0 0. 7678 0. 7834 0. 7674 0. 7661 1. 0 0. 7710 0. 7814 0. 7714 1. 0 0. 7887 0. 7832 1. 0 0. 7822 1. 0 P- 2 P- 3 P- 4 P- 5 Y- 1 Y- 2 Y- 3 Y- 4 Y- 5 Y- 6 Y- 7 Y- 8
2. 1 RAPD 的扩增结果
试验根据对同为 1 个种的方正银鲫 RAPD 分析引 物 [ 4 ] ,选取扩增效果好的 Op j、 Opp、 Opq 组引物共 30 个进 行扩增 ,结果在 30 个引物中 ,有 26 个引物对两个鲫鱼群 体均产生了良好的扩增效果 , DNA 带纹清晰 。每个引物 扩增的条带数 2 ～17 条不等 (表 1 ) ,扩增片断大小一般在 0. 2 ～3. 0kb。图 1 显示了两个引物在两个鲫鱼群体间基 因组 DNA 扩增产物的电泳图谱 ,从图 1 中可以看到 ,彭泽 鲫个体间的电泳图谱带型比较整齐 , 而野鲫个体间的电 泳图谱带型则存在一定的差异 。 表 1 26 个引物的 DNA 序列及其扩增结果
1 材料与方法
1. 1 实验材料
彭泽鲫养殖群体取自湖南省常德市农贸市场 , 并经 严格的形态学鉴定 ,野鲫采自常德德山的池塘和沟渠 (经 调查 ,池塘和沟渠均未放养人工繁殖鲫鱼苗种 ) , 彭泽鲫 个体 120 ～160 mm , 体重 100 ～ 155g, 野鲫体长 90 ～ 120 mm ,体重 30 ～45 g。 1. 2 基因组 DNA 的提取 取新鲜或冰冻肝组织块约 50 mg (0. 3 ～0. 5 cm3 ) , 加 入组织裂解液 [ 10 mmol/L Tris - Cl (pH 8. 0) , 5 mmol/L EDTA (pH 8. 0) , 75 mmol/L NaCl, 5 g/L SDS ]和蛋白酶 K于 37 ℃ 水浴过夜 (12 ～15 h) , RNA 酶处理 ,酚 、 氯仿 /异 戊醇 (24 ∶1) 抽提 , 乙醇沉淀 , 漂洗 , 室温干燥 , 溶于适量
) 引物 序列 ( 5 ′ →3 ′ Op j1 CCCGGCATAA Op j5 CTCCATGGGG Op j7 CCTCTCGACA Op j8 CATACCGTGG Op j9 TGAGCCTCAC Op j11 ACTCCTGCGA Op j14 CACCCGGATG Op j15 TGTAGCAGGG Op j18 TGGTCGCAGA Opp7 GTCCATGCCA Opp8 ACATCGCCCA Opp10 TCCCGCCTAC
2007 年第 27 卷第 3 期 水 利 渔 业 (总第 151 期 )
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的遗传相似率 S 为群体内 (间 ) 所有的两个体间遗传相似 率的平均值 。
2. 2 两个群体内与群体间的遗传相似率
2 结果与分析
收稿日期 : 2006 - 06 - 19 基金项目 : 湖南省教育厅基金项目 ( 05C714) 作者简介 : 刘良国 , 1969 年生 , 男 , 湖南津市人 , 副教授 , 研究 方向为鱼类发育生物学 。 E - mail: 994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved.
水 利 渔 业 2007 年第 27 卷第 3 期 ・74・ (总第 151 期 )
洞庭湖区两个鲫鱼群体的遗传多样性分析
刘良国 ,周 杰 ,马绪亮 ,颜佳立 ,刘光明
(湖南文理学院生命科学系 ,湖南 常德 415000 )
摘要 : 采用随机扩增多态 DNA 技术 ,对洞庭湖区两个不同的鲫鱼群体 (彭泽鲫养殖群体和野鲫群体 ) 进 行比较分析 。在使用的 30 个随机引物中有 26 个引物的扩增效果良好 ,实验结果可见 : 彭泽鲫与野鲫群体间 的遗传相似率为 0. 7505,彭泽鲫群体内的遗传相似率为 0. 9822, 野鲫群体内的遗传相似率为 0. 7910。统计 结果表明 : 彭泽鲫养殖群体与野鲫群体间的遗传差异较大 ,彭泽鲫养殖群体内的遗传多样性贫乏 ,而野鲫群 体内的遗传多样性明显高于彭泽鲫的养殖群体 ,说明野鲫种群内的遗传变异度较大 ,遗传多态性丰富 , 存在 较大的育种潜力 。 关键词 : 野鲫 ; 彭泽鲫 ; RAPD; 遗传多样性 中图分类号 : S931. 5 文献标识码 : A 文章编号 : 1003 - 1278 (2007) 03 - 0074 - 03 鲫 ( Ca rassius au ra tus) 在我国淡水渔业中占有重要地 位 ,它是很多水体 (湖泊 、 水库等 ) 中的主要经济鱼类之 一 ,也是最为普遍的淡水养殖鱼类 。它不仅以其肉质细 嫩、 味道鲜美 , 深受广大消费者和养殖户的喜爱 ; 同时由 于它分布广泛 ,各水域群体间在形态 、 体色甚至倍性上存 在差异 [ 1, 2 ] ,遗传背景复杂 , 因而在脊椎动物的遗传起源 与进化等基础研究方面 , 具有十分重要的理论价值 。随 机扩增多态 DNA ( RAPD ) 技术是 20 世纪 90 年代初发展 起来的以 PCR 为基础的分子生物学技术 [ 3 ] 。实践证明 , 只要严格控制实验条件 , RAPD 技术仍不失为一种方便 、 快速揭示物种遗传多样性的有效工具 。 为了进一步了解洞庭湖区目前野鲫种质资源的遗传 多样性状况 ,我们以养殖的彭泽鲫做对照 , 对彭泽鲫养殖 群体和野生鲫鱼群体进行了分子水平上的遗传多样性分 析 ,试图为鲫鱼优良品种的选育和遗传进化理论研究提 供基础资料 。
Op j10 AAGCCCGAGG 10 ～12
Opq10 TGTGCCCGAA 8 ～11 Opq11 TCTCCGCAAC 4 ～12 Opq13 GGAGTGGACA 3 ～7 Opq14 GGACGCTTCA 3 ～12 Opq15 GGGTAACGTG 9 ～16 Opq20 TCGCCCAGTC 10 ～12 ( P1 ～P5 示彭泽鲫养殖群体 ; Y1 ～Y8 示野鲫 )
对彭泽鲫 5 个个体和野鲫 8 个个体之间共有的扩增 片段数以及各自的 DNA 扩增片段数进行统计分析 , 两个 群体共 13 个个体间的遗传相似率见表 2, 群体内和群体 间的平均遗传相似率见表 3。从表 2、 表 3 可以看到 ,彭泽 鲫个体之间的遗传相似率均较高 ,达 0. 9541 以上 ,平均遗 传相似率为 0. 9822; 彭泽鲫与野鲫群体间的遗传相似率 在 0. 6851 ～0. 7887 之间 ,平均遗传相似率为 0. 7505; 野鲫 群体内的遗传相似率在 0. 7692 ～0. 8531 之间 , 平均遗传 相似率为 0. 8228。统计数据表明 : 彭泽鲫养殖群体与野 生鲫鱼群体遗传差异显著 , 彭泽鲫养殖群体内具有较高 的遗传同质性 ,而野生鲫鱼群体内的遗传多样性则比较 丰富 。
扩增条 带数
8 ～11 9 ～14 10 ～13 9 ～12 4 ～9 6 ～11 3 ～12 2 ～10 2 ～6 7 ～8 9 ～10 5 ～17
) 引物 序列 ( 5 ′ →3 ′
扩增条 带数
Opp11 AACGCGTCGG 5 ～9 Opp12 AAGGGCGAGT 3 ～8 Opq1 GGGACGATGG 7 ～10 Opq3 GGTCACCTCA Opq4 AGTGCGCTGA Opq8 CTCCAGCGGA Opq9 GGCATACCGA 4 ～11 4 ～14 5 ～13 5 ～10