理性和非理性蛋白质设计策略在酶工程中应用

表 １ 酶工程中常用的定向进化方法 Ｔａｂｌｅ １ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｕｓｕａｌｌｙ ｕｓｅｄ ｉｎ ｅｎｚｙｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
定向进化方法 易错 ＰＣＲ（ｅｒｒｏｒ－ｐｒｏｎｅ ＰＣＲ， ｅｐ－ＰＣＲ） 致突变菌株产生随机突变（ ｒａｎｄｏｍ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｂｙ ｍｕｔａｔｏｒ ｓｔｒａｉｎ） ＤＮＡ 改组（ＤＮＡ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ） ＤＮＡ 同源改组（ＤＮＡ ｆａｍｉｌｙ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ） 外显子改组（ｅｘｏｎ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ） 体外随机引发重组（ ｒａｎｄｏｍ－ｐｒｉｍｉｎｇ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ， ＲＰＲ） 交错延伸（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ， ＳｔＥＰ） 过渡模板随机嵌合生长（ｒａｎｄｏｍ ｃｈｉｍｅｒａｇｅｎｅｓｉｓ ｏｎ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｔｅｍｐｌａｒｉｅｓ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｂｙ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ ｙｅａｓｔ， ＣＬＥＲＹ） 渐增切割法产生杂和酶（ｉｎｃｒｅｍｅｎｔａｌ ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃｒｅａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄ ｅｎｚｙｍｅｓ， ＩＴＣＨＹ） 不依赖序列同源性的蛋白质重组（ｓｑｕｅｎｃｅ ｈｏｍｏｌｏｇｙ－ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ， ＳＨＩＰＲＥＣ） ＳＣＲＡＴＣＨ 技术 合成改组（ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ） 简并同质双链重组（ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ｈｏｍｏｄｕｐｌｅｘ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ， ＤＨＲ） 短片断上的重组延伸（ ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｄ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｏｎ ｔｒｕｎｃａｔｅｄ ｔｅｍｐｌａｔｅｓ ， ＲＥＴＴ ） 以寡核苷酸为基础的随机化过程 （ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ ＭＡＸ ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ） 密码子改组（ｃｏｄｏｎ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ） 序列饱和突变（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ， ＳｅＳａＭ） 设计的寡核苷酸的装配（ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ， ＡＤＯ） 依赖重组的指数扩增 ＰＣＲ（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ＰＣＲ， ＲＤＡ－ＰＣＲ） 突变和单一方向的装配（ｍｕｔａｇｅｎｉｃ ａｎｄ ｕｎｉｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ｒｅａｓｓｅｍｂｌｙ， ＭＵＲＡ） 不依赖序列的定点装配（ｓｅｑｕｅｎｃｅ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｃｈｉｍｅｒａｇｅｎｅｓｉｓ， ＳＩＳＤＣ ） 以结构为基础的重组蛋白工程（ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ｂａｓｅｄ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， ＳＣＯＰＥ）） 提高交叉的 ＳＣＲＡＴＣＨ 技术（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｒｏｓｓｏｖｅｒ ＳＣＲＡＴＣＨＹ）
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科技通报
第 ２３ 卷
功能和机制等详细资料对氨基酸序列中要突变 的位点进行精确设计， 然后 通过取 代、插入 或缺 失等手段改变蛋白质分子中特定的氨基酸。从而 鉴定出与酶特性相关的关键残基和结构元件。理 性设计的方法有寡核苷酸介导的重组 ＰＣＲ， 限制 性内切酶酶切片段取代法， 盒式突变法和化学合 成法［１］。与使用化学因素、自然因素导致突变的方 法 相 比 ， 定 点 突 变 具 有 突 变 率 高 、简 单 易 行 、重 复 性好的特点。这一技术在优化酶特性方面占有重 要地位。近几年已利用定点突变技术对天然酶蛋 白 的 催 化 活 性［２－ ３］、底 物 特 异 性［４－ ６］、稳 定 性［７］、改 变 抑 制 剂 类 型［８］、辅 酶 特 异 性［９］、提 高 表 达 量［１０－ １１］、进 化新的代谢途径［１２］等方面进行了成功的改造。
通过理性的设计增加了我们对酶结合和催 化机制的理解， 对以后的酶工程改造和对数据库 中新的蛋白质序列的功能预测奠定了基础， 增加
了酶工程改造成功的机会。尽管有很多酶改造成 功的例子， 也有很多对酶进行改造的努力以失败 而告终［１３］， 这些失败可能是因为对要改造的酶性 质的内在机制缺乏理解， 有很多失败例子都是将 氨基酸序列同源作为氨基酸替换的唯一标准， 忽 视了蛋白质的结构特性， 这样做的结果是导致替 换的氨基酸不但对要改变的酶特性无影响， 而且 常常因氨基酸改变导致酶构像的改变而使酶钝 化。
关键词： 理性蛋白质设计； 非理性蛋白质设计； 酶工程； 蛋白质工程
中图分类号： Ｑ８１４
文献标识码： Ａ
文章编号： １００１－ ７１１９（ ２００７） ０２－ ０１９１－ ０７
Ｕｓｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｒａｔｉｏｎａｌ ａｎｄ Ｉｒ ｒ ａｔｉｏｎａｌ Ｐｒ ｏｔｅｉｎ Ｄｅｓｉｇｎ Ｓｔｒ ａｔｅｇｉｅｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒ ｉｎｇ
第 ２３ 卷 第 ２ 期 ２００７ 年 ３ 月
科技通报
ＢＵＬＬＥＴＩＮ ＯＦ ＳＣＩＥＮＣＥ ＡＮＤ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ
Ｖｏｌ．２３ Ｎｏ．２ Ｍａｒ． ２００７
理性和非理性蛋白质设计策略在酶工程中应用
张秀艳 １， 何国庆 ２， 陈启和 ２
（ １． 华中农业大学食品安全与微生物学系， 武汉 ４３００７０； ２． 浙江大学食品科学与营养系， 杭州 ３１００２９）
Ｋｅｙ ｗｏｒ ｄｓ： ｒａｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｓｉｇｎ； ｉｒｒａｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｓｉｇｎｓ； ｅｎｚｙｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ； ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
酶在工业上的应用已有很久的历史， 生物催 化 剂 所 表 现 出 的 高 效 、专 一 的 催 化 活 性 使 它 远 远 优于化学催化剂， 特别是近几年， 随着基因操作 技术的发展， 使得酶能以合理的价格得到供应， 酶在工业上得到越来越广泛的应用。然而， 天然 酶的性能往往不能满足工业生产的实际需要。为 了得到能满足实际生产所需要的酶， 科学家们常 常通过计算机辅助分子模型结合定点突变或直
模型， 可以预测怎样增加酶的选择性， 活性和稳 定性。即使没有结构信息的情况下， 同源酶的结 构也可以作为模型。因此， 理性的设计方法虽然 需 要 大 量 有 关 酶 的 结 构 、功 能 和 机 制 等 方 面 的 信 息， 依然受到科学家的青睐。 １．２ 非理性蛋白质设计特点及应用
非理性蛋白质设计技术是在不了解有关酶 结构与功能之间的关系等信息的情况下通过对 酶基因的随机突变和基因片段的重组来创造突 变库， 然后通过高通量的筛选手段鉴定性能改善 的突变体， 挑出的有益突变基因可以作为下一轮 突变的模板， 进行多轮突变和筛选， 以进一步提 高酶的性能。最近二十年， 特别是近几年， 科学家 们不断探索出许多种定向进化的手段， 具体见表 １。这些定向进化方法的建立， 可以快速积累有益 突变， 从很小的同源基因库中产生序列的多样 性。在改善酶的性能和进化新的代谢途径等方面 具有极其重要的价值。但任何一种方法都不是万 能的， 都有其优点和缺点。在实际工作中， 要针对 具体问题， 选择合适的方法或几种方法组合， 快 速实现酶分子的进化。
随着通过酶动力学来鉴定有益突变体策略 的建立， 克服了传统的理性设计要求每轮都对突 变体进行测序、纯化和酶特性的测定等缺点， 使 需要多轮突变对酶进行改性的理性设计方法成 为可能。同时， 随着核磁共振光谱预测蛋白质结 构的发展和公共序列数据库储存越来越多的数 据， 使了解序列数据和结构更为方便。应用分子
t12由61提高到7340半乳糖苷氧化酶底物特异性饱和突变突变体可以d葡萄糖为底物41塔格糖16二磷酸盐醛缩酶立体选择性dna改组碳碳键形成中立体选择性倒置形成d果糖16二磷酸盐而不是d塔格糖16二磷酸盐42n乙酰神经胺酸醛缩酶立体选择性易错pcrdna改组饱和突变底物可以由n乙酰d甘露糖转变为n乙酰l甘露糖和l阿拉伯糖43一元胺氧化酶对应选择性随机突变e值有6倍增长到达19944脂酶对应选择性易错pcr饱和突变对应选择性从ee38到ee5645酯酶对应选择性随机突变e12提高到e1946环氧化物水解酶对应选择性随机突变e46提高到e10847腈水解酶对应选择性饱和突变ee878到ee98148酯酶热稳定性易错pcr交错延伸pcrtopt提高了549脂酶热稳定性易错pcr55下的半寿期提高300倍50理性和非理性蛋白质设计策略在酶工程中应用193科技通报第23卷并进行定点突变然后将突变的基因引入宿主菌进行蛋白质表达纯化和性质分析以获得性能理想的突变体酶
参考文献 ［１４］ ［１５］ ［１６］ ［１７］ ［１８］ ［１９］ ［２０］ ［２１］ ［２２］ ［２３］ ［２４］ ［２５］ ［２６］ ［２７］ ［２８］ ［２９］ ［３０］ ［３１］ ［３２］ ［３３］ ［３４］ ［３５］ ［３６］ ［３７］
第２期
理性和非理性蛋白质设计策略在酶工程中应用
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摘 要： 理性和非理性的蛋白质设计策略是两个非常有效的酶改性工具。在对酶性质改造方面已取得 了 可 喜 的 成 绩 。本 文 将 两 种 蛋 白 质 设 计 策 略 的 特 点 、各 自 使 用 的 方 法 、进 化 路 线 及 最 近 三 年 在 酶 工 程 改 造 上 取 得 的 成 就 加 以 总 结 。 并 讨 论 了 两 种 蛋 白 质 设 计 策 略 的 区 别 、联 系 及 蛋 白 质 工 程 改 造 的 未 来 发 展 方向。
ＺＨＡＮＧ Ｘｉｕ－ｙａｎ１， ＨＥ Ｇｕｏ－ｑｉｎｇ２， ＣＨＥＮ Ｑｉ－ｈｅ２
（ １． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓａｆｅｔｙ ａｎｄ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， Ｈｕａｚｈｏｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｗｕｈａｎ ４３００７０， Ｃｈｉｎａ； ２． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ， Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｈａｎｇｚｈｏｕ ３１００２９， Ｃｈｉｎａ）
短短几年， 定向进化在提高酶在非天然环境 中 的 催 化 活 性 、热 稳 定 性 、非 天 然 底 物 的 特 异 性 、 对 映 选 择 性 、进 化 新 的 代 谢 途 径 及 提 高 蛋 白 质 表
达水平等方面都有成功报导。表 ２ 为最近三年用 定向进化手段对酶进行成功改造的实例。
尽管这些技术在改善酶催化活性和物理性 质上较为成功， 但在改进酶的底物特异性上则具 有挑战性。因为体外进化中， 酶特性改变主要是 通过点突变来完成， 这种点突变偏向于碱基转换 而非颠换， 因此限制了较大范围的碱基替换， 而 酶家族的进化分析显示， 酶功能要有大的变化必 须要求多肽链骨架要有大的改变， 这样的变化不 可能通过体外进化过程来完成。相对来说， 自然 突变来源于有性或同源重组， 主要产生缺失、插 入、复制或融合， 这样的 突变可 以改变 氨基酸 残 基和多肽链之间所形成的空间， 从而使酶的特异 性和催化活性发生较大改变。因此， 定向进化存 在的一个挑战性任务就是模拟自然进化过程， 将 自然进化机制引入定向进化中。定向进化的另一 个限制是需要一个从突变库中灵敏而有效地筛 选出突变体的方法。因此， 建立高通量的筛选方 法是实验成功的关键。
Ａｂｓｔｒ ａｃｔ： Ｒａｔｉｏｎａｌ ａｎｄ ｉｒｒａｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｓｉｇｎ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ａｒｅ ｔｗｏ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ． Ｔｈｅ ｔｗｏ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｈａｖｅ ｍａｄｅ ａ ｇｒｅａｔ ｓｕｃｃｅｓｓ． Ｔｈｉｓ ａｒｔｉｃｌｅ ｓｕｍｍａｒｉｚｅｄ ｔｈｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ， ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ａｐｐｒｏａｃｈ， ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｒｏｕｔｉｎｅｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ ｅｘａｍｐｌｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｔｗｏ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ． Ａｄｄｉｔｉｏｎｔｕｒｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｔｗｏ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｗｅｒｅ ｄｉｓｃｕｓｓｅｄ．
接采用定向进化技术对酶进行改造。前者属于理 性的设计方法， 后者属于非理性的设计方法。
１ 理性和非理性蛋白质设计策略特 点及应用
１．１ 理性蛋白质设计的特点及应用 在理性设计中， 首先要根据蛋白质的结构，
收稿日期： ２００５－ １１－ ０７ 基金项目： 国家自然科学基金（ ２０２７６０６４） 资助 作者简介： 张秀艳（ １９７３－ ） ， 女， 河南南阳人， 讲师， 主要从事食品微生物和分子生物学研究。Ｅ－ｍａｉｌ： ｘｉｕｙａｎｚｈａｎｇ７３＠１２６．ｃｏｍ．